包含黏琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)甘露聚糖酶的洗涤剂组合物及其使用方法
【专利摘要】本发明的组合物和方法涉及从黏琼脂芽孢杆菌克隆的内切-β-甘露聚糖酶、编码所述内切-β-甘露聚糖酶的多核苷酸及其使用方法。包含所述内切-β-甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。
【专利说明】包含黏琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)甘露聚糖酶的洗涤剂组合物及其使用方法
[0001]优先权
[0002]本专利申请要求2011年4月29日提交的国际申请N0.PCT/CN2011/073525的优先权，该国际申请据此全文以引用方式并入。
【技术领域】
[0003]本发明的组合物和方法涉及从黏琼脂芽孢杆菌克隆的内切-(6-甘露聚糖酶、编码内切-P -甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的使用方法。包含内切-P -甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。
【背景技术】
[0004]当前的衣物洗涤剂和织物护理组合物包括诸如表面活性剤、酶(蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶和/或纤维素酶)、漂白剤、助洗剂体系(builder system)、抑泡剂、悬污剂、去污剂、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀菌剂和芳香剂之类的活性成分的复杂组合。
[0005]包括内切-(6-甘露聚糖酶在内的甘露聚糖酶已经用于通过水解甘露聚糖而移除树胶污溃的洗涤剂清洁组合物中。自然界中存在多种甘露聚糖。这些包括直链甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。在每种情况下，多糖包含甘露糖残基的3-1，4-连接主链,所述甘露糖残基可以由葡萄糖残基置换至多到33%(Yeoman et al., AdvAppl Microbiol, Elsivier (Yeoman等人，《应用微生物学进展》，爱思卩隹尔出版社))。在半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖中，半乳糖残基以a-1，6-键与甘露聚糖主链连接(Moreiraand Filho, Appl Microbiol Biotechnol, 79:165, 2008 (Moreira 和 Filho,《应用微生物学和生物工程》，第79卷，第165页，2008年))。因此，甘露聚糖水解为其组分糖需要内切1,4-0-甘露聚糖酶，该酶水解主链键以生成短链甘露低聚糖,所述低聚糖由1，4- P -甘露糖苷酶进一歩降解为单糖。
[0006]然而，酶通常被清洁组合物中存在的表面活性剂和其他组分抑制，这干扰其移除污溃的能力。例如，衣物洗涤剂中的蛋白酶可能在树胶污溃移除之前降解甘露聚糖酶。此外，甘露聚糖酶可能具有它们呈活性的有限PH和/或温度范围，这可使得它们不适于某些制剂和洗涤条件。因此，需要在清洁组合物的苛刻环境下保留活性的内切-P -甘露聚糖酶。
【发明内容】
[0007]本发明的组合物和方法涉及从黏琼脂芽孢杆菌克隆的内切-(6-甘露聚糖酶KBag Manl)。包含内切-P -甘露聚糖酶的制剂非常适合用作洗涤剂。
[0008]具体地讲，本发明提供了包含内切-(6-甘露聚糖酶的催化结构域的重组多肽，其中所述催化结构域与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90% (90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)相同。在一些实施例中，本发明提供了包含内切-P -甘露聚糖酶的成熟形式的重组多肽，其中所述成熟形式与SEQ ID NO:7的氨基酸系列至少85%(85%、86%、87%、88%、89%、90、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%)相同。在一些优选实施例中，在洗涤剂的存在情况下，所述多肽具有可测量的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，在蛋白酶存在的情况下，所述多肽具有可测量的甘露聚糖酶活性。在一些实施例中，所述多肽和蛋白酶的含量均为约0.1至约10.0ppm0在一些实施例中，所述多肽在5与6之间的PH值保留大于70%的甘露聚糖酶活性。在这些实施例的子集中，所述多肽具有约6的最适pH。在一些实施例中，所述多肽在40°C至55°C范围的温度保留大于70%甘露聚糖酶活性。在这些实施例的子集中，所述多肽具有约50°C的最适温度。在一些实施例中，所述多肽能够水解选自如下的底物:巧克カ冰淇淋、瓜耳胶、刺槐豆胶以及它们的组合。在一些实施例中，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:4-10组成的组中的一种至少95%相同。在一些实施例中，所述多肽还包含氨基端延伸Ala-Gly-Lys。在一些实施例中，所述多肽还包含天然或非天然的信号肽。在一些实施例中，所述多肽还包含至少ー个糖类结合模块。在其他实施例中，所述多肽不包含糖类结合模块。
