一种转基因海岛棉培育方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种转基因海岛棉培育方法，包括以下步骤：1）制备无菌苗；2）培养初生胚性愈伤组织；3）制备农杆菌侵染液；4）初生胚性愈伤组织与带有植物表达载体的农杆菌菌液共培养；5）筛选抗性初生胚性愈伤组织；6）分化抗性初生胚性愈伤组织，直至获得完整转基因植株。本发明所述转基因海岛棉培育方法，含有植物双元表达载体pBI121的农杆菌GV3101侵染能力强，外源基因转化效率高；本发明所用愈伤组织诱导培养基MS1愈伤组织诱导率可达95%，愈伤组织分化培养基MS2、抗性愈伤分化培养基和成苗培养基等经验证均为最适合海岛棉的培养基，大大提高了转基因海岛棉再生效率。
【专利说明】一种转基因海岛棉培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种转基因海岛棉培育方法。
【背景技术】
[0002]新疆是中国的海岛棉(又称长绒棉)生产基地，已有七十多年的种植历史了。目前，海岛棉主要种植在新疆的南部，例如阿克苏地区、喀什、吐鲁番等地，90%以上的面积都集中在阿克苏地区，特别是新疆生产建设兵团农一师，2000年以来种植海岛棉30-40公顷。海岛棉是纺织工业的重要原料，经济价值很高，其优良纤维品质提高了我国棉花产业的竞争力。在各类棉种中，以海岛棉的纤维品质最好，其绒长、细度、强力、伸张力和其他特性都优于其他棉种。但是，近年来海岛棉的种植面积不断减少，据统计这两年全疆种植面积下降了50%。种植面积减少的原因主要有海岛棉的蕾铃脱落严重、单产产量下降；生育期长、不耐干旱等抵御自然危害的能力差。在新疆棉花育种进展快速发展的同时纤维品质、抗逆性等综合性状没有得到有效提高，现阶段解决棉花的纤维品质及抗逆能力成为棉花育种者的育种目标。海岛棉是新疆的支柱产业之一，每年环境因素给新疆海岛棉生产带来严重损失，造成海岛棉品质下降、产量降低，使它在国际市场中竞争力下降，因而培育海岛棉抗逆品种已成为发展海岛棉生产的重要课题之一。
[0003]虽然棉花的体细胞胚胎的获得已取得了可喜的进展，不同类型的转基因棉花新品种也已在生产中得到了应用，但目前棉花遗传转化效率总体偏低，基因型限制也是棉花转基因过程中的一个重要难题，在主要种植的四个种中棉花体细胞胚胎发生和植株再生能力依次是陆地棉、亚洲棉、海岛棉和非洲棉。体细胞胚胎发生对基因型的高度依赖性、转化研究也多处于实验室状态，规模小、数量有限，很难为育种实践提供充分的、选择余地大的、多类型转基因棉花材料，使农 杆菌介导法无法在海岛棉的遗传转化中得到充分运用，严重制约了海岛棉转基因技术的发展。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种转基因海岛棉培育方法。
[0005]一种转基因海岛棉培育方法，包括以下步骤:
[0006]I)制备无菌苗；
[0007]2)培养初生胚性愈伤组织；
[0008]3)制备农杆菌侵染液；
[0009]4)初生胚性愈伤组织与带有植物表达载体的农杆菌菌液共培养；
[0010]5)筛选抗性初生胚性愈伤组织；
[0011]6)分化抗性初生胚性愈伤组织，直至获得完整转基因植株。
[0012]所述步骤I)具体为:棉花种子用硫酸脱绒后，酒精消毒处理30s，30%H202浸泡4h后于超净工作台内用无菌水冲洗4-5遍，28°C浸泡直至种子露白，接种于I / 2MS中，28°C下前3d暗培养，后3d光照16h，暗培养8h小时交替培养获得无菌苗。[0013]所述步骤2)具体为:取步骤I)获得的无菌苗下胚轴中间段，将下胚轴切成
0.5-0.8cm小段，培养于愈伤组织诱导培养基MSl中，每20-25天继代I次，直至愈伤组织增殖至直径达到1.5-2cm，去除下胚轴培养在愈伤组织分化培养基MS2中，每15-18天继代培养一次，在愈伤组织块边缘分化出初生胚性愈伤组织。
[0014]所述步骤3)具体为:培养含有植物表达载体的农杆菌，制备农杆菌侵染液，农杆菌浓度为OD等于0.5。
[0015]所述步骤4)具体为:将步骤2)获得的初生胚性愈伤组织，置于步骤3)获得的农杆菌侵染液中，浸泡15min后将初生胚性愈伤组织用无菌水清洗三遍，将其滤出，用无菌滤纸吸干表面的菌液；然后放到共培养培养基上，于28°C培养箱中共培养24h。
[0016]所述步骤6)具体为:将步骤5)获得的抗性初生胚性愈伤组织接转到铺垫无菌滤纸的抗性愈伤分化培养基中，每18天继代一次，每次继代时挑选成熟体胚或植株，将形态建成完整的正常植株转入成苗培养基中，直至获得完整植株。
[0017]所述愈伤组织诱导培养基MSl成分是MSB为基本培养基，附加0.1mg ? 1^2，4-D、
0.1mg ? L^1KT, PH=5.8。
[0018]所述愈伤组织分化培养基MS2成分是MSB为基本培养基，附加1.9g ? L^1KNO3,PH=5.8。
[0019]所述共培养培养基成分是MSB为基本培养基，附加1.9g ? LlNO3, pH 5.8。
[0020]所述抗性愈伤分化培养基成分是MSB为基本培养基，附加3.8g -T1KNO3^0.1g -T1天冬酰铵、0.1g ? I/1 谷氨`酰铵、0.05mg ? L-1IBA, pH 5.8。
