线虫的生物控制的制作方法

线虫的生物控制的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用芽孢杆菌菌株作为杀线虫剂的方法和相关组合物。
【专利说明】线虫的生物控制
[0001]相关申请
[0002]本申请要求在35U.S.C.第119节下保护下列临时专利申请的利益:2011年7月25日提交的美国临时申请号61/511，508、2011年11月4日提交的美国临时申请号61/556，016和2012年6月19日提交的美国临时申请号61/661，763。将上述临时专利申请的每一个通过引用整体并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及植物寄生线虫的控制。
[0004]发明背景
[0005]植物寄生线虫引起对多种农作物的重大损害，导致据估计每年变化在5%至12%内的全球农作物产量损失。线虫对根的损害非常普遍，并且导致矮小植物，所述植物具有更小的根系统，在其叶中显示矿物质不足的症状并且容易枯萎。线虫造成的损害也使植物易受多种植物致病性真菌和细菌感染。
[0006]为了抵御和控制线虫，农民通常施用化学杀线虫剂。这些药品从气体和液体熏蒸例如甲基溴化物和氯化苦变化至有机磷酸酯和氨基甲酸酯例如硫磷嗪和草氨酰的应用。这些化学杀线虫剂的使用已持续了数十年。尽管化学杀线虫剂控制目标线虫的效力较高，但存在对这些方法的严重限制。一个限制是化学杀线虫剂不能作用于已穿透根的线虫。另一个限制是与化学杀线虫剂的生产和使用相关的危险。化学杀线虫剂是高毒性的并且可导致人中毒和死亡。因此，许多国家已限制，有时禁用某些杀虫剂。甲基溴化物特别地因其臭氧耗尽效应而在大多数国家被禁用。
[0007]由于这些限制和禁用，因而缺乏有力的线虫解决方案。本发明提供了安全有效的方式来替代或减少化学杀虫剂的使用。其在提供抑制线虫穿透进入植物根和随后阻止克服该初始屏障的那些线虫成熟的解决方案中也是独特的。
[0008]发明概述
[0009]本发明提供了用于控制植物寄生线虫的方法和组合物。本发明还提供了用于控制线虫的方法，包括给植物、植物部分和/或植物的种植场所施用有效量的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QST713、枯草芽孢杆菌QST713的突变体和/或枯草芽孢杆菌QST713的代谢产物。在一些实施方案中，将枯草芽孢杆菌QST713以发酵产物来施用，所述产物包括枯草芽孢杆菌QST713、其代谢产物和任选地残留发酵液。在一个实施方案中，发酵产物大体上由枯草芽孢杆菌QST713细胞或枯草芽孢杆菌QST713的突变体的细胞组成。
[0010]本发明的基于枯草芽孢杆菌的组合物减少根结线虫的卵，减少根结线虫的植物穿透，和/或抑制穿透植物的根结线虫的成熟。在一些实施方案中，目标线虫(即，被控制的线虫)是致病根结线虫。在某些情况下，线虫来自根结线虫属的种。在其它实施方案中，本发明的组合物的目标线虫是孢囊线虫。在某些情况下，目标线虫是来自异皮线虫属的种。在其它实施方案中，目标线虫是来自球胞囊属的种。在其它实施方案中，目标线虫来自下列物种:针线虫属(Paratylenchus)、短体属(Pratylenchus)、拟毛刺线虫属(Paratrichodorus)、小环线虫属(Criconemella)、螺旋线虫属(Helicotylenchus)、根结线虫属(Meloidogyne)和轮线虫属(Criconemoides)。在具体情况下,线虫是假强壮螺旋线虫(Helicotylenchus pseudorobustus)(螺旋 HP)或双角螺旋线虫(Helicotylenchusdigonicus)(螺旋 HD)。
[0011]在一些实施方案中，将上述组合物与至少一种其它的杀虫剂例如杀真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂或除草剂混合。在一个实施方案中，杀虫剂是杀线虫剂。在某些实施方案中，将本发明的基于枯草芽孢杆菌的组合物与可商购获得的配制的杀线虫剂混合在罐中。在其它实施方案中，将基于枯草芽孢杆菌的组合物与活性成分(即，具有抗真菌、昆虫、线虫或杂草活性的化合物)混合，随后用惰性物质进行配制，以便多种活性物形成一个产品。在一个实施方案中，另一种杀线虫活性成分是氨基甲酸酯或有机磷酸酯。在另一个实施方案中，其是生物杀线虫剂。
[0012]本发明提供了包含枯草芽孢杆菌QST713或其突变体和第二线虫控制剂的组合物。在一些实施方案中，第二线虫控制剂是氨基甲酸酯或有机磷酸酯。
[0013]本发明还提供了本发明的组合物的任一种，所述组合物还包含制剂惰性物质或其它制剂成分，例如多糖(淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、蛋白质，例如乳清蛋白、肽、树胶)、糖类(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂质(卵磷脂、植物油、矿物油)、盐(氯化钠、碳酸钙、柠檬酸钠)和硅酸盐(粘土、无定形硅、烟雾/沉淀的硅酸盐、硅酸盐)。在一些实施方案中，例如其中将组合物用于土壤的那些实施方案中，本发明的组合物包含载体，例如水或矿物质或有机材料，例如泥炭，其有利于组合物掺入土壤。在一些实施方案中，例如其中组合物用于种子处理或用作根部浸溃的那些实施方案中，载体是有利于组合物粘附至种或根的粘合剂或粘着剂。在其中组合物用作种子处理的另一个实施方案中，制剂成分是着色剂。在其它组合物中，制剂成分是防腐剂。