[0009]本发明还提供了包含至少ー种前述段落的重组多肽的洗涤剂组合物。在一些实施例中，该组合物还包含表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4以及它们的组合。在一些优选的实施例中，表面活性剂为离子表面活性剤。在一些实施例中，离子表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剤、两性离子表面活性剂以及它们的组合。在一些优选的实施例中，组合物还包含酶，所述酶选自蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、3 -葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、a -淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶こ酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-3 -甘露聚糖酶、外切-3 -甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的组合。在一些实施例中，该组合物包含蛋白酶和淀粉酶。在一些实施例中，洗涤剂选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、盘碟洗涤剂和硬质表面清洁洗涤剂。在一些实施例中，洗涤剂处于选自液体、粉末、颗粒状固体和片剂的形式。此外，本发明还提供了水解在表面上的污垢或污溃中存在的甘露聚糖底物的方法，该方法包括:使表面与洗涤剂组合物接触以获得清洁的表面。还提供了清洁纺织物的方法，该方法包括:使玷污的纺织物与洗涤剂组合物接触以获得清洁的纺织物。
[0010]此外，本发明提供了编码前述段落的重组多肽的分离的核酸。还提供了包含与调控序列有效组合的分离核酸的表达载体。另外，还提供了包含表达载体的宿主细胞。在ー些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。本发明还提供了制备内切-(6-甘露聚糖酶的方法，该方法包括:将宿主细胞在合适的条件下在培养基中培养，以形成包含内切-甘露聚糖酶的培养物。在一些实施例中，该方法还包括通过离心从培养物移除宿主细胞，以及通过过滤移除小于IOkDa的碎片，从而获得富含内切-P -甘露聚糖酶的上清液。本发明还提供了用于水解多糖的方法，包括:使包含甘露糖的多糖与上清液接触以获得包含甘露糖的低聚糖。在一些实施例中，多糖选自甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及它们的组合。
[0011]Bag Manl组合物和方法的这些及其他方面将从以下描述显而易见。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1 提供了 pML353 (aprE-Bag Man I)的质粒图谱。
[0013]图2A示出了 Bag Manl在Small&Mighty液体洗漆剂中的清洁性能。图2B示出了Bag Manl在奥妙洁彩粉末洗涤剂中的清洁性能。
[0014]图3示出了 Bag Manl在蛋白酶和淀粉酶存在的情况下的清洁性能。
[0015]图4A提供了 Bag Manl的pH特征图。图4B提供了基准内切-P -甘露聚糖酶(Mannastar?)的 pH 特征图。
[0016]图5A提供了 Bag Manl的温度特征图。图5B提供了基准内切-P -甘露聚糖酶(Mannastar?)的温度特征图。
[0017]图6A示出了 Bag Manl在pH5、50°C保持10分钟后的甘露聚糖酶活性。图6B示出了 Bag Manl在pH8.2、30°C保持30分钟的甘露聚糖酶活性。
[0018]图7A-D提供了 Bag Manl成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)与其他微生物甘露聚糖酶的序列(SEQ ID NO: 11-39)的比对。表7_1通过NCBI和SEQ ID NO列出了同源
甘露聚糖酶。
[0019]图8提供了 Bag Manl的进化系统树。
[0020]图9示出了 Bag Manl的预测功能结构域。Bag Manl的催化结构域(SEQ ID NO: 10)对应于SEQ ID NO:6的残基141-446。标出了两个预测的催化性谷氨酸(E)残基。还示出了 Bag Manl的两个预测的糖类结合模块。
【具体实施方式】
[0021]1.简介
[0022]描述了与从黏琼脂芽孢杆菌菌株C11SB-G17克隆的内切-P -甘露聚糖酶I (BagManl)相关的组合物和方法。所述组合物和方法部分基于基于观察到重组Bag Manl在洗涤剂组合物存在的情况下具有糖基水解酶活性。Bag Manl的这个特征使其非常适合用于多种清洁应用，其中酶可以在洗涤剂组合物中找得到的表面活性剂和其他组分存在的情况下水解甘露聚糖。
[0023]IL 定义
[0024]在详细描述本发明的组合物和方法之前，为清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当与如本领域中所用的其通常含义相一致。
