专利名称：德钦野生紫花苜蓿组培繁殖方法
德钦野生紫花苜蓿组培繁殖方法所属领域本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种德钦野生紫花苜蓿(Medicagaosativa L.)无菌苗组织培养及快速繁殖的方法。
背景技术：
德钦野生紫花苜猜(Medicago sativa L.)是一种多年生豆科牧草,分布云南省迪庆藏族自治州德钦县和金沙江流域的干热河谷地区，抗干热性十分突出。德钦野生紫花苜蓿蛋白质含量高，营养品质好，适于放牧和调制青干草，牛、马、猪和羊等牲畜均喜食，是一种优质的饲草资源。另外该苜蓿较耐贫瘠，在干热河谷地区种植可起到保土绿肥的作用。但由于当地的人们长期不合理地过度利用，野生紫花苜蓿已经到了濒危的状况。且野生紫花苜蓿的结实率很低，种子不易发芽，自然繁殖率较低。建立组培快繁体系可以从根本上解决这一问题。 迄今，紫花苜蓿组培快繁法大多都选用无菌种子为外植体，通过拟原球茎途径培养，此类方法存在德钦野生紫花苜蓿种子产量较低，通过原球茎途径培养造成的周期长的缺点。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明旨在提供一种德钦野生紫花苜蓿的组织快繁方法，各阶段采用不同的优化培养基配方，使之在野生种源缺乏及繁殖率低的情况下能够快速繁衍，使该物种的优良性状的保存能够得到保障，同时避免了通过原球茎途径造成的周期长的缺点，缩短离体培养时间及生产成本，提高生根率和幼苗移栽率，为德钦野生紫花苜蓿的可持续利用提供了组培种苗繁育基础。本发明采用叶片为外植体产生原球茎组培方法显得更有实际应用价值。本发明的上述目的是通过下述的技术方案加以实现的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，包括叶片消毒、愈伤组织诱导、分化、壮苗及生根培养以及试管苗移栽步骤，取野生紫花苜蓿的幼嫩叶片进行原球茎诱导、分化、壮苗、生根培养，培养的温度为23-25°C，湿度为30-45%，光照强度为1000-3000LX，光照时间为16h/d ;所述的愈伤组织诱导培养基为MS + 2，4-D 2. O mg/1+ 6-BA I. O mg/1 + 3%蔗糖+ O. 8% 琼脂，分化培养基为 MS + 6-BA O. 5 mg/1 + NAA O. 5 mg/1 + 3% 蔗糖 + O. 8% 琼月旨，壮苗培养基为MS+IAA1.0 mg/1 +KTO. 5 mg/1 + 0.8%琼脂培养基，生根培养基为1/2MSmg/Ι + 3%蔗糖+ O. 8%琼脂培养基。所述的组培繁殖方法中，叶片消毒先用用自来水冲洗3飞遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H202溶液浸泡15分钟，无菌蒸馏水清洗5遍。所述的组培繁殖方法中，移栽是生根组培苗在培养瓶内培养20天以后炼苗5天，再移栽于温室大棚，移栽基质为混有灭过菌的营养土(园土 腐殖土 砂土 =2 2 1)和适量珍珠岩，移栽最初的一个星期用塑料薄膜覆盖装有基质的营养盘，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。具体地，本发明的组培繁殖方法为选德钦野生紫花苜蓿的叶片为外植体，将幼嫩叶片用自来水冲洗3飞遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15 min,无菌蒸馏水清洗5遍,然后每一小叶切成5 mmX5 mm的小块。将切好的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基MS + 2,4-D 2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，培养条件为温度24°C，光照16h，光照强度1000LX，培养45 d左右。把经过筛选具有胚性的质地致密或颗粒状或具有绿色芽点，体积适中的愈伤组织块进行分割，使愈伤组织块大小均一，尽量将由同一块愈伤组织块分割得到的小愈伤组织块转入同一分化培养基MS + 6-BA 0.5 mg/1+ NAA 0.5 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，进行体细胞胚生长和发育的培养，培养条件为温度24°C，光照强度3000LX，光照16h，培养45 d左右。将在分化培养基生成的丛生芽转到壮苗培养基MS+IAA1.0 mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%琼脂进行壮苗培养基使其快速生长，形成大的丛生苗并伸长，培养10天左右。将生成的无根小苗(2 3cm高)在节间下部I mm处切下，移入生根培养基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%琼脂。培养条件为温度24°C，光照强度 3000LX,光照16h。IOd左右即可生根，当试管苗出现3飞条粗根，长约2 3cm，苗高5cm以上时准备移栽。先打开封瓶膜，经:T5d锻炼，移入混有灭过菌的营养土(园土 腐殖土 砂土=2 2 1)和适量珍珠岩的培养盘内，最初的一个星期用塑料薄膜覆盖，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。与现有技术相比，本发明的组培方法的优点在于本发明方法在培养不同阶段采用了不同配方的培养基，以适应植物在不同时期对营养物质的需求，通过本发明的方法培养，野生紫花苜蓿的出愈率为97. 85%，分化率为79. 