[0014]在一些实施方案中，将组合物用于植物、植物部分或植物的种植场所，例如土壤，然后种植。在其它实施方案中，在种植时使用组合物。在其它实施方案中，在种植后使用组合物。
[0015]在某些实施方案中，在应用组合物之前，进行包括鉴定植物和/或用于生长的植物种植场所需要处理的步骤。在一些实施方案中，鉴定包括确定用于植物生长的场所超过线虫侵袭的经济阈值。
[0016]在一些实施方案中，本发明包括包含枯草芽孢杆菌QST713或其突变体以及其用作杀线虫剂的说明书的试剂盒。在一些实施方案中，这些说明书是产品标签。在一些实施方案中，说明书指导用户以约2xl012至约6xl013cfu/英亩的施用率施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。在一些实施方案中，这些说明书是为将枯草芽孢杆菌用作与化学杀线虫剂组合的杀线虫剂的用途。在某些情况下，说明书指导用户以比当用作独立处理时产品标签上推荐的化学杀线虫剂的施用率更低的施用率施用化学杀线虫剂。在一些其它实施方案中，说明书指导用户将枯草芽孢杆菌QST713或其突变体施用至与植物根接触的土壤，施用至植物基部的土壤，或施用至围绕植物基部的特定距离内(例如，植物基部周围约5cm、约 10cm、约 15cm、约 20cm、约 25cm、约 30cm、约 35cm、约 40cm、约 45cm、约 50cm、约 55cm、约60cm、约 65cm、约 70cm 、约 75cm、约 80cm、约 85cm、约 90cm、约 95cm、约 IOOcm 或更多的距离内)的土壤。说明书还可指导用户以约10至约18天的间隔和/或以约7xl05至约IxlO7Cfu/克土壤/施用的施用率来进行枯草芽孢杆菌QST713或其突变体的多次施用。说明书还可指导用户在种植时施用与化学杀线虫剂组合的枯草芽孢杆菌QST713或其突变体和在随后的施用中单独施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。在一个实施方案中，说明书指导用户以约7xl05至约IxlO7Cfu/克土壤的施用率以单次施用的形式施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。在另一个实施方案中，说明书指导用户以约IxlO5至约3xl06cfU/克土壤的施用率，多次施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
[0017]附图概述
[0018]图1显示QST713全发酵液处理对根结线虫感染的根的虫瘿(galling)的作用。注意QST713全发酵液在本图和其它图中被称为AQ713。未处理对照在图中被称为“UTC”。
[0019]图2显示以不同施用率利用SERENADE? ASO产品的处理对根结线虫感染的
幼苗的作用。具体地，结果显示根虫瘿和穿透的程度以及对线虫发育的影响。每一组3个对应于每一个处理(Serenade AS05.0%、2.5%和1.0%和UTC)的第一条柱代表虫瘦，第二条柱代表线虫穿透，第三条柱代表线虫发育。
[0020]图3代表相较于未处理的植物(在图中称为UTC)，每一利用不同批次的AQ713全发酵液处理的植物的根结线虫卵。 [0021]图4代表相较于未处理的植物(在图中称为UTC)和仅利用INLINE产品处理的植物，每一利用单独的或与INLINE产品(具有1，3-二氯丙烯+氯化苦的活性成分)组合的
SERENADE SOIL?产品处理的植物的根结线虫卵。表2中显示的不同处理在图中被称为
T1、T2、T3 和 Τ4。
[0022]图5代表用AQ713全发酵液处理的并且以I天、6天、9天和14天的间隔(Τ1、Τ6、T9和Τ14)用线虫幼虫攻击的每植物根的根结线虫的穿透(图5Α)和每植物根的根结线虫的发育(图5Β)。在图5Α中，虚线表示未处理对照(“UTC”)而实线表示利用AQ713的处理。
[0023]图6显示在第O天(TO)用AQ713全发酵液浸透植物并且在1、2或3周(Τ7、Τ14或Τ21)用线虫攻击后每植物根由根结线虫产生的总卵数。未处理对照(UTC)是每一个接种日期提供每一对条柱中的第一条柱。每一对中的第二条柱表示利用AQ713处理的结果。
[0024]图7代表通过SERENADE? ASO产品的单次或多次施用处理的植物的虫瘿等级评定(图7A)、每根的总卵数(图7B)和新鲜苗重(图7C)。
[0025]图8代表通过以不同的剂量单次施用SERENADE? ASO处理的植物的每克根
的总卵数。
[0026]发明详述
[0027]本文中的所有公开案、专利和专利申请包括本文中的任意附图和附录通过引用并入本文，其引用程度就如同将每一个别公开案或专利申请特定且个别地通过引用并入。
[0028]下列描述包括可用于理解本发明的信息。其不是本文中提供的任何信息是现有技术水平或与本发明相关或特别地或明确地引用的任何公开案是现有技术水平的承认。
[0029]SERENADE产品(EPA登记号69592-12)包含枯草芽孢杆菌的唯一专利菌株(菌株QST713)和许多不同脂肽，所述脂肽协同作用以破坏疾病病原体，提供优良的抗微生物活性。SERENADE'?产品用于保护植物例如蔬菜、水果、坚果和藤本作物免受疾病例如火烧病、灰霉病、白霉病、锈病、菌核病、白粉病、细菌性斑腐病和白霉侵害。SERENADE?产品可以以液体或干燥制剂形式获得，其可用作叶和/
或土壤处理。SERENADE? 产品包括 SERENADE? aso、SERENADE?