[0025]如本文所用，“甘露聚糖内切-1,4-0-甘露糖苷酶”、“内切-1,4-0-甘露聚糖酶”、“内切-P -1，4-甘露聚糖酶”、“ P -甘露聚糖酶B”、“ P -1, 4-甘露聚糖4-甘露聚糖水解酶”、“内切-P -甘露聚糖酶”、“ ^ -D-甘露聚糖酶”、“ 1，4- P -D-甘露聚糖甘露聚糖水解酶”或“内切-P - 甘露聚糖酶”(EC3.2.1.78)是指能够随机水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1，4- ^ -D-甘露糖苷键的酶。内切-1，4- P -甘露聚糖酶是多种糖基水解酶家族(包括GH26和GH5)的成员。具体地讲，内切-P _甘露聚糖酶构成降解甘露聚糖的一组多糖酶并且指能够裂解包含甘露糖单元的多糖链(即，能够裂解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中糖苷键)的酶。本发明的“内切-β-甘露聚糖酶”可以具有额外的酶活性(如，内切1，4-β -葡聚糖酶、1，4-β -甘露糖苷酶、纤维糊精酶活性等)。[0026]如本文所用，“甘露聚糖酶”、“甘露糖苷酶”、“甘露分解酶”、“甘露聚糖酶多肽”或“甘露聚糖酶蛋白质”指显示甘露聚糖降解能力的酶、多肽或蛋白质。甘露聚糖酶可以是(例如)内切甘露聚糖酶、外切甘露聚糖酶或糖基水解酶。如本文所用，甘露聚糖酶活性可以根据本领域已知的任何方法确定(参见如Lever, Anal.Biochem, 47:248, 1972(Lever,《分析生物化学》第47卷，第248页，1972年)；美国专利N0.6，602，842 ;以及国际专利公开 N0.WO 95/35362A1)。
[0027]如本文所用，“甘露聚糖”为具有由β_1，4-连接的甘露糖构成的主链的多糖；“葡甘露聚糖”为具有由更规则或更不规则交替的β -1, 4连接的甘露糖和葡萄糖构成的主链的多糖；“半乳甘露聚糖”和“半乳葡甘露聚糖”为具有α-1，6连接的半乳糖侧枝的甘露聚糖和葡甘露聚糖。这些化合物可以是乙酰化的。通过完全或部分移除半乳糖侧枝，促进半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解。另外，还通过完全或部分脱乙酰作用，促进乙酰化的甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的降解。可以通过碱或通过甘露聚糖乙酰酯酶移除乙酰基。从甘露聚糖酶释放或通过甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶和/或甘露聚糖乙酰酯酶的组合所释放的低聚物可以进一步由甘露糖苷酶和/或葡萄糖苷酶降解以释放麦芽糖。
[0028]如本文所用，“催化活性”或“活性”定量地描述了给定底物在限定的反应条件下的转化率。术语“残余活性”定义为酶在某组条件下的催化活性与一组组不同条件下的催化活性的比率。术语“比活性”定量地描述了每份酶在限定的反应条件下的催化活性。
[0029]如本文所用，“pH稳定性”描述蛋白经受pH值明显偏离于其稳定性最佳时的pH的有限暴露的性能(例如，高于或低于最佳PH不止一个pH单位，而不会在其活性可测的条件下丧失其活性)。
[0030]如本文所用，短语“洗涤剂稳定性”是指洗涤剂组合物混合物中指定洗涤剂组合物组分(如水解酶)的稳定性。
[0031]如本文所用，“过水解酶”是能够催化会导致形成适于诸如清洁、漂白和消毒的应用的过酸的反应的酶。
[0032]如本文所用，短语“含水组合物”和“含水环境”中使用的术语“含水”指由至少50%的水组成的组合物。含水组合物可以包含至少50%的水、至少60%的水、至少70%的水、至少80%的水、至少90%的水、至少95%的水、至少97%的水、至少99%的水或甚至至少99%的水。
[0033]如本文所用，术语“表面活性剂”指本领域通常认可为具有表面活性性质的任何化合物。表面活性剂通常包括阴离子、阳离子、非离子和两性离子化合物，本文将对其作进一步描述。
[0034]如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。
[0035]术语“氧化稳定性”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下(例如同时暴露于漂白剂或氧化剂或与它们接触时)在给定时间段内保持指定量的酶活性的本发明内切-β -甘露聚糖酶。在一些实施例中，内切-β -甘露聚糖酶在与漂白剂或氧化剂接触给定的时间段(例如，至少约I分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等)之后保持至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β -甘露聚糖酶活性。
[0036]术语“螯合剂稳定性”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下(例如同时暴露于螯合剂或与其接触时)在给定时间段内保持指定量的酶活性的本发明内切-甘露聚糖酶。在一些实施例中，内切-甘露聚糖酶在与螯合剂接触给定的时间段(例如，至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)之后保持至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的内切-β -甘露聚糖酶活性。
[0037]术语“热稳定性”和“热稳定的”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下(例如同时暴露于改变的温度)在暴露于确定的温度持续给定时间段后仍保持指定量的酶活性的本发明内切_β -甘露聚糖酶。改变的温度包括升高或降低的温度。在一些实施例中，内切-甘露聚糖酶在暴露于改变的温度下给定的时间段(例如,至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)之后保持至少约50%、约 60%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 92%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98% 或约99%的内切-β -甘露聚糖酶活性。
