专利名称：一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法。
背景技术：
植物组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段，同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。通常的植物组织培养需要经历愈伤组织-芽-小苗-生根的过程，如中国专利申请2008101469482公开的落羽杉离体快速繁殖方法，其直接选用种子作为外植体，接着利用种子诱导不定芽，接着诱导生根培育壮苗，在诱导生根时直接选用了培养基。再如中国专利申请2005100298416公开的一种蚕豆离体培养方法，其选用蚕豆种子培育出无菌种子苗，利用种子苗克隆3代群体后经环境胁迫筛选后进行诱导生根，诱导生根时也直接选用了培养基。在诱导生根的过程中，如何优化或筛选最优的生根培养基是重要的，其直接影响组培苗的质量和移栽成活率。以烟草组织培养为例。烟草组织培养快速繁殖成苗过程大致经历愈伤组织的形成、不定芽的诱导、不定芽生根成苗三个阶段，其中不定芽的诱导生根直接影响组培苗的质量和移栽成活率，是影响快速繁殖的重要环节，也是烟苗移栽成活和集约化育苗生产技术体系的关键技术。有关烟草组织培养已有不少报道，近年来在培养基的优化、悬浮培养细胞体系和原生质体培养等方面也取得一些进展。但是当前诱导烟草组培苗生根过程中仍存在生根时间长，根系活力低、移栽成活率低等诸多问题，其中生根培养基是造成上述问题的关键因素之一。同时，生根培养基的筛选工作繁琐、周期长、和试验材料的浪费进一步限制了生根培养基筛选过程及条件的优化。为了优化烟草组培苗生长的培养基筛选方法，需要选择合 适的生根材料和筛选方法，筛选出适合烟草不定芽生根条件的最佳培养基。目前，烟草组培苗生根培养基的筛选主要选用愈伤组织诱导产生的不定芽作为生根鉴定材料，上述方法具有直接性，有效性、可靠性强等优点，但需要经历组培的前2个阶段获得鉴定材料才能开展筛选，存在周期长、程序复杂等缺点。而且，与上述现有技术相比，烟草种子十分小，仅有蚕豆或落羽杉种子的几百分之一，其产生的无菌种子苗也非常小、通过去掉小苗的根后，小苗茎部对培养基十分敏感、须根据其对培养基的反应程度和能否再次生根及其生根情况确定是否适合作为组培中不定芽的生根培养基。因此，研究一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法来解决这种技术问题，一方面为缩短筛选生根培养基的时间和明确培养基因子对根系生长的影响，另一方面简化筛选程序和节省试验材料。鉴于这种技术问题，迫切需要形成一种工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料的一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料的一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法。为了实现上述目的，本发明提供了一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其中，包括如下步骤A、消毒烟草种子的步骤；B、培育无菌种子苗的步骤；C、剪切无菌种子苗的步骤D、配置若干待选生根培养基的步骤；E、筛选最优生根培养基的步骤。步骤A具体为选取籽粒饱满的未包衣的烟草种子120 150粒置于培养皿中，加入经质量百分比浓度为75%乙醇浸泡30s，用无菌 水冲洗3次；再用质量百分比浓度为O. 1% HgCl2溶液浸泡5 7min，再用无菌水冲洗4 5次，即获取消毒的烟草种子。步骤B具体为用无菌镊子将步骤A所得消毒的烟草种子接种于含蔗糖1. 5 3%、琼脂O. 3
O.5%, pH5. 6 6. O培养基的培养皿中，种子间距O. 5 O. 7cm，培养皿中的培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1. 2 1. 5cm，培养基在121 °C湿热灭菌15_20min ;最后将接种好的培养皿置于25-28°C、12h光照/d、无菌环境中培养7 IOd ;得无菌种子苗，直至无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖。步骤C具体为无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时，在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1. O 1. 2cm,然后置于干燥无菌的滤纸上备用。步骤D具体为配制若干待选的生根培养基，培养基硬度以无菌种子苗茎部能顺利进入为准，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121 °C湿热灭菌15 20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25 28°C、12h光照/d培养条件下，培养14d以上。步骤E具体为根据烟苗根是否长进生根培养基中，以及生根培养基中根的长度、数量、根系活力及干物质积累量的情况，鉴定出适合于烟草的最佳生根培养基。步骤B中进一步包括配置培养基的步骤以配置IL培养基为准先在烧杯中放入蒸馏水，接着称取20 30g蔗糖倒入烧杯，搅拌溶解，再加蒸馏水用量筒定溶至IL ;用ImoI/LHCL或ImoI/L NaOH调节ρΗ5·6