MAX和SERENADE SO丨L?的EPA Master标签的拷贝可通过国际杀虫剂信息检索系统,(NPIRS?) USEPA/0PP杀虫剂产品标签系统(PPLS)公开获得。
[0030]SERENADE? ASO (Aqueous Suspension-Organic)包含 1.34% 的干燥 QST7I3作为活性成分和98.66%的其它成分。SERENADE'? ASO被配制为包含最少IxlO9Cfu/g的QST713，而QST713的最大量已被测定为3.3X101(lCfu/g。SERENADE? ASO的替代商品名称包括 SERENADE BIOFUNGICIDE?> serenade SOIL?和 SERENADE?GARDEN DISEASE。关于进一步信息，参见日期为2010年I月4日的SEREN ADE? ASO的U.S.EPA Master标签和SERENADE SOIL?,将其每一个通过引用整体并入本文。
[0031]SERENADE? MAX包含14.6%的干燥QST713作为活性成分和85.4%的其它
成分。SERENADE? MAX被配制为包含最少7.3xl09cfu/g的QST713，而QST713的最
大量已被测定为7.9Xl01Qcfu/g。关于进一步信息，参见SERENADE?: MAX的U.S.EPAMaster标签，将其通过引用整体并入本文。
[0032]枯草芽孢杆菌QST713、其突变体、其上清液及其脂肽代谢产物以及它们用于控制植物病原体和昆虫的方法全面地描述于美国专利号6,060,051;6, 103，228;6, 291, 426;6，417，163和6，638，910中，为`了其教导的每件事，将每一个所述专利明确且完整地通过引用并入本文。在这些美国专利中，菌株被称为AQ713，其与QST713同义。枯草芽孢杆菌QST713于1997年5月7日在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款下在登录号B21661下保藏在NRRL。本说明书中关于QST713的任何指称都是指存在于
SERENADE?产品中的枯草芽孢杆菌QST713 (aka AQ713)，其以NRRL登录号B21661保
藏；或在模拟SERENADE?产品产生的条件下在生物反应器或摇瓶中制备。
[0033]上述专利描述了抗线虫漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的N2株的枯草芽孢杆菌QST713全发酵液的上清液的测试。这样的测试显示上清液不存在杀线虫活性。
[0034]在于1998年提交美国专利申请号09/074，870 (其对应于上述专利)时，基于经典的、生理学、生物化学和形态学方法将QST713菌株命名为枯草芽孢杆菌。自那以后，特别地鉴于遗传学和测序技术的进步，芽孢杆菌属的分类学一直在演化，从而物种命名主要基于DNA序列而非1998年使用的方法。在比对来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)FZB42、枯草芽孢杆菌168和QST713的蛋白质序列后，约95%的在解淀粉芽孢杆菌FZB42中发现的蛋白质与在QST713中发现的蛋白质具有85%或更大的同一性；然而仅有35%的枯草芽孢杆菌168中的蛋白质与QST713中的蛋白质具有85%或更多的同一性。然而，即使在遗传上具有更大的可靠性，但在相关科学文献和监管文件中仍然存在分类学模糊性，这反映了在过去15年中芽孢杆菌分类学的演化理解。例如，基于枯草芽孢杆菌菌株FZB24的杀虫产品(其与QST713的亲缘关系和与FZB42的亲缘关系一样相近)，在环境保护局的文件中被分类为解淀粉枯草芽抱杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens)。由于命名法中的这些复杂性，取决于文献，该特定的芽孢杆菌种存在各种命名，如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和解淀粉枯草孢杆菌变种。因此，我们保留了 QST713的枯草芽孢杆菌命名而非将其改变成解淀粉芽孢杆菌，正如目前仅基于序列比较和推断的分类法所预期的。
[0035]术语“突变体”是指源于QST713的遗传变体。在一个实施方案中，突变体具有QST713的所有鉴定特征。在特定情况下，突变体对线虫的控制至少与亲本QST713菌株一样。在另一个实施方案中，突变体是具有这样的基因组序列的遗传变体，所述基因组序列与QST713菌株具有大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约98%或大于约99%的序列同一性。突变体可通过用化学药品或辐照处理QST713细胞，或通过从QST713细胞的群体选择自发突变体(例如抗噬菌体突变体)或通过本领域技术人员公知的其它方法获得。
[0036]本发明的组合物可通过按照本领域公知的方法，包括通过使用美国专利号6，060，051中描述的培养基和其它方法，培养枯草芽孢杆菌QST713或其突变体来获得。常规大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。在临近发酵结束时，由于营养物被耗尽，枯草芽孢杆菌细胞开始从生长期过渡至芽孢形成期，从而发酵终产物大部分是孢子、代谢产物和残留发酵培养基。芽孢形成是枯草芽孢杆菌的自然生命周期的部分，并且通常由细胞响应营养限制而引发。发酵被构造来获得高水平的枯草芽孢杆菌的菌落形成单位并促进芽孢形成。可直接使用由发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢产物，或通过常规工业方法 例如离心、正切流动过滤、深度过滤和蒸发来浓缩。发酵液和发酵液浓缩物在本文中都称为“发酵产物”。本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，例如通过渗滤法洗涤浓缩的发酵液以除去残留发酵液和代谢产物。
[0037]发酵液或发酵液浓缩物可在添加载体或不添加载体的情况下，使用常规干燥法或方法例如喷雾干燥、冷冻干燥、托盘干燥(tray drying)、流化床干燥、滚筒干燥或蒸发来进行干燥。
[0038]所得的干燥产物可以例如通过研磨或造粒进一步加工，以获得特定粒度或物理形式。还可在干燥后添加下文中描述的载体。