[0038]术语“清洁活性”指在本文所公开的甘露糖苷化、水解、清洁或其他过程期间占优的条件下由内切-β_甘露聚糖酶实现的清洁性能。在一些实施例中，通过以下方式确定清洁性能:在使污溃经受标准洗涤 条件之后，应用与酶敏感性污溃(例如冰淇淋、番茄酱、烧烤酱、蛋黄酱、巧克力牛奶、爽身水、刺槐豆胶或瓜耳胶)相关的多种清洁测定法，如通过各种色谱、分光光度法或其他定量方法确定。示例性的测定法包括但不限于WO 99/34011、美国专利N0.6，605, 458和美国专利N0.6，566，114中所述的那些(所有专利均以引用的方式并入本文)以及实例中包括的那些方法。
[0039]如本文所用，术语“清洁的表面”和“清洁的纺织物”分别指污溃去除百分比达受沾污表面或纺织物的至少10%优选至少15%、20%、25%、30%、35%或40%的表面或纺织物。
[0040]术语“内切-甘露聚糖酶的清洁有效量”指在具体清洁组合物中实现所需水平酶活性的本文前述的内切-β_甘露聚糖酶量。此类有效量由本领域的普通技术人员轻易地确定，并且基于多种因素，例如使用的具体内切_β -甘露聚糖酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成以及是否需要液态组合物或干燥(如，颗粒状、棒状)组合物等。
[0041]如本文所用，术语“清洁辅助材料”指经选择用于具体类型的所需清洁组合物和产品形式(如，液体、颗粒、粉末、棒、糊剂、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)的任何液态、固态或气态材料，所述材料还优选地与组合物中使用的内切-β_甘露聚糖酶相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“致密”形式，而在其他实施例中，液态组合物处于“浓缩”形式。
[0042]如本文所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”指用于从待清洁的物品(例如织物、盘子、隐形眼镜、其他固体表面、毛发、皮肤、牙齿等)移除不需要的混合物(如，污垢或污溃)的化学成分的混合物。该组合物或制剂可以处于液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾的形式，这取决于待清洁的表面、物品或织物，以及组合物或制剂的所需形式。[0043]如本文所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”指旨在洗涤介质中用于清洁玷污物体的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/制剂通常包含至少一种表面活性剂，并可以任选地包含水解酶、氧化还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、染蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。[0044]如本文所用，“盘碟洗涤组合物”指用于清洁包括餐具在内的盘碟的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒状和液体形式。在一些实施例中，盘碟洗涤组合物为可用于自动洗碗机的“自动盘碟洗涤”组合物。本发明不意在受限于任何具体类型的盘碟洗涤组合物。实际上，本发明用于清洁任何材料的盘碟(如器皿，包括但不限于碟子、杯子、玻璃杯、碗等)和餐具(如器具，包括但不限于匙、餐刀、餐叉、上菜器具等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸树脂等。本文中所用的术语“盘碟”指器皿和餐具。[0045]如本文所用，术语“漂白”指在合适的pH和温度条件下处理材料(如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间，以实现材料的增亮(即，变白)和/或清洁。适用于漂白的化学品的例子包括但不限于C102、H2O2、过酸、NO2等。[0046]如本文所用，变体内切_β -甘露聚糖酶的“洗涤性能”指变体内切_β -甘露聚糖酶对洗涤的贡献，这种贡献在不向组合物添加变体内切-甘露聚糖酶的情况下向洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。[0047]术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指在家居中实际用于器皿或衣物洗涤剂市场部分中的条件，尤其是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。[0048]如本文所用，术语“消毒”指从表面除去污染物，以及抑制或杀死物品表面上的微生物。本发明不意在受限于任何特定表面、物品或待移除的污染物或微生物。[0049]本文的清洁组合物的“致密”形式最佳地由密度反映，并且就组成而言，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规的洗涤剂组合物中，填料盐以巨大的量存在，通常占总组合物的约17至约35重量％。相比之下，在致密型组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15%的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量％,或更优选不超过约5重量％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施例中，优选的填料盐为硫酸钠。