专利名称：一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法
技术领域：
本发明涉及一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，特别涉及一种克服H. 11648麻再生体系建立过程中不定芽玻璃化的方法。
背景技术：
剑麻为我国热区的特色纤维作物，主要分布在广东、广西、福建、海南和云南等地，近几十年，剑麻育种工作者不断从国外引进一些新的种质资源，也先后开展了剑麻杂交育种工作，并且获得了一些优良种质，但剑麻种质资源严重缺乏的现象仍然存在。目前我国唯一当家品种H. 11648，种植面积达98%以上。由于该品种抗真菌能力较差，病虫害不断滋生，严重影响了剑麻的高产稳产。并且剑麻生命周期长，一生仅开一次花，杂交育种时间长、效率低，因此利用生物技术开展剑麻遗传改良和种质创新尤为重要。
国内外对剑麻的组织培养做了一定的探索，已成功的建立了亚洲马盖麻(Acan tala Robx)、灰叶剑麻(A fourcroydes Lem)、普通剑麻(A si sal ana Perrine)、蓝剑麻(A tequilana Weber cultivar azul)> A. parrasana Berger、A. tequilana、A.eras si spina > A. duranguensi sA. vera-cruz Mill·、A. atrovirens、A.和Agave si sal ana Perrine ex 等体外再生体系并获得了完整的再生植株,中国热带农业科学院南亚热带作物研究所也开展了 H. 11648麻的再生体系研究，获得了一定数量的再生植株，但均存在一定程度的玻璃化现象，最高时玻璃化比例达100%，玻璃化的植株形态异常，无法正常生长，并且组培苗玻璃化问题已成为植物组织培养过程中的瓶颈。因此，解决剑麻组培苗玻璃化问题，建立稳定高效的再生体系对开展剑麻生物技术育种有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法。为实现上述目的本发明所采用的技术方案是
一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，包括如下步骤
通过将愈伤组织直接接种在SZ培养基上来诱导不定芽发生，所述的SZ培养基包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、鹿糖、卡拉胶以及激素等八个组分，大量元素及其含量分别为硝酸钾2267mg/L,磷酸二氢钾400mg/L,硫酸氨150mg/L, 二水氯化|丐400 mg/L,七水硫酸镁400 mg/L ；
铁盐及其含量为七水硫酸铁27. 8mg/L,乙二胺四乙酸二钠37. 3mg/L ；
微量元素及其含量分别分为一水硫酸锰10mg/L，七水硫酸锌5mg/L，硼酸5mg/L，碘化钾lmg/L, 二水钥酸钠O. lmg/L,五水硫酸铜O. 2mg/L,六水氯化钴O. lmg/L;
有机成分及其含量分别为盐酸硫胺素O. 8 mg/L，盐酸吡哆醇I. O mg/L，烟酸I. Omg/L,肌醇200 mg/L,甘氨酸3mg/L。
培养基的鹿糖30000mg/L,卡拉胶8000mg/L。培养基的激素为6-苄氨基嘌呤3. Omg/L，3-吲哚丁酸O. lmg/L, α -萘乙酸O. Img/L0所述的SZ培养基的pH值为5. 8。本发明的优点在于
本发明通过调节培养基的有效组分来克服剑麻不定芽玻璃化的现象，该方法操作步骤简单易行，效果非常显著，不仅降低了生产成本，同时也为解决剑麻不定芽玻璃化问题提供有效途径，为剑麻再生体系建立和遗传转化等研究奠定了基础。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例中的MS、SH及SZ培养基成分及含量见附件2，实施例中的6-BA为6-苄氨基嘌呤，NAA为a-萘乙酸，IBA为3-吲哚丁酸，除特别说明外，所有实施例中蔗糖、卡拉胶、PH值、光照时间及强度、温度、湿度等均相同。实施例I
2010 年 6 月，分别在 MS+6-BA3. Omg/L + NAAO. 2mg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L + NAA O. 2mg/L培养基上接种30个H. 11648麻愈伤团块，培养条件为光照12h，黑暗12h，光照强度为2000Lx，温度26°C ±2°C，湿度相对60%。2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率分别为88. 3%和89. 2%,不定芽玻璃化比率分别为94. 8%和88. 5%。实施例2
2010年7月，将培养容器的塑料瓶盖改为透气性好的封口膜，分别在MS+6-BA3. Omg/L+ NAAO. 2mg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L + NAA O. 2mg/L 培养基上接种 30 个 H. 11648 麻愈伤团块，2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率分别为74. 4%和83. 3%，不定芽玻璃化比率分别为68. 9%和62. 8%
实施例3
2010年7月至9月，以SH为基本培养基，采用完全组合方式对NAA(0. I mg/L, O. 5 mg/L, I. O mg/L)、IBA (O. I mg/L,O. 5 mg/L, I. 0 mg/L)和 6-BA (I mg/L, 3mg/L, 5mg/L)的浓度及组合进行优化，其它培养条件不变。2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率在34. 3-100. 0%之间，不定芽玻璃化比率在52. 8%至100%之间，其中6-BA3. Omg/L,NAAO. Img/L、IBAO. lmg/L组合玻璃化比率均优于其它激素组合，愈伤组织不定芽诱导率为100. 0%，玻璃化比率为52. 8%。实施例4
2010 年 10 月至 2011 年 3 月，在 SZ+6-BA3. Omg/L+NAAO. lmg/L+IBAO. lmg/L 培养基上接种1，350块愈伤组织，塑料瓶盖，其它培养条件不变，2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率为90. 3%，不定芽玻璃化比率为8. 2%。实施例5