[0039]本发明的芽孢杆菌的新型变体和菌株的发酵液的无细胞制剂可通过本领域已知的任何方法例如发酵液的提取、离心和/或过滤来获得。本领域技术人员将理解，所谓的无细胞制剂可以存在细胞，但大体上是无细胞的或基本上是无细胞的，这取决于用于除去细胞的技术(例如，离心速度)。可干燥所得的无细胞制剂和/或用帮助其向植物或植物生长介质的施用的组分配制其。上述用于发酵液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制剂。
[0040]可按照美国专利号6，060，051中所示的方法获得枯草芽孢杆菌的代谢产物。如本文中所用，术语“代谢产物”可指半纯化的和纯的或基本上纯的代谢产物，或指还未与枯草芽孢杆菌分离的代谢产物。在一些实施方案中，在通过离心发酵液制备无细胞制剂后，代谢产物可通过大小排阻过滤例如S印hadex树脂，包括LH-20、G10以及G15和G25来进行纯化，所述大小排阻过滤基于分子量截留值将代谢产物分组为不同的级分，例如低于约2000道尔顿、低于约1500道尔顿、低于约1000道尔顿等的分子量，因为脂肽为800道尔顿至1600
道尔顿。
[0041]上文中描述的用于配制发酵液体的浓缩方法和干燥技术也可适用于代谢产物。
[0042]本发明的组合物可包含添加至包含细胞、无细胞制剂或代谢产物的组合物的制剂惰性物质以改善效率、稳定性和可用性和/或有利于加工、包装和最终应用。这样的制剂惰性物质和成分可包括载体、稳定剂、营养物或物理性质改性剂，可单独地或组合地添加。在一些实施方案中，载体可包括液体材料例如水、油和其它有机或无机溶剂以及固体材料例如矿物质、聚合物或聚合物复合物(生物来源或通过化学合成的)。在一些实施方案中，载体是有利于组合物粘附至植物部分例如种子或根的粘合剂或粘着剂。参见，例如，Taylor, A.G.,等人，“Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments，，，Annu.Rev.Phytopathol.28:321-339(1990)。稳定剂可包括消结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。营养物可包括碳、氮和磷源例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改性剂可包括填充剂、湿润剂、增稠剂、pH调节剂、流变学改性剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中，可在不使用任何其它配制制剂的情况下，在利用水作为稀释剂或不利用水作为稀释剂的情况下直接使用包含通过发酵产生的细胞、无细胞制剂或代谢产物的组合物。在一些实施方案中，在浓缩发酵液后并且在干燥期间和/或之后添加制剂惰性物质。
[0043]本发明的组合物可包括载体，其为添加至组合物中的配制成分，包括含有脂肽的发酵产物、无细胞脂肽制剂或脂肽的纯化的、半纯化的或粗制提取物，以改善回收、效率或物理性质和/或帮助包装和施用。可单独地或组合地添加这样的载体。
[0044]可将本发明的组合物与其它化学药品和非化学添加剂、佐剂和/或处理混合和/或与它们轮流使用，其中这样的处理包括但不限于化学和非化学杀真菌剂、杀虫剂、杀螨药、杀线虫剂、肥料、营养物、矿物质、生长素、生长刺激物等。
[0045]可与本发明的基于枯草芽孢杆菌的组合物混合的杀线虫剂可以是化学或生物杀线虫剂。如本文中所用，术语“化学杀线虫剂”不包括薰剂，术语“薰剂”包括在种植前施用于土壤和通过土壤(在土壤空气和/或土壤水中)散播的广谱杀虫化学药品，并且可作为气体施用，例如甲基溴化物、挥发性液体例如氯化苦或挥发性固体例如福美甲酯。
[0046]在一些实施方案中，化学或生物杀线虫剂是商购可得的配制的产品，并且在罐中与本发明的组合物混合和/或与本发明的组合物轮流使用。在其它实施方案中，在配制(与惰性物质)之前将化学或生物杀线虫剂的活性成分(无惰性物质)与基于枯草芽孢杆菌QST713的组合物混合，以便组合物形成一种配制产品。
[0047]用于这样的混合物或轮流程序的化学杀线虫剂是氨基甲酸酯、氨基甲酸肟酯和有机磷杀线虫剂。氨基甲酸酯杀线虫剂包括苯菌灵、呋喃丹(FURADAN?)、丁硫克`百威和地虫威。氨基甲酸肟酯包括棉铃威、涕灭威(TEMIK?或作为来自Syngenta
的AVICTA? Complete Pak种子处理的部分)、涕灭砜威(STANDAK?)、草氨酰
(VYDATE?)、硫双威(来自Bayer CropScience的AERIS?种子施用系统的部分)和环线威。有机磷杀线虫剂包括丰索磷(DANSAN1T?)、灭克磷、(MOCAP?)、除线
特、苯线磷、丁硫环磷、磷胺、硫线磷、毒死蝶、除线磷、乐果、噻唑磷、速杀硫磷、isamidofos、氯唑磷、甲拌磷、磷虫威、特丁磷、硫磷嗪、三唑磷、imicyafos和基灭姆磷。每一种化合物后的附加说明的名称是上述化学药品的每一种的代表性商业制剂。用于这样的混合物其它化
学杀线虫剂包括螺虫乙酯(MOVE.NTO?)、M0N37400杀线虫剂和氟虫腈。
[0048]这样的混合物或轮流程序中使用的生物杀线虫剂包括壳多糖和尿素混合物、怄肥浸溃液和茶剂(充气的和非充气的)；包含真菌疣孢漆斑菌和/或来自其的代谢产物的
组合物(商购可获得为DITERA?)、包含真菌淡紫色拟青霉的组合物(商购可获得为例如MELOCON?或B10ACT);包含细菌Pasteuria、包括P.USgae的组合物(商购可
获得为例如ECONEM? );包含来自芽孢杆菌属的细菌、包括坚硬芽胞杆菌(Bacillus
firmus)的组合物(包括 1995年5月 29 日以CNMC 1-1582保藏在Collection Nationale deCultures de Microorganismesj Institute Pasteur，France 的菌株，并且商购可得为例如
VOTIVO?:)、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽胞杆菌、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)(包
括1999年I月14日以B-30087保藏在NRRL的菌株及其突变体)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus);和包含杀线虫链霉菌的种(Streptomycete sp.)例如利迪链霉菌(Streptomyces