[0050]如本文所用，术语“纺织物”或“纺织物材料”指机织物以及适于转化成或用作纱线、机织织物、针织织物和非织造织物的短纤维和原丝。该术语涵盖由天然纤维以及合成(如，制造)纤维制成的纱线。[0051]如本文所用，术语“纯化的”或“分离的”是指主题分子(例如来自其天然来源(如，黏琼脂芽孢杆菌)的Bag Manl)或其他分子(例如蛋白质、核酸、脂质、培养基组分等)的物理分离。一旦纯化或分离，主题分子可以占样品中材料总量的至少50%，甚至至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多(重量/重量)。[0052]如本文所用，“多肽”指包含多个通过肽键连接的氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用。蛋白质可以任选地经修饰(如，糖基化、磷酰化、酰化、法尼基化、异戊烯基化、磺化等)，以增加功能。如果此类氨基酸序列显示活性，则它们可以称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端方向(即，N —C)提供。[0053]术语“多核苷酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可以是单链或双链的，并可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用。由于遗传密码具有简并性，故多于一个密码子可以用来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外指明，否则核酸序列以5'至3'方向存在。
[0054]如本文所用，术语“野生型”和“天然的”指自然界中存在的多肽或多核苷酸。
[0055]关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的置换、插入或缺失的天然存在多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”指不包括人造的核苷改变的天然存在多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。
[0056]如本文所用，“变体多肽”指通过置换、添加或缺失一个或多个氨基酸，通常利用重组DNA技术，从亲本(或参考)多肽衍生的多肽。变体多肽可与亲本多肽相差少量的氨基酸残基，并可以通过它们的主要氨基酸序列与亲本多肽的同源性/同一性水平进行定义。优选地，变体多肽与亲本多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一'I"生。
[0057]序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。(参见，如 Altschul et al.[1990] J.Mol.Biol.215:403-410 (Altschul 等人，1990年，《分子生物学杂志》，第 215 卷，第 403-410 页);Henikoff et al.[1989]Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915(Henikoff等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第10915页)；Karin et al.[1993]Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873(Karin 等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第 90 卷，第 5873 页)；以及 Higgins et al.[1988]Gene 73:237-244 (Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页))。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可公开获得的。另外，可以使用FASTA对数据库进行搜索(Pearson et al.[1988]Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444-2448(Pearson等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页))。两条多肽基本上相同的一个指标是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是有免疫交叉反应性的。因此，一种多肽与第二多肽基本上相同，例如，在此情况下两种肽仅因保守置换而不同。
[0058]如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽、与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性，或者在严格条件下与其亲本多核苷酸或互补物杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的核苷酸序列同一性。确定同一性百分比的方法是本领域已知的并且上文刚刚描述过。
[0059]术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从...获得”、“可由...获得”、“分离自”和“由...产生”，并且通常是指一种指定材料来源于另一指定材料或者具有可参照另一指定材料描述的特征。
[0060]如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。
