用于控制、预防和根除茄科培养物中的植物寄生虫的拟青霉属的用途、方法和生物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于产生真菌拟青霉属的方法，并且涉及用于预防和/或控制和/或根除线虫的用途、方法和杀线虫剂组合物，所述寄生线虫在茄科培养物中形成胞囊发展。本发明包括一种系统，其与菌种转接组合应用所述真菌，以便有效并且高效地降低茄科培养物中线虫胞囊的生存力。
【专利说明】用于控制、预防和根除茄科培养物中的植物寄生虫的拟青霉属的用途、方法和生物组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种获得真菌拟青霉属(Paecilomyces spp.)的方法，并且进一步涉及起杀线虫剂作用的用途、方法和生物组合物，其用于预防和/或控制和/或根除茄科(Solanaceae)培养物之上生长的胞囊形成线虫。
[0002]本发明包括一种系统，其与轮作组合应用所述真菌，以便令人惊讶地以有效并且高效的方式降低胞囊线虫的生存力，这在现有技术水平中尚未知，所述胞囊线虫对茄科培养物(例如尤其是马铃薯、番茄和茄子)的产量危害极大。本发明具有对产品、土壤以及生产者和末端消费者都无害的优势，这是由于其不促进有机产品的获得。
【背景技术】
[0003]线虫一般是具有减小的直径端的多细胞丝状微观植物寄生虫。一般而言，线虫是雌雄异体的(存在雄性和雌性)，并且其繁殖意味着交叉受精。根据其生物循环，这具有六个阶段:胞囊、四个幼年期(J1、J2、J3和J4)和成虫。胞囊残留在土壤中，使培养物的根在随后培养循环期间感染。线虫在培养时间期间取决于播种日期、土壤温度、生长时间长度、宿主类型和地理区域而可以具有多达六代。胞囊可以保持活的持续多达二十年的长时间段。
[0004]一般而言，在培养物感染后，线虫产生地上损伤，例如种子发芽减少、低产量、叶面污点、腐烂和萎黄、矮态、叶和茎变形、茎内部坏死、落叶和绿度不足；和地下损伤，例如瘤状根、根皮离断和坏死、球茎和小块茎、种子和蓓蕾或芽的低产量、根变形和坏死、鳞茎、小块茎和球茎、根过量增殖、根基顶端萎缩或发育不全的根基系统。
[0005]当幼虫J2在来自由植物 渗出的根基的刺激下爆发时，产生马铃薯球胞囊线虫(Globodera rostochiensis,图2)的感染。所述J2进入根的顶端部分,通过其花柱到表皮细胞和细胞壁中并且开始由中柱鞘细胞给食。因此，被感染的植物变得经历减小的根系、萎缩、矮态和萎黄；并且由于水吸收减少，植物可能会死亡。
[0006]金线虫(Golden nematode)或马铃薯球胞囊线虫是一种胞囊形成线虫,其感染食物和观赏植物，一年有数百万美元损失。从70年代起，这种线虫已经影响着马铃薯生产区域，并且从那时起，其已经扩散到所述小块茎生长的温带和/或山地带。根据保守估计，在墨西哥，这种线虫每年造成约800，000吨马铃薯产量损失，相当于每年约30亿墨西哥比索。在韦拉克鲁斯州(Veracruz state),估计每年损失是约50，000吨马铃薯,相当于每年约4.15亿墨西哥比索，这是因为已经观测到在韦拉克鲁斯州，马铃薯产量有统计降低(0EIDRUS, 2008)ο
[0007]在2008年期间，世界范围内报导了 3亿吨的马铃薯产量，其中中华人民共和国是其主要提供国和消耗国。这种食物展示高营养价值，是通用的并且优良的食物，具有多种工业特征用途，例如淀粉、麦芽糖、右旋糖、糖蜜和葡萄糖。
[0008]根据联合国粮食和农业组织(UnitedNations ' Food and AgricultureOrganization，FA0)，2007年马铃薯的世界产量是3.2530亿吨，主要产生国是中国、俄罗斯联邦、印度、美国、乌克兰、波兰、白俄罗斯、荷兰和法国。另一方面，这种小块茎的主要消耗国是欧洲国家，而较低消耗国在非洲和拉丁美洲。
[0009]根据农业、畜牧业、农村发展、渔业和粮食部(Secretary ofAgriculture, Cattle, Rural Development, Fishing and Food, SAGARPA),在墨西哥，马铃薯在播种面积方面位列第35位；然而，对于产量价值来说，这种小块茎位列第9位。在这个国家的12个州，超过8700名生产者致力于马铃薯耕作，其耕作每年产生17500个直接职位、51600个间接职位和630万人次劳动(2008年)。