2011 年 3 月 17 号，在 SZ +6-BA3. Omg/L + NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L,MS+6-BA3. Omg/L + NAA 0. lmg/L + IBAO. lmg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L + NAA 0. lmg/L + IBAO. lmg/L 培养基上分别接种40个H. 11648麻愈伤组织团块，培养条件不变。2个月后统计试验结果，三种培养基愈伤组织不定芽诱导率分别为90. 6%,93. 2%和88. 9%，但诱导的不定芽玻璃化比率相差较大，其中以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为3. 1%，以MS为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为87. 5%，以SH为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为42. 5%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化率比MS培养基低84. 4%，比SH基本培养基低39. 4%。实施例6
2011年4月19号，在相同培养条件下，分别在SZ +6-BA3. Omg/L + NAAO. lmg/L+ IBAO. lmg/L、MS+6-BA3. Omg/L + NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L +NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L的培养基上接种141、125、131个Η. 11648麻愈伤组织团块，2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率均为100%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为3. 6%，以MS为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为89. 3%，以SH为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为41. 2%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率比MS和SH基本培养基分别低85. 7%和37. 6%。
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实施例7
2011年5月20号，在相同培养条件下，分别在SZ +6-ΒΑ3. 0mg/L + NAAO. Img/L + IBAO. lmg/L、MS+6-BA3. 0mg/L + NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L +NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L的培养基上接种225、170、146个H. 11648麻愈伤组织团块，2个月后统计试验结果，愈伤组织不定芽诱导率92. 3%、81. 8%和93. 5%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为3. 03%,以MS为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为81. 5%，以SH为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率为44. 1%，以SZ为基本培养基获得的不定芽玻璃化比率比MS和SH基本培养基分别低78. 47%和41. 07%
实施例8
从2011年12月至2012年5月，共接种H. 11648麻愈伤组织I，680块于SZ +6-BA3. Omg/L + NAA 0. lmg/L + IBAO. lmg/L培养基上，获得了 24，024株再生植株，其中玻璃化的植株有187株，玻璃化比例为7. 8%。附件I具体实施例
权利要求
1.一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，其特征在于包括如下步骤 将淡黄绿色的剑麻愈伤组织直接接种在SZ培养基上诱导不定芽，所述的SZ培养基组成为硝酸钾2267mg/L，磷酸二氢钾400 mg/L，硫酸铵150mg/L，二水氯化钙400 mg/L，七水硫酸镁400 mg/L, 一水硫酸猛10mg/L,七水硫酸锌5mg/L,硼酸5mg/L,碘化钾lmg/L, 二水钥酸钠O. lmg/L,五水硫酸铜O. 2mg/L,六水氯化钴O. lmg/L,七水硫酸铁27. 8mg/L,乙二胺四乙酸二钠37. 3mg/L,盐酸硫胺素O. 8 mg/L,盐酸比多醇I. O mg/L,烟酸I. Omg/L,肌醇200 mg/L,甘氨酸 3mg/L,鹿糖 30000mg/L,卡拉胶 8000mg/L, pH5. 8,6-节氨基嘌呤 3. Omg/L, 3- Π引哚丁酸 O. lmg/L, α -萘乙酸 O. lmg/L。
2.根据权利要求I所述的一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，其特征在于所述的SZ培养基的pH值为5.8。
全文摘要
本发明涉及一种克服剑麻不定芽玻璃化的方法，是通过将愈伤组织直接接种在SZ培养基上诱导不定芽；SZ培养基的组分为硝酸钾2267mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，硫酸铵150mg/L，二水氯化钙400mg/L，七水硫酸镁400mg/L，一水硫酸锰10mg/L，七水硫酸锌5mg/L，硼酸5mg/L，碘化钾1mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，六水氯化钴0.1mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，盐酸比多醇1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，肌醇200mg/L，甘氨酸3mg/L，蔗糖30000mg/L，卡拉胶8000mg/L，pH5.8，6-苄氨基嘌呤3.0mg/L，3-吲哚丁酸0.1mg/L，α-萘乙酸0.1mg/L；用SZ培养基进行H.11648麻愈伤组织不定芽诱导，愈伤组织分化率在90%以上，愈伤组织诱导的不定芽玻璃化比率在8%以下，即该方法可明显克服剑麻不定芽玻璃化的发生。
文档编号A01H4/00GK102835312SQ20121029386
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者张燕梅, 周文钊, 戴梅莲, 李俊峰, 陆军迎, 林映雪 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所