07%，生根率为98. 42%，移栽成活率为94. 55%，在一月内可增殖系数为10，极大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖系数，阻止了由于野外植株少缺乏种子及种子成活率低，导致该物种濒临灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。本发明建立了有效的工厂化野生紫花苜蓿组培快繁方法，解决了传统野生种子繁殖困难，繁殖受阻的状况。通过本发明组培快繁得到的幼苗，成苗一致性强，生长健壮，叶色浓绿，病虫害较少，易于管理。不受季节限制，任何时候都可以进行组培。可以保持物种特性，使该品种能够延续和可持续利用。节约了生产成本，且生产过程中分化率高，繁殖速度快。本发明通过不断的探索实验，形成了一套专门的野生紫花苜蓿组织培养繁殖技术体系，克服了之前专利培养基成分复杂，培养过程繁琐，无实际工厂化繁殖经验，为规模化人工种植德钦野生紫花苜蓿提供了保障，现阶段已使用本发明工厂化生产德钦野生紫花苜蓿瓶苗3年之久，生产过程中问题少，分化率高，繁殖速度快，继代代数多，营养成分与德钦野生紫花苜蓿相当，证明了该繁殖技术是目前为止适合工厂化生产的组培方法。
具体实施例方式以下实施例用来进一步说明本发明的实质性内容。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。实施例I :以德钦野生紫花苜猜(Medicagao sativa L.)的叶片为外植体，将幼嫩叶片用自来水冲洗3遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15min，无菌蒸馏水清洗5次，然后每一小叶切成5 mmX5 mm的小块。将切好的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基MS +
2.4-D2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，培养条件为温度24°C，光照16h，光照强度1000 LX，培养45天。把经过筛选具有胚性的质地致密或颗粒状或具有绿色芽点，体积适中的愈伤组织块进行分割，使愈伤组织块大小均一，尽量将由同一块愈伤组织块分割得到的小愈伤组织块转入同一分化培养基MS + 6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/I + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，进行体细胞胚生长和发育的培养，培养条件为温 度24°C，光照强度3000LX，光照16h。45天左右，将在分化培养基生成的丛生芽转到MS+IAA1. O mg/1+ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%琼脂壮苗培养基使其快速生长，形成大的丛生苗并伸长。将生成的无根小苗(2cm高)在节间下部Imm处切下，移入生根培养基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%琼脂，培养条件为温度24°C，光照16h，光照强度3000LX。10天左右即可生根，当试管苗出现3条粗根，长2cm，苗高5cm以上时准备移栽。先打开封瓶膜，经3天锻炼，移入混有灭过菌的营养土(园土 腐殖土 砂土 =2:2:1)和适量珍珠岩的培养盘内，最初的一个星期用塑料薄膜覆盖，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。实施例2:以德钦野生紫花苜猜(Medicagao sativa L.)的叶片为外植体，将幼嫩叶片用自来水冲洗5遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15min，无菌蒸馏水清洗5次，然后每一小叶切成5 mmX5 mm的小块。将切好的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基MS +
2.4-D2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，培养条件为温度24°C，光照16h，光照强度1000 LX，培养45天左右。把经过筛选具有胚性的质地致密或颗粒状或具有绿色芽点，体积适中的愈伤组织块进行分割，使愈伤组织块大小均一，尽量将由同一块愈伤组织块分割得到的小愈伤组织块转入同一分化培养基MS + 6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/I + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，进行体细胞胚生长和发育的培养，培养条件为温度24°C，光照强度3000LX，光照16h。45天左右，将在分化培养基生成的丛生芽转到MS+IAA1. O mg/1+ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%琼脂壮苗培养基使其快速生长，形成大的丛生苗并伸长。将生成的无根小苗(3cm高)在节间下部Imm处切下，移入生根培养基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%琼脂，培养条件为温度24°C，光照16h，光照强度3000LX。10天左右即可生根，当试管苗出现:Γ5条粗根，长2 3cm，苗高5cm以上时准备移栽。