凤果花叶病毒抗性番茄植物的制作方法

凤果花叶病毒抗性番茄植物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及番茄植物(番茄(Solanum?lycopersicum?L.))，其包含赋予对凤果花叶病毒(PepMV)的抗性的遗传决定因子，其中抗性特征在于存在至少QTL1，其位于在物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之间，优选位置33,558,627bp和34,505,939bp之间的连锁群(LG)6，或其PepMV-抗性-赋予部分，和/或QTL2，其位于在物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之间，优选位置61,387,356bp和62,253,846bp之间的连锁群(LG)7，或其PepMV-抗性-赋予部分，和/或QTL3，其位于在物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之间，优选位置61,494,664bp和62,385,023bp之间，更优选位置61,723,339bp和62,385,023bp之间的连锁群(LG)9，或其PepMV-抗性-赋予部分。本发明也涉及获得所述遗传决定因子的源，其代表性的种子以登录号No.NCIMB41927，NCIMB41928，NCIMB42068和NCIMB42069保藏在NCIMB。本发明还涉及种子和植物后代及其果实及加工的果实。此外，本发明涉及与PepMV抗性赋予QTL连锁的分子标志物和其用途。
【专利说明】凤果花叶病毒抗性番茄植物
[0001] 本发明涉及番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L.))，其包含赋予对凤果花 叶病毒（Pepino Mosaic Virus, PepMV)的抗性的遗传决定因子。本发明还涉及标志物和标 志物用于鉴定导致PepMV抗性的遗传决定因子的存在的用途。本发明也涉及该植物的种子 和后代及用于获得该植物的繁殖材料。此外本发明涉及包含遗传决定因子的植物，种子和 繁殖材料在育种程序中作为种质的用途。
[0002] 商业植物生产，包括番茄生产，被许多条件影响。栽培者对特定变种的选择是决定 因素，并形成可达到的结果的遗传基础。此外，有许多影响结果的外部因素。生长条件如气 候，土壤，及输入如肥料的使用起到主要作用。除此之外，害虫和疾病的存在也影响可达到 的总产率。
[0003] 已在很早以前，在番茄栽培的早些年认识到番茄中的许多疾病。育种者已同时鉴 定了来自各种来源的多数这些疾病的抗性，并在它们的产品中合并了它们。这些的例是 对烟草花叶病毒（TMV)(可感染广范围的植物和其他作物）；Fusarium oxysporum f.sp. lycopersicum，及黄枝孢霉（Cladosporium fulvum)或〃番爺叶霉菌〃的抗性。现今针对那 些疾病的抗性多少是全部商业番茄变种中的标准。无论何时新株或相关的疾病出现，对新 源的抗性的搜索从头开始。疾病及存在的对可能相关的形式的抗性的知识辅助相对快速测 定新抗性源。但是，对于一些疾病且尤其对于害虫，其是非常难或直到现在还不可能开发具 有高水平的抗性的物质。尤其在抗性机理非常复杂并依赖于几种彼此相互作用的基因时， 开发良好水平的抗性的挑战可为真正地高。
[0004] 此外，有时完全新疾病呈现出不与任何已知道的疾病相关。对于这些，仍无指示什 么最可能是可发展抗性的种质。也不知道抗性机理，这也使新抗性的发展更复杂。作为另 外的复杂因素，需要良好生物-测定以比较抗性植物与敏感的材料。当对新病原体知道很 少时，首先要确定其可感染番茄植物的方式。不与栽培者田地条件关联的生物-测定可导 致矛盾的或不令人满意的结果。在测试期间太弱或太强接种不会对为在实践中开发抗性番 茄植物的工作产生有用的物质。最后，最后测试是是否抗性在栽培者的条件下保持。
[0005] 在1999年，在欧洲，尤其在温室商业番茄生产中出现新病毒。此病毒可通过整 个田地极其快速扩散，及相邻栽培者容易受影响。病毒不久被鉴定为凤果花叶病毒，属于 Potex组，其特征在于高度感染性和持续性。
[0006] 凤果花叶病毒（PepMV)在1974年首次在人参果或梨瓜（Solanum muricatum), 南-美作物，在来源于秘鲁的植物上鉴定。其在当时被确定为可感染番茄，及相关的野生物 种，但不显示症状。
[0007] 尚未确定病毒如何可突然在欧洲番茄生产中出现，并随后也出现在例如加拿大及 美国。几种不同PepMV基因型被鉴定及区分，其中有：LP，来自秘鲁的原种；EU，来自欧洲温 室；来自智利的CH1和CH2 ;及US1和US2。
[0008] 相比从人参果作物获取的分离物，存在于商业番茄作物的PepMV分离物在番茄中 具有更强毒力，提示病毒已遗传上适应了。通过在番茄作物中完成的且正在起作用的通常 活性，PepMV非常容易机械地扩散。因此，通常可随后见到成行的感染的植物。工具，衣服， 等停留也能传播病毒几周，及P印MV可停留在干植物材料上久至3个月。一旦其感染了番 爺生产，就非常难以摆脱病毒。
[0009] P印MV症状是各种各样的，且大大地依赖于感染期间的植物阶段，植物变种，植物 活力和生长条件。有时症状难以可见，但主要症状表现包括具有'荨麻头浅灰色的，尖 的植物顶部_，矮小的头，黄萎病叶或叶斑，及不均匀成熟，形成大理石样斑纹及形成果实斑 点的植物。症状在秋季和冬季期间，在低光条件和更低温度下最明显。
[0010] 由于PepMV的番茄生产损失也可依赖于环境显著地改变。在重度感染的作物中， 损失很可能达到至多20%。其他病原体，例如轮枝孢属物种（Verticilium spp.)的存在也 可强烈影响产率减小。
[0011] 由于P印MV非常容易扩散，已在许多国家及由许多栽培者实施严格的卫生学流 程。自从推定PepMV也可通过感染的种子传播，用于种子生产和种子清洁的卫生学流程也 是非常严格的。