6.O ;然后称取3 5g琼脂粉(强度1300g/cm2)，倒入上述配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，再装入培养基，培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1. 2 1. 5cm，接着放入消毒灭菌锅灭菌，在121 °C湿热灭菌15 20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。步骤D中配置的若干待选的生根培养基为1/2MS、1/2MS+0. 5g 活性炭、1/2MS+1. 5g 活性炭、1/2MS+2. 5g 活性炭、MS、MS+0. 5g活性炭、MS+L 5g活性炭、MS+2. 5g活性炭。步骤D中若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素ΝΑΑ0. 1-0. 3 (mg/L)。所述烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法在筛选其他植物的不定芽生根培养基中的应用。本发明的优点为工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料，具体为1、直接利用种子在培养皿中获取无菌种子苗材料，直接进入生根筛选阶段，比常规筛选试验省略了培养不定芽的繁琐，节省了人力、物力与时间。通常常规筛选试验需要严格实验室条件和较大工作量。2、使用烟草无菌苗对培养基进行筛选，可以与愈伤组织诱导同时开展，并且在短时间内可以完成大量培养基的筛选，在愈伤组织产生不定芽之前就能获取最佳的生根培养基，加快了试验进度。3、采用此种方法与不定芽筛选生根培养在诱导效果上表现一致。
图1为本发明的筛选方法 的流程示意图。
具体实施例方式实施例一、如图1所示，为本发明的筛选方法的流程示意图。其中，烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，如下A、消毒烟草种子的步骤；B、培育无菌种子苗的步骤；C、剪切无菌种子苗的步骤D、配置若干待选生根培养基的步骤；E、筛选最优生根培养基的步骤。步骤A具体为选取籽粒饱满的未包衣的烟草种子150粒置于培养皿中，(选用净叶黄烟种)加入经质量百分比浓度为75%乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用质量百分比浓度为O. 1% HgCl2溶液浸泡7min，再用无菌水冲洗5次，即获取消毒的烟草种子。步骤B具体为用无菌镊子将步骤A所得消毒的烟草种子接种于含蔗糖3%、琼脂
O.5%, pH6. O培养基的培养皿中，种子间距O. 5cm，培养皿中的培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1. 2cm，培养基在121°C湿热灭菌15min ;最后将接种好的培养皿置于28V、12h光照/d、无菌环境中培养IOd ;得无菌种子苗，直至无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖。步骤B中进一步包括配置培养基的步骤以配置IL培养基为准先在烧杯中放入蒸馏水，接着称取30g蔗糖倒入烧杯，搅拌溶解，再加蒸馏水用量筒定溶至IL ;用lmol/LHCL或Imol/LNaOH调节pH6. O ;然后称取5g琼脂粉(强度1300g/cm2)，倒入上述配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，再装入培养基，培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1. 2cm，接着放入消毒灭菌锅灭菌，在121°C湿热灭菌15min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。步骤C具体为无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时，在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1. O 1. 2cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用。步骤D具体为配制若干待选的生根培养基，培养基硬度以无菌种子苗茎部能顺利进入为准，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121 °C湿热灭菌15min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的莖1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25 28°〇、1211光照/(1培养条件下，培养14d以上。步骤D中配置的若干待选的生根培养基为1/2MS、1/2MS+0. 5g 活性炭、1/2MS+1. 5g 活性炭、1/2MS+2. 5g 活性炭、MS、MS+0. 5g活性炭、MS+L 5g活性炭、MS+2. 5g活性炭。步骤D中若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素ΝΑΑ0. 1-0. 3 (mg/L)。步骤E具体为根据烟苗 根是否长进生根培养基中，以及生根培养基中根的长度、数量及干物质积累量的情况，鉴定出适合于烟草的最佳生根培养基。筛选结果如下表表I不同培养基诱导不定芽生根的效果影响
权利要求
1.一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，包括如下步骤 A、消毒烟草种子的步骤； B、培育无菌种子苗的步骤； C、剪切无菌种子苗的步骤 D、配置若干待选生根培养基的步骤； E、筛选最优生根培养基的步骤。