[0061]如本文所用，术语“杂交条件”指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据测量杂交的条件的“严格性”程度进行分类。严格性程度可以基于(例如)核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格性”通常在约Tm-5°C (比探针的Tm低5°C)出现；“高严格性”在Tm以下约5-10°C出现；“中等严格性”在探针Tm以下约10_20°C出现；并且“低严格性”在Tm以下约20-25°C出现生。作为另外一种选择或除此以外，杂交条件可以基于杂交和/或一种或多种严格洗涤的盐或离子强度条件，如，6 X SSC=极低严格性，3 X SSC=低至中等严格性，1 X SSC=中等严格性，0.5 X SSC=高严格性。在功能上，最大严格条件性可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近严格同一性的核酸序列；而高严格性条件用于鉴定与探针具有约80%或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常期望使用相对严格的条件以形成杂交体(如，使用相对低的盐和/或高温度条件)。如本文所用，严格条件定义为 50°C和 0.2XSSC (IXSSC=0.15M NaCl，0.015M 柠檬酸钠，pH7.0)。
[0062]在关于至少两条核酸或多肽的上下文中，短语“实质上相似”和“实质上相同”意指，多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%的同一性，或者不包括在不增加功能性的情况下仅为避开本描述所作的氨基酸置换、插入、缺失或修饰的序列。
[0063]如本文所用，“表达载体”指含有编码指定多肽并与合适控制序列可操作连接的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现多肽在适当的宿主中的表达。这种控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的可选择的操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。该载体可为质粒、噬菌体颗粒或只是潜在的基因组插入物。一旦转化入适当的宿主中，该载体可以独立于宿主基因组而复制并发挥功能，或者在一些情况下整合入基因组自身中。
[0064]术语“重组”指遗传物质(即，核酸、它们编码的多肽以及包含此类多核苷酸的载体和细胞)经改性以改变其序列或表达特性，例如通过将编码序列突变以获得改变的多肽、将所述编码序列与另一个基因的编码序列融合融合、将基因置于不同启动子的控制下、在异源生物中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于其天然表达谱的方式使基因进行条件性表达或组成型表达等。通常，重组核酸、多肽和以它们为基础的细胞已受人类操纵，从而它们与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不同。
[0065]“信号序列”指与多肽的N-端部分结合的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌。成熟形式的细胞外蛋白质不存在信号序列，信号序列在分泌过程期间被切除。
[0066]术语“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的允许轻易选择那些包含已引入核酸或载体的宿主的基因。选择标记的例子包括但不限于抗微生物物质(如潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(诸如营养优势)的基因。
[0067]如本文所用，术语“调控因子”指控制核酸序列表达的某方面的遗传元件。例如，启动子为有利于引发可操作地连接的编码区的转录的调控因子。另外的调控因子包括剪接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。
[0068]如本文所用，“宿主细胞”通常是以使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达所需的蛋白质变体。在编码前形式或原形式蛋白质变体的载体的情况下，当表达时，这种变体一般从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。
[0069]在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的方法包括本领域已知的原生质体转化法、氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法等。(参见Changand Cohen[1979]Mol.Gen.Genet.168:111-115 (Chang 和 Cohen, 1979 年，《分子遗传学与普通遗传学》第 168 卷,第 111-115 页)；Smith et al.[1986]Appl.Env.Microbiol.51:634(Smith等人，1986年,《应用与环境微生物学》,第51卷,第634页);以及Ferrari等人载于Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corporation, pp.57-72, 1989 (Harwood,〈〈芽抱杆菌属》，普莱南出版公司，第57-72页，1989年)中的综述文章)。
