专利名称：一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法
技术领域：
本发明涉及一种冬虫夏草培养方法，更具体的说涉及一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法。
背景技术：
冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc 又名虫草,系麦角菌科虫草属真菌中国被毛孢寄生蝙蝠蛾属昆虫幼虫体内形成的虫菌复合体，是我国特有珍稀名贵中药材。具有补肺益肾、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、阳痿遗精、病后体虚、老年慢性咳嗽等疾病。冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500-5200m局部高寒山区草甸地带。天然资源十分有限，近年来采挖过度造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此， 人工栽培冬虫夏草势在必行。人工培殖的关键是冬虫夏草菌能否侵染寄主昆虫，进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。野生冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫的的感染途径为，蝙蝠蛾属昆虫幼虫在野生环境中通过体表或食道感染中华被毛孢菌，但是上述方法，染菌率低，周期长，而且不能进行规模化生产。目前寄主人工感染方法为将中国被毛孢孢子菌液采用涂抹于寄主体表、注射到寄主体内、灌注或通过饲料从寄主食道进入寄主体内。涂永勤等在期刊《食用菌》2010 (3)中发表的《蝠蛾属幼虫感染冬虫夏草茵的实验研究》公开了多种以中华被毛孢孢子菌液作为冬虫夏草寄主感染的菌种材料。但是上述方法存在中华被毛孢菌种分离纯化难度大，且幼虫染菌率和染菌后存活率较低的问题。专利申请人在国家自然科学基金面上项目“冬虫夏草寄主幼虫适应饲料的机理及其生态适合度评估”(编号为81072997)、“冬虫夏草寄主昆虫拟青霉病的分子流行病学研究”(编号为81173479)和国家自然科学基金青年基金项目“人工繁育冬虫夏草寄主幼虫发育变异的影响因素研究”(项目批准号为30901964)的资助下对冬虫夏草寄主感染的菌种材料进行了研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料。具体内容为一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，所述用于冬虫夏草寄主饲养中寄主感染的菌种材料为冬虫夏草菌皮。所述的冬虫夏草菌皮为冬虫夏草采挖出来时，冬虫夏草僵虫菌核表面覆盖的菌膜。所述冬虫夏草菌皮的提取方法为将挖出来且未经过任何清理的冬虫夏草清理掉表面的颗粒状土块以及杂物，保留冬虫夏草僵虫菌核表面与僵虫菌核外形相似的一层与土混合的菌膜外壳；将与土混合的菌膜外壳剥落收集得到冬虫夏草菌皮。一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，为将上所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料的溶混悬液体灌注到冬虫夏草寄主虫口中或拌到冬虫夏草寄主饲料中，对冬虫夏草寄主进行饲养。一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，为将上所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料或粉末直接拌入冬虫夏草寄主饲料或直接喂到冬虫夏草寄主虫口。一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体注射到虫体中。
一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，为将上所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体直接喷淋到冬虫夏草寄主虫体上或将冬虫夏草寄主感染的菌种材料混入到冬虫
夏草寄主的培养基中。本发明的有益技术效果是本发明提供的采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料的方法，菌种材料的制备成本更低；更重要的是，冬虫夏草菌作为菌种材料，冬虫夏草寄主的存活率和感染率较接种中国被毛孢孢子菌菌液，寄主幼虫的感染率和存活率都显著提高。
具体实施例方式实施例I用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料的制备方法采集长成的冬虫夏草，具体的采集方法为撬起冬虫夏草周围的表土，不能触及冬虫夏草的僵虫菌核表面；剥落冬虫夏草周围的土块，得到被一层外形与僵虫菌核形态相似的菌膜与泥土混合物构成的外壳包裹的冬虫草夏草；收集上述菌膜与泥土混合物构成的外壳，得到冬虫夏草菌皮。将冬虫夏草菌皮用水超声融化，得到冬虫夏草菌皮的混悬液，过滤混悬液中的泥土，得到第一次水溶液；将过滤出的泥土用水洗涤，过滤得到第二次水溶液，合并第一次和第二次水溶液，浓度为每Ig菌皮制备3mL菌皮水溶液，得到用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料。实施例2冬虫夏草寄主的感染方法的考察I从已感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫活体得到蝙蝠蛾幼虫体液，将体液用接种针粘上在无菌条件下涂抹(即接种)于平板培养基上。将涂抹了带菌活幼虫体液的平板培养基置于8 18°C恒温箱内培养。3天后，每天观察一次，及时汰除杂菌，10 16天后方在平板培养基的接种处形成深灰、继而转变成棕黄乃至黑色的中国被毛孢菌落。将分离出来的中国被毛孢菌，从平培养基板上转入行的培养基上，置18°C条件下培养，接种体中心呈黄褐色、菌落坚硬，有稀疏平贴的纤细菌丝，进而形成冬虫夏草菌的分生孢子。用无菌水将其孢子洗下，配制成孢子悬浮液；浓度为每毫升105个孢子。收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼虫,2400条虫六等分放于8个Im2干净的经消毒的搪瓷盘中，每组300条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽寥、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d,使虫体恢复生长。