lydicus)的组合物(商购可得为ACTINOVATE? )。生物杀线虫剂还包括基于植物
的杀线虫剂例如基于印度楝植物的产品(包括来自植物的种子或油)或印楝素、印度楝种
子的次级代谢产物、基于芝麻油的产品(例如DRAGONFIRE?)，香芹酚和基于植物
提取物的产品(例如NEMA-Q?,获自智利的皂树属的树)。生物杀线虫剂还包括由细
菌产生的分离的化合物例如mectins,其是由阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis)产生的，包括阿巴克丁(由阿巴克丁 Bla和Blb的组合组成)和阿佛菌素B2a，和harpin蛋白，最初在解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)中鉴定的,包括harpinEA和harpina e。
[0049]本发明的组合物用于控制植物寄生线虫例如根结线虫、孢囊线虫、腐线虫和环线虫,包括根结线虫属的种、异皮线虫属的种、Globodera的种、短体属的种和小环线虫属的种。组合物还用于控制杉木半穿刺线虫病(Tylenchulus semipenetrans)、毛刺属的种、长针线虫属的种、肾形线虫的种、剑线虫属的种、刺线虫的种(例如刺线虫)、拟环线虫属的种(Criconemoides spp.)、矮化线虫的种(Tylenchorhynchus spp.)、纽带线虫的种(Hoplolaimus spp.)、盘旋线虫的种(Rotylenchus spp.)、螺旋线虫的种(Helicotylenchus spp.)(例如伪强壮螺旋线虫(Spiral HP)和双角螺旋线虫(Helicotylenchus digonicus) (Spiral HD))、穿孔线虫的种(Radopholus spp.)(例如穿孔线虫(R.citrophilis)和类似穿孔线虫(R.similis))、鳞球莖莖线虫的种(Ditylenchusspp.)、拟毛刺线虫(Paratrichodorus spp.)和其它植物寄生线虫。在一些实施方案中，目标是孢囊线虫例如大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)、小麦禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)(小麦禾谷孢囊线虫)、南方根结线虫(Meloidigyne incognita)(棉花(或南方)根结线虫)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pallida)(马铃薯胞囊线虫)。在其它实施方案中，目标是根结线虫例如南方根结线虫(M.1ncognita)(棉花根结线虫)、爪哇根结线虫(M.javanica)(爪哇根结线虫)、北方根结线虫(M.hap I a)(北方根结线虫)和花生根结线虫(M.arenaria)(花生根结线虫)。
[0050]如本文中所用，术语“控制”意指杀死、数量的减少和/或减少生长、摄食或正常生理发育，包括:对于根结线虫，穿透根和在根内发育的能力。有效量是指这样的量:能够显著地减少线虫生长、摄食、根穿透、在根中成熟和/或一般正常线虫的生理发育和/或由线虫感染引起的植物宿主症状例如虫瘿或减少的根和/或植物生长。在一些实施方案中，症状和/或线虫减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%。
[0051]本发明的组合物用于处理多种农业和/或园艺作物，包括生长为了种子、生产和园林美化的那些植物。可使用本发明的组合物处理的代表性植物包括但不限于下列植物:球茎蔬菜；谷粒；柑橘属(例如葡萄柚、柠檬和柑橘)；棉花和其它纤维农作物；葫芦；果菜类；叶用蔬菜(例如芹菜、结球莴苣和散叶莴苣以及菠菜)；豆荚科；油料种子作物；花生；仁果(例如苹果和梨)；核果(例如杏仁、核桃和胡桃)；根菜类；块茎菜类；球茎菜类；烟草、草莓和其它浆果；油菜作物(例如绿花椰菜和包菜)；葡萄；菠萝；和有花植物、花坛植物和观赏植物(例如蕨类植物和玉簪属)。本发明的组合物还用于处理多年生植物，包括栽植作物例如香蕉和咖啡以及存在于森林、公园或园林美化中的那些植物。
[0052]将本文中描述的组合物施用至植物、植物部分例如种子、根、根茎、球根、球茎或块茎，和/或植物或植物部分在其上生长的场所例如土壤，以控制植物寄生线虫。可将本发明的组合物作为叶喷雾剂 ，作为种子/根/块茎/根茎/球茎/球根处理和/或作为土壤处理来施用。可在种植之前、种植期或种植之后处理种子/根/块茎/根茎/球茎/球根。
[0053]本文中描述的组合物也可施用于植物、植物部分例如种子、根、根茎、球根、球茎或块茎，和/或植物或植物部分在其上生长的场所例如土壤，以控制植物寄生线虫，从而增加农作物产量。在一些实施方案中，农作物产量增加至少约5%，在其它实施方案中增加至少约10%，在其它实施方案中增加至少约15%，在其它实施方案中增加至少约20%。
[0054]当用作种子处理时,取决于种子的尺寸，以约IxlO2至约IxlO9Cfu/种子的施用率施用本发明的组合物。在一些实施方案中，施用率为约IxlO3至约IxlO8Cfu/种子或约IxlO4至约IxlO7Cfu/种子。
[0055]本发明的组合物还可以以约IxlO3至约IxlO8Cfu/植物根系统的施用率用作根部浸溃。
[0056]当用作土壤处理时,可通过土壤表面烧灌、柄中(shanked-1n)、注射和/或沟灌施用，或通过与灌溉水混合来施用本发明的组合物。可在种植时、播种期间或之后，或在移栽后以及在植物生长的任何阶段施用的以浇灌土壤处理的施用率是约4xl07至约SxlO14Cfu/英亩或约4xl09至约8xl013cfu/英亩或约4χ10η至约8xl012cfu/英亩或约2xl012至约6xl013cfu/英亩或约2xl012至约3xl013cfu/英亩。在一些实施方案中，施用率为约IxlO12至约6xl012cfu/英亩或约IxlO13至约6xl013cfu/英亩。种植时施用的用于沟灌处理的施用率为约2.5xl01Q至约5xl0ncfu/1000排英尺(row feet)。在一些实施方案中，施用率是约6xl010至约3xl012cfu/1000排英尺或约6xl01Q至约4xl0ncfu/1000排英尺或约6χ10η至约3xl012cfu/1000排英尺或约6χ10η至约4xl012cfu/1000排英尺。本领域技术人员知道如何调整用于播洒处理和其它不太常见的土壤处理的施用率。