[0070]如本文所用，术语“选择性标记”或“选择性基因产物”是指编码酶活性的基因的使用，该酶活性给表达该选择性标记的细胞赋予抗生素或药物抗性。
[0071]其他科技术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同(参见例如 Singleton 和 Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(《微生物学与分子生物学词典》)，第2版，纽约约翰威立出版公司(John Wiley andSons, NY) 1994 ;以及 Hale 和 Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (《哈普柯林斯生物学词典》)，纽约哈拍永久出版社(Harper Perennial, NY) 1991 )。
[0072]除非文中另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。
[0073]如本文结合数值所用，术语“约”指数值的-10%至+10%的范围。例如，短语“约6的pH值”指从5.4至 6.6的pH值。
[0074]标题是为了便利而提供的，并且不应理解为限制性的。在一个标题下包括的描述可以适用于整篇说明书。
[0075]II1-BaR Manl多肽、多核苷酸、载体和宿主细胞
[0076]A.Bag Manl 多狀
[0077]在一个方面，本发明的组合物和方法提供重组Bag Manl内切-β-甘露聚糖酶多肽、其片段、或其变体。示例性Bag Manl多肽从得自黏琼脂芽孢杆菌的多核苷酸重组表达。成熟Bag Manl多肽具有如SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列。相似地，基本上相同的BagManl多肽可以存在于自然界中，如在黏琼脂芽孢杆菌的其他菌株或分离株中。这些和其他分离的Bag Manl多肽均由本发明的组合物和方法涵盖。
[0078]在一些实施例中，分离的Bag Manl多肽为变体Bag Manl多肽，其与示例性BagManl多肽具有指定程度的氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%序列同一性。可以通过氨基酸序列对比确定序列同一性，如本文所述，例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL的程序。
[0079]在某些实施例中，重组产生Bag Manl多肽，而在其他实施例中，Bag Manl多肽以合成方式产生，或者从天然来源(黏琼脂芽孢杆菌)中纯化获得。
[0080]在某些其他实施例中，分离的Bag Manl多肽包括基本上不影响多肽的结构和/或功能的置换。示例性的置换为保守突变，如表1中所汇总。
[0081]表1.氨基酸置换
[0082]
【权利要求】
1.ー种包含内切-(6-甘露聚糖酶的催化结构域的重组多肽，其中所述催化结构域与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%相同。
2.ー种包含内切-(6-甘露聚糖酶的成熟形式的重组多肽，其中所述成熟形式与SEQID NO:7的氨基酸序列至少85%相同。
3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述多肽在洗涤剂存在的情况下具有甘露聚糖酶活性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在蛋白酶存在的情况下具有甘露聚糖酶活性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在5和6之间的pH值保留大于70%的甘露聚糖酶活性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽在40°C至55°C的温度范围内保留大于70%的甘露聚糖酶活性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽能够水解选自巧克カ冰淇淋、瓜耳胶、刺槐豆胶以及它们的组合的底物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组多肽，其中所述氨基酸序列与由SEQIDN0:4-10组成的组中的一条序列至少95%相同。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组多肽，其还包含氨基末端延伸Ala-Gly-Lys。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组多肽，其还包含天然或非天然信号肽。
11.根据权利要求1、`3_7中任一项所述的重组多肽，其中所述多肽不进一歩包含糖类结合模块。
12.一种洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1-11中任一项所述的重组多肽。
13.根据权利要求12所述的洗涤剂组合物，其还包含表面活性剤。
14.根据权利要求13所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂为离子表面活性剤。