[0010]在韦拉克鲁斯州，山地带(例如佩罗特山(Cofre de Perote)和奥里萨巴山(Picode Orizaba)的斜坡带)是生长马铃薯的理想位置。自从1987年来，韦拉克鲁斯州的全部生产区域(6000Ha)已经根据官方文件“抵抗马铃薯金线虫马铃薯球胞囊线虫的永久内部隔离编号 17 (Permanent Interior Quarantine Number 17 against the Potato GoldenNematode Globodera rostochiensis)”而处于隔离中，所述文件在1987年公开并且至今仍有效，通过墨西哥官方标准N0M040-FIT0-2002，其中给出市售马铃薯的产量和国家流通的需求和规格，禁止使用所述小块茎为种子，这是因为这可能是线虫、特别是马铃薯球胞囊线虫的传播媒剂。这种禁止被藐视，因此导致这种有害疫害有更大分散。这些规则显示，这种问题已经在超过30个农业循环中保持未能解决。
[0011]基本上，从约1972年起，金线虫或马铃薯球胞囊线虫已经影响着墨西哥马铃薯生产区域；这是因为在那时其散布到这种小块茎生长的山地带。所述寄生虫的存在记录显示，其达到比为了根据欧洲植物保护组织(European Organization for Plant Protection)避免对产量造成损伤的建议值(即，每公斤土壤40个胞囊)大100倍的群体。
[0012]最常用的控制马铃薯球胞囊线虫的方法是应用杀线虫剂，例如加保扶(carbofuran)，其除了有毒之外，不是决定性解决方案。在现有技术水平中，存在用于控制球胞囊线虫种的线虫的方法，其借助于使用合成蛋白(W0 01/94601 A2)、使用2R, 5R- 二羟甲基-3R，R- 二羟基吡咯烷(TO/1999/05941 ;由茄科的植物获得的化学试剂(W0/1999/059414);通过使用蛋白酶抑制剂(W0/1992/015690);和通过使用苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)(冊/1"3/019604);与来自万寿菊(Tagetes erecta)、罗勒(Ocimum basiIicium)或玫瑰草(Cymbopongon martini)的一或多种精油、载体和乳化剂的组合物(W0/2007/13222);基于鳞片状叶蒜树(Afrostyrax Iepidephyllus)树皮的组合物(W0/1995/010187)，添加半胱氨酸蛋白酶(W0/2008/087555)，并且特别用于控制马铃薯球胞囊线虫，使用线虫捕捉菌种(Arthrobotrys sp., KR20030094540),其对环境因素太过敏感并且不可用在去结构化的土壤上；由茄科(JP3190807)获得的化学试剂；和缩简式是C27H30O9的化学试剂(W0/1993/002083)。这些控制方法与菌种转接策略共同地一般以杂乱的方式进行并且极少了解线虫生命周期。这和所用的剂量造成对深层地幔的污染和损伤、产品的污染，并且在一些情况下，在所述线虫上产生抵抗性，并且因此使得其根除更难。
[0013] 拟青霉种已经被用于以下申请案中:用于控制植物中的飞行昆虫的细脚拟青霉(Paecilomyces tenuipes in the control of flying insects in plants,专利第 US7，033，586B2号、第US 20030124098号和第US 20070141032号)；用于控制土壤害虫的含有淡紫拟青霉的组合物(a composition containing Paecilomyces lilacinus usedin the control of soil pests, US 7, 435, 411 B2、CN101418264 和 US 20050008619)；用于控制地下白蚁中的玫烟色拟青霉或爪睡拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus orPaecilomyces javanicus in the control of under earth termites, US7, 390,480)；用于控制吸唆昆虫的与吡虫啉组合的爪睡拟青霉(Paecilomyces javanicus combinedwith imidacloprid in the control of sucker insects, CN101502270);与印棟素组合的爪睡拟青霉(Paecilomyces javanicus combined with azadirachtin, CN101331880 和CN101331884);与印棟素组合的玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus combinedwith azadirachtin, CN101273728 和 W0/1991/011856);由粉拟青霉获得作为杀昆虫剂的蛋白质(a protein