先打开封瓶膜，经5天锻炼，移入混有灭过菌的营养土(园土 腐殖土 砂土 =2:2:1)和适量珍珠岩的培养盘内，最初的一个星期用塑料薄膜覆盖，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。通过本发明上述方法的培养，野生紫花苜蓿的出愈率为97.85%，分化率为79. 07%，生根率为98. 42%，移栽成活率为94. 55%，在一月内可增殖系数为10，极大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖系数，阻止了由于野外植株少缺乏种子及种子成活率低，导致该物种濒临灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。解决了传统野生 种子繁殖困难，繁殖受阻的状况。通过本发明组培快繁得到的幼苗，成苗一致性强，生长健壮，叶色浓绿，病虫害较少，易于管理。不受季节限制，任何时候都可以进行组培。可以保持物种特性，使该品种能够延续和可持续利用。节约了生产成本，且生产过程中分化率高，繁殖速度快。
权利要求
1.德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩叶片消毒后，顺序在愈伤组织诱导、分化、壮苗、生根培养基中进行原球茎愈伤组织诱导、分化、壮苗、生根培养，然后进行试管苗移栽，所述的愈伤组织诱导培养基为MS + 2,4-D 2.0 mg/1+ 6-BA 1.0 mg/I + 3% 蔗糖 + O. 8% 琼脂，分化培养基为 MS + 6-BA O. 5 mg/1 + NAA O. 5 mg/1 + 3% 蔗糖+ 0.8%琼脂，壮苗培养基为MS+IAA1.0 mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + 0.8%琼脂培养基，生根培养基为1/2MS mg/Ι + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂培养基；诱导、分化、壮苗、生根培养的温度为23-25°C，湿度为30-45%，光照强度为1000-3000LX，光照时间为16h/d。
2.如权利要求I所述的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，其特征在于所述的叶片消毒先用自来水冲洗3飞遍，70%酒精浸泡30秒，再用10%H202溶液浸泡15分钟，无菌蒸馏水清洗5遍。
3.如权利要求I所述的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，其特征在于所述的试管苗移栽是生根组培苗在培养瓶内培养20天后，炼苗5天再移栽于温室大棚，移栽基质为混有灭过菌的营养土即园土 腐殖土 砂土 =2:2:1和适量珍珠岩，移栽7天内用塑料薄膜覆盖装有基质的营养盘，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，待组培苗长出健壮的茎叶时移入大田。
4.如权利要求I所述的德钦野生紫花苜蓿的组培繁殖方法，其特征在于选德钦野生紫花苜蓿的叶片为外植体，将幼嫩叶片用自来水冲洗3飞遍，70%酒精浸泡30 S，再用10%H202溶液浸泡15 min，无菌蒸馏水清洗5遍，然后每一小叶切成5 mm X 5 mm的小块，将切好的幼嫩叶片接种于愈伤组织诱导培养基MS + 2，4-D 2. O mg/1+ 6-BA I. O mg/1 + 3%蔗糖+.O.8%琼脂中，培养条件为温度24°C，光照16h，光照强度1000LX，培养45 d，把经过筛选具有胚性的质地致密或颗粒状或具有绿色芽点，体积适中的愈伤组织块进行分割，使愈伤组织块大小均一，将由同一块愈伤组织块分割得到的小愈伤组织块转入同一分化培养基MS +6-BA 0.5 mg/1 + NAA 0.5 mg/1 + 3%蔗糖+ 0.8%琼脂中，进行体细胞胚生长和发育的培养，培养条件为温度24°C，光照强度3000LX，光照16h，培养45 d ;将在分化培养基生成的丛生芽转到壮苗培养基MS+IM1. O mg/1 +ΚΤ0. 5 mg/1 + O. 8%琼脂进行壮苗培养基使其快速生长，形成大的丛生苗并伸长，培养10天，将生成2 3cm高的无根小苗在节间下部Imm处切下，移入生根培养基1/2MS+ 3%蔗糖+ 0.8%琼脂，培养条件为温度24°C，光照强度3000LX,光照16h，IOd后生根，当试管苗出现3飞条粗根，长2 3cm，苗高5cm以上时移栽，先打开封瓶膜，经:T5d锻炼，移入混有灭过菌的营养土即园土 腐殖土 砂土 =2:2:1和适量珍珠岩的培养盘内，最初7天用塑料薄膜覆盖，遮阳保湿，使环境相对湿度保持在80%，并早晚通气半小时，成活后去除塑料薄膜，使其自然生长，待其长出健壮的茎叶时移入大田。
全文摘要
德钦野生紫花苜蓿(Medicagao sativa L.)无菌苗组织培养及快速繁殖的方法，取野生紫花苜蓿的幼嫩叶片进行原球茎诱导、分化、壮苗、生根培养。通过本发明方法，繁育的野生紫花苜蓿在一月内可增殖系数为10，平均生根率为98%，平均移栽成活率为95%，极大地提高了野生紫花苜蓿的繁殖系数，阻止了由于野外植株少缺乏种子及种子成活率低，导致该物种濒临灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。
文档编号A01H4/00GK102907326SQ20121044008
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者毕玉芬, 姜华, 何承刚, 马向丽, 赵雁, 申亚楠 申请人:云南农业大学