2.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤A具体为 选取籽粒饱满的未包衣的烟草种子120 150粒置于培养皿中，加入经质量百分比浓度为75 %乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用质量百分比浓度为O. 1% HgCl2溶液浸泡5 7min，再用无菌水冲洗4 5次，即获取消毒的烟草种子。
3.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤B具体为 用无菌镊子将步骤A所得消毒的烟草种子接种于含蔗糖1. 5 3%、琼脂O. 3 O. 5%、pH5. 6 6. O培养基的培养皿中，种子间距O. 5 O. 7cm，培养皿中的培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1. 2 1. 5cm，培养基在121 °C湿热灭菌15_20min ;最后将接种好的培养皿置于25-28°C、12h光照/d、无菌环境中培养7 IOd ;得无菌种子苗，直至无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖。
4.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤C具体为 无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时，在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1. O 1. 2cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用。
5.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤D具体为 配制若干待选的生根培养基，培养基硬度以无菌种子苗茎部能顺利进入为准，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121°C湿热灭菌15 20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25 28°C、12h光照/d培养条件下，培养14d以上。
6.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤E具体为 根据烟苗根是否长进生根培养基中，以及生根培养基中根的长度、数量、根系活力及干物质积累量的情况，鉴定出适合于烟草的最佳生根培养基。
7.根据权利要求3所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤B中进一步包括配置培养基的步骤 以配置IL培养基为准先在烧杯中放入蒸馏水，接着称取20 30g蔗糖倒入烧杯，搅拌溶解，再加蒸馏水用量筒定溶至IL ;用lmol/LHCL或lmol/L NaOH调节pH5. 6 6. O ;然后称取3 5g琼脂粉(强度1300g/cm2)，倒入上述配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，再装入培养基，培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1. 2 1. 5cm,接着放入消毒灭菌锅灭菌,在121 °C湿热灭菌15 20min,灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。
8.根据权利要求5所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤D中配置的若干待选的生根培养基为 1/2MS、1/2MS+0. 5g 活性炭、1/2MS+1. 5g 活性炭、1/2MS+2. 5g 活性炭、MS、MS+O. 5g 活性炭、MS+1. 5g活性炭、MS+2. 5g活性炭。
9.根据权利要求8所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤D中若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素NAAO. 1-0. 3 (mg/L)。
10.一种如权利要求1-9任一所述烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法在筛选其他植物的不定芽生根培养基中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其中，包括如下步骤A、消毒烟草种子的步骤；B、培育无菌种子苗的步骤；C、剪切无菌种子苗的步骤D、配置若干待选生根培养基的步骤；E、筛选最优生根培养基的步骤。本发明工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料，直接利用种子在培养皿中获取无菌种子苗材料，直接进入生根筛选阶段，比常规筛选试验省略了培养不定芽的繁琐，节省了人力、物力与时间。且使用烟草无菌苗对培养基进行筛选，可以与愈伤组织诱导同时开展，加快了试验进度。此外，采用此种方法与不定芽筛选生根培养在诱导效果上表现一致。
文档编号A01H4/00GK103053419SQ20121059714
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者张建慧, 殷英, 余祥文, 屈建康, 赵宇, 廖华, 李方楼, 徐伟 申请人:四川省烟草技术中心