[0057]可在种植之前或开始萌发种子之前将本发明的组合物引入土壤。还可将本发明的组合物引入与植物根接触的土壤，引入至植物基部的土壤，或引入至植物基部周围的土壤(例如，在植物基部周围或下方约5cm、约10cm、约15cm、约20cm、约25cm、约30cm、约35cm、约 40cm、约 45cm、约 50cm、约 55cm、约 60cm、约 65cm、约 70cm、约 75cm、约 80cm、约 85cm、约 90cm、约95cm、约IOOcm或更长的距离内)。可通过利用多种技术包括但不限于滴灌、喷洒、土壤注射或土壤浇灌来施用组合物。还可将组合物施用至穴盘中的土壤和/或植物，或在移栽至不同的植物种植场所之前施用至幼苗。当施用至与植物根接触的土壤，施用至植物基部，或施用至植物基部周围特定距离内的土壤(包括土壤浇灌处理)时，可以以单次施用或多次施用的形式施用组合物。可以以上文中对于浇灌处理所示的施用率，或以约IxlO5至约 IxlO8Cfu/ 克土壤、IxlO5 至约 IxlO7Cfu/ 克土壤、IxlO5 至约 IxlO6Cfu/ 克土壤、7xl05 至约IxlO7Cfu/克土壤、IxlO6至约5xl06cfu/克土壤或IxlO5至约3xl06cfu/克土壤的施用率施用组合物。在一个实施方案中，以约7xl05至约IxlO7Cfu/克土壤的施用率单次施用本发明的组合物。在另一个实施方案中，以约IxlO6至约5xl06cfU/克土壤的施用率单次施用本发明的组合物。在其它实施方案中，以约IxlO5至约3xl06cfU/克土壤的施用率多次施用本发明的组合物。
[0058]当多次施用本发明的组合物时，这些应用可以以约I至约28天、约I至约21天、约I至约14天、约7至约28天、约7至约21天、约7至约14天或约10至约18天的间隔进行。
[0059]可单独地或与一种或多种其它杀线虫剂例如化学和生物杀线虫剂组合地施用本发明的基于枯草芽孢杆菌的组合物。在一些实施方案中，将枯草芽孢杆菌QST713与至少一种其它杀线虫剂一起配制，随后将共配制的产物应用于植物或植物种植场所。在一些其它实施方案中，将基于枯草芽孢杆菌的组合物与化学或生物杀线虫剂的商购可得制剂在罐中混合，并应用于植物和植物种植场所。在其它实施方案中，在即将施用化学或生物杀线虫剂的商购可得的制剂之前或在施用之后立即将本发明的基于枯草芽孢杆菌的组合物施用至植物和/或植物种植场所。在其它实施方案中，将本发明的基于枯草芽孢杆菌的组合物与化学或生物杀线虫剂的商购可得制剂轮流施用至植物和/或植物种植场所。在牵涉杀线虫剂的数次施用的轮流程序中，可将本发明的组合物单独地或与其它杀线虫剂组合地施用。在一个情况下，将基于枯草芽孢杆菌的组合物用于种子处理或用于沟灌或浇灌，如下文中更详细论述的。
[0060]虽然本 申请人:不希望束缚在任何特定理论上，但认为枯草芽孢杆菌QST713通过处理的植物中的诱导的系统抗性(ISR)控制线虫。关于ISR的解释，参见Bakker, P.A.H.M., “Induced Systemic Resistance by Fluorescent Pseudomonas spp.，’Phytophathology97 (2):239-243(2007)。ISR可能只有在用枯草芽孢杆菌QST713进行处理的时间与随后线虫攻击植物的时间之间的一定延迟期后才起作用。在一些实施方案中，在种植时将基于枯草芽孢杆菌的组合物与第二杀线虫剂组合施用，在随后的施用中，将基于枯草芽孢杆菌的组合物单独地或与另一种杀线虫剂组合地施用。利用第二杀线虫剂的初步处理可在延迟期中保护植物直至基于枯草芽孢杆菌的组合物促发ISR。在一些上述实施方案的情况下，可将第二化学或生物杀线虫剂的商购可得的制剂以低于标签推荐的施用率施用以用作独立杀线虫剂处理。在一个实施方案中，在种植时将枯草芽孢杆菌QST713与草氨酰
(VYDATE?)—起施用，并且在随后的施用中单独施用枯草芽孢杆菌QST713。
[0061]在其它实施方案中，在施用熏剂后将本发明的基于芽孢杆菌的组合物施用于植物和/或植物种植场所。熏剂可通过柄注射(shank injection)(通常最小在土壤表面以下8英寸)来施用。还可通过表面滴注化学灌溉来施用熏剂的液体制剂以将熏剂移至土壤表面以下8英寸或更深的深度。用塑料布覆盖处理的土壤床以将熏剂保留在土壤中数天。这在种植之前进行，并允许在种植之前排气。可在种植之前、种植时或种植后，在该排气期之后施用本文中描述的基于芽孢杆菌的组合物。在一些情况下，以低于产品标签上推荐的施用率施用熏剂。
[0062]化学和生物杀线虫剂在上文中进行了描述。熏剂杀线虫剂包括卤代烃例如氯化苦(CHL0R-0-PIC);甲基溴化物(METH-O-GAS)及其组合(例如BROM-O-GAS和TERR-0-GAS) ; I, 3- 二氯丙烯(TEL0NE I1、TELONE EC、CURFEW)及 1，3- 二氯丙烯与氯化苦的组合(TELONE C-17、TELONE C-35和INLINE);碘代甲烷(MIDAS);异氰酸甲酯释放剂例如甲基二硫氨基甲酸钠(VAPAM、SOILPREP、METAM-S0DIUM) ; I, 3 二氯丙烯与异硫氰酸甲酯(VORLEX)的组合；和二硫化碳释放剂例如硫代碳酸钠(ENZONE);和二甲基二硫化物或DMDS(PALADINO)。上述熏剂的每一种的示例性商业制剂提供于化学名称后的括号内。
[0063]还可将本发明的组合物作为病虫害综合治理(“IPM”)项目的部分进行施用。这样的项目描述于各种出版物中，尤其是通过大学合作推广。这样的项目包括与不能容许目标线虫宿寄生的农作物进行的农作物轮作、栽培和耕地措施以及移栽的使用。例如可在用芥茉或其它线虫抑制农作物生长一季后施用基于芽孢杆菌的组合物。
[0064]在一些实施方案中，在将本发明的组合物施用至植物、植物部分或植物种植场所之前，鉴定需要处理的种植场所。这样的鉴定可通过通常结合线虫问题的历史知识目测鉴定外观萎黄、矮化、坏死或枯萎(即`，表现出养分缺乏)的植物；植物采样；和/或土壤采样来进行。植物采样可在生长季节期间或在最终的收获后立即进行。将植物从土壤取出，检查它们的根以测定土地中线虫问题的性质和程度。对于根结线虫，根虫瘿的严重性通过测量长了虫瘿的根系统的比例来测定。由根结线虫引起的虫瘿可与固氮土壤细菌的根瘤相区另IJ，因为不容易将虫瘿与根分离。根结线虫土壤群体的水平随根虫瘿的严重性增加而升高。在一些情况下，根虫瘿的任何水平的检测表明对于种植任何易感农作物(尤其在取样区域或其附近)存在根结线虫问题。孢囊线虫还可通过植物取样和根部孢囊的细察来鉴定。