然后清除剩余全部食用。停喂2 3d后，取上述任意3组饲喂孢子悬浮液喷淋过的珠芽寥、胡萝卜、红苕、菜叶，作为对照组I ;取任意4组饲喂实施例I得到的冬虫夏草寄主感染的菌种材料喷淋过的珠芽寥、胡萝卜、红苕、菜叶，作为实验组I ;每天清除剩余物，第2d用同样方法饲喂，连喂30d，观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮。活动敏捷，反应灵敏的虫，然后上覆IOcm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在I 5°C，继续饲喂，分别在I个月、3个月、6个月和I年后，分别将实验组和对照组个一组挖出虫体，计算感染僵化的成活的和死亡的虫体数；得到混合饲料饲喂方法组数据。按I个月、3个月、6个月和I年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取10头幼虫进行调查。将幼虫体表面消毒后，采用特制的工具在无菌条件下抽取微量的血淋巴制片，镜检观察，记录血淋巴内菌体的形态。追踪观察幼虫僵化情况。在对菌体进行观察的同时，抽取微量带菌血淋巴涂抹在灭菌PDA培养基平板上,置于18°C恒温箱内培养。每日一次取出培养皿镜检观察菌体生长发育的状态，或挑取菌体及其培养物制片观察。待涂布菌体处形成菌落，挑取菌落表面的菌丝体制片镜检观察；具体结果如表I所示。表I不同菌种材料幼虫的感染情况 菌种材料检测时间接种幼虫数/头存活幼虫数/头感染幼虫数/头感染率/%
对照组I I个月后 3002908930.68
3 个月后 30024511546.93
6 个月后 30020816880. 10
_I 年后_300_ITl_155_90. 64_
实验组I I个月后 300 284 231 81.333 个月后 300 221 210 95.026 个月后 300 187 187 100.00_I 年后_300_180_180_100. 00_结果表明，寄主幼虫感染冬虫夏草菌是一个复杂的过程，需要一定的时间，才能完成整个侵染过程。由表I可知，采用实施例I所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，寄主幼虫接种I个月后即可感染上冬虫夏草菌。接种6个月后感染达高峰，感染率为100%。实施例3冬虫夏草寄主的感染方法的考察2收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼虫，2400条虫六等分放于8个Im2干净的经消毒的搪瓷盘中，每组300条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽寥、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d,使虫体恢复生长。将上述6组，清洗虫子表面，用3%双氧水作表面消毒后；选取任意4组，用微型注射枪，在显微镜下将实施例2制备的孢子悬浮液通过虫体表面的微孔道注入虫体血腔内，作为对照组II ;选取任意4组，用微型注射枪，在显微镜下将实施例I所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料通过虫体表面的微孔道注入虫体血腔内，作为实验组II ；30d后观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮，活动敏捷，反应灵敏的虫，然后上覆IOcm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在I 5°C，继续饲喂，分别在I个月、3个月、6个月和I年后，挖出虫体，计算感染僵化的、成活的和死亡的虫体数；得到注射方法组数据。按I个月、3个月、6个月和I年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取10头幼虫进行调查。采用是实施例2所述的检测方法，具体结果如表2所示。表2不同菌种材料幼虫的感染情况
权利要求
1.一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，其特征在于所述用于冬虫夏草寄主饲养中寄主感染的菌种材料为冬虫夏草菌皮。
2.根据权利要求I所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，其特征在于所述的冬虫夏草菌皮为冬虫夏草采挖出来时，冬虫夏草僵虫菌核表面覆盖的菌膜。
3.根据权利要求2所述的用于冬虫夏草寄主感染得菌种材料，其特征在于所述冬虫夏草菌皮的提取方法为将挖出来且未经过任何清理的冬虫夏草清理掉表面的颗粒状土块以及杂物，保留冬虫夏草僵虫菌核表面与僵虫菌核外形相似的一层与土混合的菌膜外壳；将与土混合的菌膜外壳剥落收集得到冬虫夏草菌皮。
4.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料的溶混悬液体灌注到冬虫夏草寄主虫口中或拌到冬虫夏草寄主饲料中，对冬虫夏草寄主进行饲养。
5.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料或粉末直接拌入冬虫夏草寄主饲料或直接喂到冬虫夏草寄主虫口。
6.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体注射到虫体中。
7.—种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体直接喷淋到冬虫夏草寄主虫体上或将冬虫夏草寄主感染的菌种材料混入到冬虫夏草寄主的培养基中。
全文摘要
本发明提供了一种采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料。具体内容为一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，所述用于冬虫夏草寄主饲养中寄主感染的菌种材料为冬虫夏草菌皮；本发明提供的采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料的方法，菌种材料的制备成本更低；更重要的是，冬虫夏草菌作为菌种材料，冬虫夏草寄主的存活率和感染率较接种中国被毛孢孢子菌菌液，寄主幼虫的感染率和存活率都显著提高。
文档编号A01K67/033GK102792855SQ20121033858
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者刘飞, 张德利 申请人:重庆市中药研究院