obtained from Paecilomyces farinosus as an insecticide,W0/2001/000841);和更具体来说，用于控制植物寄生线虫中，其中是:淡紫拟青霉(专利第US5, 989，54 号、专利第 CN101422168 号、专利第 DE102005024783 号、专利第 CN101081982 号和专利第CA2059642号);玫烟色拟青霉(US 5，360, 607);淡紫拟青霉251、淡紫拟青霉252、淡紫拟青霉253和淡紫拟青霉254 (US 5，989，543);和蝉拟青霉(CN101518265)，没有对使用肉色拟青霉控制作物中的线虫的任何提及。 [0014]根据以上论述，并且响应于在全世界重要的市场(例如马铃薯市场)的问题，已经开发本发明来提供一种产生肉色拟青霉的最优化方法，以及可以容易地应用于控制和/或预防和/或根除茄科中的线虫并且对土壤和对产品或最终消费者都不具有负面作用的用途、方法和组合物。
【发明内容】
[0015]本新颖发明涉及真菌肉色拟青霉(非限制性地是真菌肉色拟青霉的菌株IE-431)；用于产生和扩散其的方法；和其作为对茄科植物的杀线虫剂用于控制异皮线虫科(Heteroderidae family)的线虫(非限制性地是马铃薯球胞囊线虫)的用途。
[0016]另外，描述用于控制和/或预防和/或根除茄科中的线虫以便避免造成对作物的损伤的组合物和方法，其特征在于其作用从第一培养物循环开始(其是令人惊讶的并且未在现有技术水平中报导)并且不影响产品的最终品质，但改进土壤的生物和化学特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.肉色拟青霉和淡紫拟青霉对马铃薯球胞囊线虫的作用的对比研究。
[0018]图2.肉色拟青霉的菌株IE-431的显微照片。
[0019]图3.马铃薯球胞囊线虫的显微照片。
[0020]图4.马铃薯球胞囊线虫胞囊。
[0021]图5.卵内侧感染有肉色拟青霉菌株IE-431的马铃薯球胞囊线虫J2。
【具体实施方式】
[0022]下文中所揭示的本新颖发明包含肉色拟青霉的用途、方法和生物组合物，其用于控制和/或预防和/或根除茄科培养物中的植物寄生虫。
[0023]肉色拟青霉菌株IE-431是一种根据本发明的方法产生的真菌。所述菌株目前被维持并且登记在生态学机构真菌保藏中心(the fungal collection of the Instituto deEcologia，INEC0L)，并且以编号IEWDCM782登记在世界培养物保藏联盟(World FederationCulture Collection, WFCC)0肉色拟青霉菌株IE-431的分离和/或维持在一或多种固体培养基中进行，所述固体培养基由至少氮源和/或至少碳源和/或一或多种无机盐和/或至少合适的媒剂和/或至少抗生素试剂和/或至少生长助剂构成。所述培养物在12°C到35 °C范围内的温度内培育足以获得恰当浓度的时间。[0024]真菌的大量繁殖在于在包含一或多种氨基酸和/或一或多种碳水化合物和/或一或多种无机盐和/或至少一种合适的媒剂和/或至少抗生素试剂和/或至少生长助剂的液体培养基中接种肉色拟青霉的活细胞。所述培养物在12°C到35°C范围内的温度下培育足以获得恰当的浓度(图3)的时间。
[0025]由本新颖研究中所揭示的分离和/或维持和/或大量繁殖的新颖方法获得的所述真菌肉色拟青霉菌株IE-431展现一系列遗传特征，其被保留而无代表性结构变化，这使其不同于任何其他拟青霉种并且之前从未在属于拟青霉种的任何其他种中观测到，其特征在于在10天在琼脂-燕麦(AA)培养基上呈现15mm到21mm、在琼脂-右旋糖-马铃薯(PDA)上呈现15mm到19mm的菌落直径，而在琼脂_胡萝卜_马铃薯(PZA)上其从15mm生长到17mm。其菌丝体在万舍和科内鲁普的法尔弗与法弗比色图表(color chart of Farver andFaver of Wanscher and Kornerup, 1961)中是白色到透明色(1A1);其不将在琼脂盘的正面和背面上测试的培养基染色。其纹理丝状强调在PZA上；其极接近于培养基表面生长(稀疏的)并且当成孢子时变成粉末状。所述菌丝体使PDA变形，在盒的背面上出现恶名昭彰的凹槽。其成形为笔直大线虫简单分生孢子梗，不具有分支，具有次球状的链状马状分生孢子，并且其中一些具有略指向末端、尺寸是2.4-4 μ mX 2-3.2 μ m的末端。
[0026]在固体培养基中，86%的分生孢子在16小时发芽，发芽管长度在6微米与54微米之间变化。在24小时，100%的孢子发芽并且菌丝体长度大于30微米并且小于110微米。