[0065]土壤采样提供了测定侵染一定体积的土壤或根的线虫和/或线虫卵的数目的方法。当在最终收获时或在种植新的农作物之前任何时间，包括在先前的农作物的作物毁减之前，首先怀疑有问题时，可进行土壤采样。大学合作推广项目提供土壤采样服务，包括佛罗里达大学、俄勒R州立大学和内布拉斯加林肯大学。此外，这样的项目提供如何收集样品的指导。例如，在收获后预测性取样的一个方法中，以有规则的曲折图案从超过5或10英亩(取决于农作物的价值，农作物的价值越高取样的英亩越少)的10至20块田间位置在6至10英寸的土壤深度收集样品。在测定已确定的植物的方法中，在6至10英寸的土壤深度从表现出症状但未死亡或濒死即腐烂的怀疑植物取出根和土壤样品。
[0066]在一些实施方案中，鉴定包括确定线虫侵染的经济阈值是否已达到；8卩，在不处理的情况下预期的经济损失超过处理成本时的点。取决于农作物、地理、气候、种植时间、土壤类型和/或土壤温度，经济阈值可变化。已发表了许多关于该主题的论文，并且可从不同地区的大学合作推广项目获得指导。参见，例如，Robb, J.G.，等人，“Factors Affecting theEconomic Threshold for Heterodera schachtii Control in Sugar Beet,，，Economicsof Nematode Control January-Junel992;Hafez, Saad L., “Management of Sugar BeetNematode,，，University of Idaho Current Information Series(CIS) 1071 (1998);和 UC IPM Pest Management Guidelines:Tomato UC ANR Publication3470NematodeA.Ploeg, Nematology, UC Riverside (January2008)。在一年的特定时间测定特定农作物的经济阈值完全在本领域技术人员的技术能力内。
[0067]在一些实施方案中，土壤取样显示线虫侵染将导致为未侵染土壤的正常产量的约80%、约90%或约95%的产量。
[0068]在一些实施方案中，根结线虫幼虫/千克土壤样品的经济阈值为至少约250、至少约300、至少约500、至少约750、至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000或至少约6000。
[0069]在一些实施方案中，孢囊线虫卵和幼虫/Icm3 土壤的经济阈值为至少约0.5、至少约1、至少约2、至少约3、至少约4。根据上文的Hafez (1998)，孢囊可估计为500个有活力的卵和幼虫。
[0070]下列实施例被提供来仅用于举例说明本发明的目的并且不限定本发明。
实施例`
[0071]实施例1
[0072]枯草芽孢杆菌QST713抗爪哇根结线虫的活性
[0073]利用黄瓜种子苏丹变种进行研究以测定QST713抗爪哇根结线虫的活性。用不同施用率的QST713的全发酵液或商购可得的SERENADE? Aso产品处理装有20g沙土
和一颗未发芽种子的50ml离心管。全发酵液U SERENADE? ASO产品相异在于所述产
品在菌落形成单位(Cfu)和代谢产物方面浓度大得多，所述产品具有为全发酵液至少Ilog的cfu。此外，除其它方面以外，利用防腐剂配制产品，使得所述产品酸性比全发酵液更强。为了获得QST713的全发酵液培养物，用QST713接种包含Luria Broth(LB)的种子瓶，在30°C生长过夜。第二天，将来自每一个种子瓶的等份在IL的摇瓶中接种200ml的基于大豆的培养基，生长直至芽孢形成。简而言之，将摇瓶培养物维持在30°C至32°C的温度和200至220rpm的摇床设置。在约3天的接种后，当细胞生长和代谢产物产生停止时，收获液体培养物。使处理的种子萌发并且生长在温室中。处理后4至5天(DAT)，用100只根结线虫二龄幼虫接种每一只管。10DAT后，以0-4的等级对幼苗的百分比根虫瘿产生进行评分，这描述于表1中。
[0074]随后用酸性品红对根进行染色以观察线虫穿透和发育，在Leica解剖显微镜下进行观察。对于线虫穿透，计数每一条根内总的线虫幼虫。对于线虫发育，计数总的肥胖幼虫，包括晚期二龄幼虫(J2’ s)和三龄幼虫(J3’ S)。如表1中所述对线虫至根的穿透和穿透后线虫的发育进行评分。关于使用的技术的细节，参见C.0.0mwega，等人，“ANondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm for Resistance toMeloidogyne incognita，，，Plant Disease (1988) 72 (11):970_972o
[0075]表1.细菌全发酵液的线虫拮抗活性的评级方案。虫瘿产生指数是基于根虫瘿的百分比。穿透等级计算为相对于未处理对照(UTC)的线虫幼虫数目的线虫幼虫的平均总数。发育等级反映根内肥胖线虫幼虫(晚J2期/J3期)的总数。
[0076]
【权利要求】
1.一种用于控制线虫的方法，包括给植物和/或植物生长的场所施用有效量的枯草芽孢杆菌QST713或枯草芽孢杆菌QST713的突变体。
2.权利要求1的方法，其中在施用之前鉴定植物和/或植物生长的场所需要处理。
3.权利要求2的方法，其中所述鉴定包括测定植物生长的场所超过线虫侵染的经济阈值。
4.权利要求1的方法，其中所述场所是土壤。
5.权利要求4的方法，其中在种植前施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
6.权利要求4的方法，其中在种植时施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
7.权利要求6的方法，其中通过沟灌施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
8.权利要求4的方法，其中在种植后施用所述枯草芽孢杆菌QS713或其突变体。
9.权利要求4的方法，其中对于土壤浇灌处理以约2xl012至约6xl013cfu/英亩的施用率或对于沟灌处理以约61101°至约4X1012cfu/1000排英尺的施用率施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