15.根据权利要求14所述的洗涤剂组合物，其中所述离子表面活性剂选自阴离子表面活性剤、阳离子表面活性剤、两性离子表面活性剂以及它们的组合。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的洗涤剂组合物，其还包含选自以下的酶:蛋白酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、3 -葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、a -淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、卡拉胶酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶こ酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-P -甘露聚糖酶、外切-P -甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶以及它们的组合。
17.根据权利要求16所述的洗涤剂组合物，其中所述组合包含蛋白酶和淀粉酶。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂选自衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、盘碟洗涤剂和硬质表面清洁洗涤剂。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂选自液体、粉末、颗粒状固体和片剂。
20.一种水解存在于表面上的污垢或污溃中的甘露聚糖底物的方法，其包括:使所述表面与根据权利要求12-19中任一项所述的洗涤剂组合物接触以产生清洁的表面。
21.一种纺织物清洁方法，其包括:使沾污的纺织物与根据权利要求12-20中任ー项所述的洗涤剂组合物接触以产生清洁的纺织物。
22.—种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1-11中任一项所述的重组多肽。
23.ー种表达载体，所述表达载体包含与调控序列有效组合的根据权利要求22所述的分离的核酸。
24.ー种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求23所述的表达载体。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞。
26.—种产生内切-(6-甘露聚糖酶的方法，其包括:将根据权利要求24或25所述的宿主细胞在适合的条件下在培养基中培养，以产生包含所述内切-P -甘露聚糖酶的培养物。
27.根据权利要求26所述的方法，其还包括通过离心从所述培养物移除所述宿主细胞,并通过过滤移除小于IOkDa的碎片以产生富含内切-(6-甘露聚糖酶的上清液。
28.一种水解多糖的方法，其包括:使包含甘露糖的多糖与根据权利要求27所述的上清液接触以产生包含甘露糖的寡糖。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述多糖选自甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及它们的组合。
30.ー种食物或饲 料组合物和/或食物添加剤，其包含根据权利要求1-11中任ー项所述的多肽。
31.一种制备食物或饲料组合物和/或食物或饲料添加剂的方法，其包括将本发明的所述多肽与ー种或多种食物或饲料和/或食物或饲料添加剂成分混合。
32.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽的用途，其用于制备食物或饲料组合物和/或食物或饲料添加剂和/或食物或饲料和/或宠物食物。
33.根据权利要求30所述的食物或饲料组合物，其中所述食物或饲料组合物为发酵饮料如啤酒。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述食物或饲料组合物为发酵饮料如啤酒，并且其中所述ー种或多种食物成分包含麦芽或辅助材料。
35.根据权利要求1-11中任一项所述的多肽的用途，用于制备发酵饮料如啤酒。
36.ー种提供发酵饮料的方法,其包括使麦芽衆和/或麦芽汁与根据权利要求1-11中任一项所述的多肽接触的步骤。
37.ー种提供发酵饮料的方法，其包括以下步骤: a)制备麦芽衆， b)过滤所述麦芽浆以得到麦芽汁，以及 c)使所述麦芽汁发酵而得到发酵饮料，例如啤酒 其中将根据权利要求1-11中任一项所述的多肽添加至: 1.步骤(a)的所述麦芽浆和/或 i1.步骤(b)的所述麦芽汁和/或 ii1.步骤(c)的所述麦芽汁。
38.一种通过根据权利要求34或36所述的方法生产的发酵饮料，例如啤酒。
39.根据权利要求35所述的用途、根据权利要求34或36所述的方法或根据权利要求38所述的发酵饮料，其中所述发酵饮料为啤酒，如全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡爱尔啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二类啤酒)、第三类啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，而且还包括可供选择的谷类和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味`麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒等。
【文档编号】A23K1/00GK103608356SQ201280021135
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年4月27日 优先权日:2011年4月29日
【发明者】B·E·琼斯, M·科尔克曼, Z·钱, B·S·劳尔森, K·M·克拉格, S·普莱斯鲁斯, Z·于, L·M·贝比, M·埃斯塔布鲁克 申请人:丹尼斯科美国公司