专利名称：重组杆状病毒感染家蚕的一种新方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒感染技术，尤其涉及一种重组病毒感染家蚕的方法。
背景技术：
昆虫杆状病毒表达载体系统(BacuLovirus Expression Vector System,简称BEVS)是利用携带有外源目的基因的重组昆虫杆状病毒作载体在昆虫体内或昆虫培养细胞进行表达生产的一个重组蛋白生产系统。由于该系统具有可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的高效表达生产等优点而成为目前最有效的真核表达系统之一。目前BEVS主要包括欧美国家正在广泛应用的苜猜银纹夜蛾核型多角体病毒iAutographa californicanucleopolyhedrosis virus,简称AcNPV)和在中国、日本应用较多的的家蚕核型多角体病莺 iBombyx mori nucleopolyhedrosis virus,简称BmNPV)两类表达系统(Smith et al., 1983; Maeda et al.，1984，1985)。家蚕BmNPV表达系统由于可以利用我国饲养量最大的经济昆虫一家蚕作为表达载体，从而具有成本低、适合规模化生产的优点，非常具有我国特色(吕鸿声，1998)。然而，目前的感染技术都是采用将重组病毒直接注射入家蚕体内的方法进行感染表达，在实际操作过程中由于需要逐条家蚕进行注射，花费时间长，操作繁琐，而且由于家蚕在注射过程中由于虫体蠕动等原因，造成病毒液流出体外，最终导致感染失败，因此目前传统的经皮注射方法缺陷明显，工作效率低下。为了提高杆状病毒表达系统的工作效率，有必要开发出更加高效的感染方式。通过反复试验，我们发现将病毒液涂于家蚕幼虫体表，也能实现病毒进入虫体，最终导致病毒的感染，达到与经皮注射感染一样的效果O
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组杆状病毒经皮感染家蚕的新方法。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下
本发明重组家蚕杆状病毒经皮感染家蚕的方法是将家蚕幼虫集中于饲养框内；以100头家蚕幼虫喷射5ml重组家蚕杆状病毒液为标准，将含有IO6 Pfu的重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表；喷射后I小时内不饲喂桑叶，待大部分病毒液干燥后，按照常规方法饲养家蚕幼虫，直至家蚕幼虫出现病毒感染症状。进一步地，本发明所述家蚕幼虫为3龄或4龄。与现有技术相比，本发明具有的有益效果是
(I)本发明方法实施的结果表明，通过将重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表，也能使病毒进入家蚕体内；由于家蚕与其他昆虫一样，有一个开放式的血液循环系统，一旦病毒进入血液，病毒就能够很快感染，并向周围组织扩散，最终实现全身感染。(2)家蚕-杆状病毒表达系统有可能成为我国生物技术产业化中的一个有力工具，本发明较好地解决了重组病毒感染操作繁琐、效率低下的问题，简化了病毒感染方法，大大提高了杆状病毒表达系统的工作效率。
(I)图I是家蚕幼虫的血液样品在荧光倒置显微镜下观察的照片，其中，图I (a)为无感染的家蚕幼虫的血液样品；图I (b)为被重组家蚕杆状病毒感染后的家蚕幼虫的血液样品，且出现绿色荧光 。(2)图2是无感染家蚕幼虫与被重组家蚕杆状病毒感染的家蚕幼虫的症状对照图，其中，图2 (a)为无感染家蚕幼虫；图2 (b)为被重组家蚕杆状病毒感染的家蚕幼虫。
具体实施例方式以下进一步详细介绍本发明方法
I.材料重组家蚕杆状病毒采用目前已经非常成熟的技术构建，具体方法可以参见国内外发表的论文，如2006年发表在《蚕业科学》的“利用细菌转座子构建适用于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统”一文，32 (2):183_188。利用上述家蚕的Bac-to-Bac技术构建一个表达报告基因绿色荧光蛋白EGFP的重组家蚕杆状病毒，利用该病毒，使用本发明方法经皮感染家蚕幼虫。在以下实施例中，使用家蚕杂交种，品种名称为秋丰X白玉，家蚕幼虫以桑叶饲养，饲养温度为23 25°C。在以下实施例中，重组家蚕杆状病毒经皮感染家蚕的方法如下
将家蚕3龄或4龄幼虫集中于饲养框内；以100头家蚕喷射5ml病毒液为标准，用小型喷雾器将含有IO6 pfu (病毒感染单位)的重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表，并在喷射后I小时内不饲喂桑叶；之后在大部分或全部病毒液体干燥后，按照常规方法饲养家蚕，直至家蚕幼虫出现图2 (b)所示的病毒感染症状。感染效果测定在将重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表72-96小时后，取家蚕幼虫的少量血液置于载玻片上，在荧光倒置显微镜下观察是否出现病毒感染产生的绿色荧光如图I (b)所示，如果有，则说明该家蚕幼虫已被重组家蚕杆状病毒感染。在重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表后的120小时左右，进一步观察家蚕幼虫的发病症状。结果分析在将重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表后的96小时左右，在荧光倒置显微镜下观察观察家蚕幼虫的血液时，即可发现有明显的绿色荧光参见图I(b)；而未感染病毒的家蚕幼虫的血液样品则不会产生突光参见图I (a)。在重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表后的120小时左右，即可发现家蚕幼虫出现典型的病毒感染症状，如食欲减退，体表发亮，体节肿胀，狂躁爬行等对照图2(a)和图2 (b)，进一步说明家蚕幼虫已被病毒感染，重组蛋白-绿色荧光蛋白获得了表达。
权利要求
1.一种重组家蚕杆状病毒经皮感染家蚕的方法，其特征在于将家蚕幼虫集中于饲养框内；以100头家蚕幼虫喷射5ml重组家蚕杆状病毒液为标准，将含有IO6 Pfu的重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表；喷射后I小时内不饲喂桑叶，待大部分病毒液干燥后，按照常规方法饲养家蚕幼虫，直至家蚕幼虫出现病毒感染症状。
2.根据权利要求I所述的重组家蚕杆状病毒经皮感染家蚕的方法，其特征在于所述家蚕幼虫为3龄或4龄。
全文摘要
本发明公开了一种重组家蚕杆状病毒经皮感染家蚕的方法将家蚕幼虫集中于饲养框内；以100头家蚕幼虫喷射5ml重组家蚕杆状病毒液为标准，将含有106pfu的重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表；喷射后1小时内不饲喂桑叶，待大部分病毒液干燥后，按照常规方法饲养家蚕幼虫，直至家蚕幼虫出现病毒感染症状。本发明方法的优点在于改变了传统直接使用经皮感染的接种方式，简化了接种操作，节省了接种时间，提高了昆虫杆状病毒表达系统的工作效率。
文档编号A01K67/04GK102885011SQ20121042039
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者杨锐, 沈运旺, 吴小锋 申请人:浙江大学