10.权利要求9的方法，其中所述施用率为约IxlO13至约6xl013cfu/英亩或约7.5χ10η至约4xl012cfu/1000排英尺。
11.权利要求4的方法，其中将所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体施用至与植物根接触的土壤或植物基部的土壤。
12.权利要求11的方法,其中以约7xl05至约IxlO7Cfu/克土壤的施用率单次施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
13.权利要求12的方法，其中以约IxlO6至约5xl06cfu/克土壤的施用率单次施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
14.权利要求9的方法，其中对于土壤浇灌处理/施用，以约2xl012至约6xl013cfu/英亩的施用率，多次施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
15.权利要求11的方法,其中以约IxlO5至约3xl06cfu/克土壤/施用的施用率，多次施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
16.权利要求15的方法，其中多次施用以约10至约18天的间隔进行。
17.权利要求11的方法，其中通过滴灌、喷洒、土壤注射或土壤浇灌施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
18.权利要求1的方法，其中将所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体施用至种子。
19.权利要求1的方法，其中所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体是发酵产物。
20.权利要求19的方法，其中所述发酵产物包含枯草芽孢杆菌QST713细胞或枯草芽孢杆菌QST713的突变体的细胞、代谢产物和残留发酵液。
21.权利要求1的方法，还包括施用第二杀线虫剂。
22.权利要求21的方法，其中所述第二杀线虫剂是选自氨基甲酸酯、有机磷酸酯和生物杀线虫剂的杀线虫剂。
23.权利要求21的方法，其中将 所述第二杀线虫剂与枯草芽孢杆菌QST713或其突变体组合施用。
24.权利要求21的方法，其中将所述第二杀线虫剂与枯草芽孢杆菌QST713或其突变体轮流施用。
25.权利要求23的方法，其中所述第二杀线虫剂是配制的商购可得的产品。
26.权利要求23的方法，其中以低于产品标签上推荐的当作为独立处理施用第二杀线虫剂时第二杀线虫剂的施用率的施用率施用所述第二杀线虫剂。
27.权利要求23的方法，其中在种植时将所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体与第二杀线虫剂组合施用，并且在随后的施用中单独施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
28.权利要求27的方法，其中所述随后施用以约10至约18天的间隔进行。
29.权利要求28的方法，其中所述第二杀线虫剂是草氨酰。
30.权利要求21的方法，其中将所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体施用至与植物根接触的土壤的位置或植物基部的土壤位置。
31.权利要求30的方法，其中以约IxlO5至3xl06cfu/克土壤的施用率施用所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
32.权利要求1-31的任一项的方法，其中所述线虫选自线虫属的种、拟毛刺线虫属的种、小环线虫属的种、螺旋线虫属的种、根结线虫属的种和轮线虫属的种。
33.权利要求32的方法，其中所述线虫是根结线虫属的种。
34.一种包含枯草芽孢杆菌QST713或其突变体和第二杀线虫剂的组合物。
35.权利要求34的组合物，其中所述第二杀线虫剂选自氨基甲酸酯、有机磷酸酯和生物杀线虫剂。
36.一种试剂盒，其包`括枯草芽孢杆菌QST713或其突变体和其用作杀线虫剂的说明书。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述说明书指导用户对于土壤浇灌处理以约2xl012至约6xl013cfu/英亩的施用率或对于沟灌处理以约6xl0lcl至约4xl012cfu/1000排英尺的施用率使用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
38.权利要求37的试剂盒，其中所述施用率为约IxlO13至约6xl013cfU/英亩或约7.5χ10η 至约 4xl012cfu/1000 排英尺。
39.权利要求36的试剂盒，其中所述说明书指导用户将所述枯草芽孢杆菌QST713或其突变体施用至与植物根接触的土壤或在植物基部的土壤。
40.权利要求39的试剂盒，其中所述说明书指导用户以约7xl05至约IxlO7Cfu/克土壤的施用率，单次施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
41.权利要求40的试剂盒，其中所述说明书指导用户以约IxlO5至约3xl06cfU/克土壤的施用率，多次施用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
42.权利要求36的试剂盒，其中所述说明书指导用户将枯草芽孢杆菌QST713或其突变体与化学杀线虫剂组合使用，以及进一步指导用户以低于产品标签上推荐的化学杀线虫剂的施用率的施用率使用所述化学杀线虫剂。
43.权利要求36的试剂盒，其中所述说明书还指导用户在种植时将枯草芽孢杆菌QST713或其突变体与化学杀线虫剂组合使用并且在随后施用中单独使用枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。
44.权利要求43的试剂盒，其中所述随后施用以约10至约18天的间隔进行。
【文档编号】A01P5/00GK103796516SQ201280042883
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年7月24日 优先权日:2011年7月25日
【发明者】R·N·罗亚尔蒂, V·托马斯, R·惠特森 申请人:拜尔作物科学有限合伙公司