[0021]本发明所述转基因海岛棉培育方法，含有植物双元表达载体pBI121的农杆菌GV3101侵染能力强，外源基因转化效率高；本发明所用愈伤组织诱导培养基MSl愈伤组织诱导率可达95%，愈伤组织分化培养基MS2、抗性愈伤分化培养基和成苗培养基等经验证均为最适合海岛棉的培养基，大大提高了转基因海岛棉再生效率。对海岛棉产业发展具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1转NAC6基因海岛棉植株PCR检测结果图，M:DL2000分子时标准；1:NAC6质粒阳性对照；2-7:转化植株；
[0023]图2PEG6000处理后转基因棉花和非转基因棉花的SOD含量随时间变化曲线；
[0024]图3PEG6000处理后转基因棉花和非转基因棉花的POD含量随时间变化曲线；
[0025]图4PEG6000处理后转基因棉花和非转基因棉花的CAT含量随时间变化曲线；
[0026]图5PEG6000处理后转基因棉花和非转基因棉花的脯氨酸含量随时间变化曲线；
[0027]图6PEG6000处理后转基因棉花和非转基因棉花的MDA含量随时间变化曲线。
【具体实施方式】
[0028]以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0029]本发明用到的材料、试剂和仪器:
[0030]植物材料:海岛棉品种新海16和新海24由新疆农业大学农业生物技术重点实验
室提供。[0031]实验试剂:谷氨酰胺、天门冬酰胺、KT,2, 4-D及其它试剂从北京鼎国生物技术有限责任公司购买；凝固剂Gelrite购自Sigma公司。高压灭菌锅购自上海博迅BL-50A。培养瓶是上海稼丰园艺公司的150mL塑料三角培养瓶(型号ZP150)。
[0032]基本培养基母液的制备:
[0033]I) 20XMS大量元素母液(IL)
[0034]
【权利要求】
1.一种转基因海岛棉培育方法，包括以下步骤: 1)制备无菌苗； 2)培养初生胚性愈伤组织； 3)制备农杆菌侵染液； 4)初生胚性愈伤组织与带有植物表达载体的农杆菌菌液共培养； 5)筛选抗性初生胚性愈伤组织； 6)分化抗性初生胚性愈伤组织，直至获得完整转基因植株。
2.根据权利要求1所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于:所述步骤I)具体为:棉花种子用硫酸脱绒后，酒精消毒处理30s，30%H202浸泡4h后于超净工作台内用无菌水冲洗4-5遍，28°C浸泡直至种子露白，接种于I / 2MS中，28°C下前3d暗培养，后3d光照16h，暗培养8h小时交替培养获得无菌苗。
3.根据权利要求1所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述步骤2)具体为:取步骤I)获得的无菌苗下胚轴中间段，将下胚轴切成0.5-0.8cm小段，培养于愈伤组织诱导培养基MSl中，每20-25天继代I次，直至愈伤组织增殖至直径达到1.5-2cm，去除下胚轴培养在愈伤组织分化培养基MS2中，每15-18天继代培养一次，在愈伤组织块边缘分化出初生胚性愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述步骤3)具体为:培养含有植物表达载体的农杆菌，制备农杆菌侵染液，农杆菌浓度为OD等于0.5。
5.根据权利要求1所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述步骤4)具体为:将步骤2)获得的初生胚性愈伤组织，置于步骤3)获得的农杆菌侵染液中，浸泡15min后将初生胚性愈伤组织用无菌水清洗三遍，将其滤出，用无菌滤纸吸干表面的菌液；然后放到共培养培养基上，于28 °C培养箱中共培养24h。
6.根据权利要求1所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述步骤6)具体为:将步骤5)获得的抗性初生胚性愈伤组织接转到铺垫无菌滤纸的抗性愈伤分化培养基中，每18天继代一次，每次继代时挑选成熟体胚或植株，将形态建成完整的正常植株转入成苗培养基中，直至获得完整植株。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基MSl成分是MSB为基本培养基，附加0.1mg -1^2, 4_D、0.1mg -L^1KTjPH=S.8。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述愈伤组织分化培养基MS2成分是MSB为基本培养基，附加1.9g.T1KNO3, PH=5.8。
9.根据权利要求1-6任意一项所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述共培养培养基成分是MSB为基本培养基，附加1.9g.T1KNO3, pH 5.8。
10.根据权利要求1-6任意一项所述的转基因海岛棉培养方法，其特征在于，所述抗性愈伤分化培养基成分是MSB为基本培养基，附加3.8g -L-1KNO3^0.1g.Ι^天冬酰铵、0.1g -1谷氨酰铵、0.05mg.T1IBA, ρΗ5.8。
【文档编号】A01H4/00GK103667336SQ201210319382
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】曲延英, 陈全家, 杨婷, 孙国清 申请人:新疆农业大学