[0027]根据关于本发明发展的以上论述的技术知识，我们正提交如本发明结束时揭示的编码肉色拟青霉菌株IE-431的DNA核苷酸序列。
[0028]在本新颖研究中，令人惊讶地发现，当将肉色拟青霉IE-431的活细胞与线虫马铃薯球胞囊线虫的胞囊接触放置时，对胞囊造成实质上损伤，以使得这种寄生虫的传播得以避免。在我们的研究期间，我们发现，肉色拟青霉与马铃薯球胞囊线虫之间的相互作用在真菌发芽期间发生，当所述真菌接触胞囊(图4)时，所述胞囊通过其内部的菌丝体(图5)移植，因此令人惊讶地影响所述胞囊内含有的卵和幼虫Jl和J2的全部量。当肉色拟青霉穿透胞囊壁时，胞囊感染通过酶促方法开始，并且然后菌丝体生长在卵表面上和在幼年Jl和J2的内部；因此，所述菌丝体的发展变得侵袭性，达到完全降解卵和/或幼年Jl和J2的程度。
[0029]在本研究期间，进行关于肉色拟青霉菌株IE-431对马铃薯球胞囊线虫胞囊的杀线虫剂作用相较于淡紫拟青霉IE-430的作用的研究，并且令人惊讶地发现，肉色拟青霉IE-431以更快速并且有害的方式针对所述线虫的胞囊进行作用；即，在一个种与另一个种针对所述线虫的致病性之间存在显著差异。这一研究在实验室层面进行，评估所述胞囊在I X IO6个活细胞/mL的任一真菌活细胞浓度下和仅添加有蒸馏无菌水的第三对照群组下的感染程度。根据胞囊的宏观和微观外观评估所述致病性14天的时段，并且关于真菌肉色拟青霉菌株IE-431与淡紫拟青霉相比的作用，获得显著意外的差异。结果展示在图5中。
[0030]真菌肉色拟青霉菌株IE-431作为杀线虫剂的用途的下一测试阶段被单个地应用(TP)和与利马豆(HP)和豌豆(ChP)轮作共同地应用，有一个绝对对照物(TA)，其中既不应用控制也不应用作物。未用所述真菌处理的所述利马豆和豌豆作物被视为对照物(H)和(Ch)0当群体密度每100g 土壤超过200个胞囊(平均10-40的生存力和每g 土壤高达100个卵)时，在播种之前实现第一应用；在播种期间进行第二应用；并且在收集利马豆和豌豆之后进行第三应用，以便将金线虫群体降低到几乎零(表1和表2)。
[0031]表1.肉色拟青霉对控制马铃薯金线虫的作用，与轮转的利马豆作物和未耕作地块相比。
[0032]
【权利要求】
1.一种真菌肉色拟青霉(Paecilomyces carneus)的用途,其用于控制和/或预防和/或根除由胞囊形成线虫寄生的培养物中的线虫。
2.根据权利要求1所述的真菌肉色拟青霉的用途，其用于控制和/或预防和/或根除茄科(Solanaceae)培养物中的线虫。
3.根据权利要求1所述的肉色拟青霉的菌株IE-431的用途，其用于控制和/或预防和/或根除球胞囊线虫属(Globodera spp.)。
4.根据权利要求1和2所述的肉色拟青霉的菌株IE-431的用途，其单个地或与至少一种载体组合用于控制和/或预防和/或根除球胞囊线虫属。
5.一种肉色拟青霉菌株IE-431的生物纯培养物，其以编号IEWDCM782寄存在韦拉克鲁斯(Veracruz)的生物学研究所 A.C.保藏中心(the collection of the Institute of.Biology A.C.)，随后寄存在 WFCC。
6.一种获得根据权利要求3和4所述的肉色拟青霉菌株IE-431的方法，其特征在于是永久的或静态的，并且不间断氧化，氧含量是40%与90%的百分比。
7.一种获得根据权利要求3到6所述的肉色拟青霉菌株IE-431的方法，其特征在于用于大量传播所述真菌的所述组合物含有燕麦、胡萝卜、酵母和/或其组合。
8.根据权利要求1到7所述的肉色拟青霉的菌株IE-431的用途，其单个地或与至少一种载体组合，与菌种转 接和/或化学控制和/或生物控制同时实施，用于控制和/或预防和/或根除球胞囊线虫属。
9.根据权利要求1到8所述的肉色拟青霉的菌株IE-431的用途，其单个地或与至少一种载体组合用于控制和/或预防和/或根除球胞囊线虫属，其特征在于至少一种应用在培养之前和/或在培养期间和/或在每个培养循环之后进行。
10.一种根据权利要求1到9所述的杀线虫剂组合物，其特征在于包含浓度范围是.200, 000个细胞到20，000，000，000个细胞的肉色拟青霉的活细胞悬浮液，其单个地或与至少一种载体组合用于控制和/或预防和/或根除球胞囊线虫属。
【文档编号】A01N63/04GK103619178SQ201280021054
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年3月28日 优先权日:2011年4月29日
【发明者】歌莉娅·卢兹·罗拉·卡罗·维拉诺沃, 塔尼娅·爱撒多拉·赫南德兹·里尔, 乔瑟·丹尼尔·洛佩兹·里玛, 安吉尔·恩瑞克·努涅兹·桑切兹 申请人:生态研究所公司