[0012] 在欧洲，当其被进口或交易时番茄种子需无PepMV。EU成员被要求进行测量，以确 定番爺种子上不存在病毒。
[0013] 自从发现在病毒感染了商业生长之后非常难根除，现今许多栽培者依赖于'杂 交-保护'：用弱PepMV分离物接种作物，以预防由攻击性的分离物导致的严重的症状。但 是，此系统带来几个风险。特定弱与特定攻击性的分离物的组合，尤其当它们来源手不同基 因型时，可增强而非减少症状（]^11188611等人，？1311〖？31:11〇1〇8759，13?21(2010))。由于 无法预知在特定区或特定季节将出现哪种攻击性的分离物，可能有害组合不可预防。此外， 甚至不是总是清楚哪种弱分离物被使用，因为鉴定较难。
[0014] 组合病毒基因型的另一风险是株之间遗传重组的可能性，其可导致新的和 潜在地甚至更毁坏性的病毒分离物（Hanssen等人，European Journal of Plant Pathologyl21, 131-146 (2008) ；Hasiow-Jaroszewska et al. , Acta Biochimica Polonica57, 385-388 (2010))〇
[0015] 尽管在番茄中对P印MV的抗性源的找寻自始一直很密集，直到现在无可利用的抗 性番爺（Solanum lycopersicum)植物。抗性的遗传改造，及用于筛选的生物-测定，如此 复杂，尚不知道对具有PepMV抗性的栽培的番爺材料的报道或提示。耐久抗性仅见于赭黄 爺（Solanum ochranthum)，其无法与栽培的番爺杂交。 【
【发明内容】
】
[0016] 本发明旨在提供番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L.))，其携带导致对凤 果花叶病毒的抗性的遗传决定因子。
[0017] 本发明旨在提供贡献于番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum))中凤果花叶病 毒抗性的QTL。
[0018] 本发明的另一目的是提供可鉴定导致PepMV抗性的遗传决定因子的标志物。
[0019] 本发明由此提供番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum))，其包含赋予对凤果 花叶病毒（PepMV)的抗性的遗传决定因子，其中抗性特征在于至少存在：
[0020] · QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置32, 363, 349bp和 34, 505, 939bp之间，优选位置33, 558, 627bp和34, 505, 939bp之间的连锁群（LG) 6上，和/ 或
[0021] · QTL2或其P印MV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置60, 667, 821bp和 62, 460, 220bp 之间，优选位置 61，387, 356bp 和 62, 253, 846bp 之间的 LG7 上，和 / 或
[0022] · QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置60, 998, 420bp 和62, 512, 587bp之间，优选位置61，494, 664bp和62, 385, 023bp之间，更优选位置 61，723, 339bp 和 62, 385, 023bp 之间的 LG9 上。
[0023] 由多于一种QTL组成的复杂抗性机理的鉴定是艰难及复杂的过程。尚不知 道关于对此抗性的遗传背景的指示。此外，也无从公共渠道可利用的可靠的用于番茄 (S. lycopersicum)的PepMV筛选方法。本发明的开发中另外的复杂因素因此是设计良好和 可靠的用于番茄（S. lycopersicum)的生物-测定（其会产生与栽培者的条件良好相关的 结果）的挑战。
[0024] 导致本发明的研究此外还显示，本发明的导致PepMV抗性的遗传决定因子包含多 于一种QTL及那些QTL位于番爺（Solanum lycopersicum)基因组的分离的染色体上。此 是对于创建抗性植物而言另外的复杂因素。
[0025] 在一实施方式中PepMV抗性特征在于至少存在：
[0026] · QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分及QTL2或其P印MV-抗性-赋予部分，或者
[0027] · QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分及QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分，或者
[0028] · QTL2或其P印MV-抗性-赋予-部分及QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分。
[0029] 在一实施方式中，抗性特征在于存在QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分，及QTL2 或其PepMV-抗性-赋予部分，及QTL3或其PepMV-抗性-赋予部分。
[0030] 2种或更多抗性-赋予QTL的组合导致对凤果花叶病毒的更高水平的抗性。
[0031] 在一实施方式中，本发明涉及番爺（Solanum lycopersicum)植物，其携带包含 QTL1，QTL2和QTL3中的一种或更多的遗传决定因子，该遗传决定因子赋予对凤果花叶病 毒的抗性，且该QTL如包含在番茄植物中，其代表性的种子以下列保藏号保藏在NCMB : NCMB41927, NCMB41928, NCMB42068 和 NCMB42069。
[0032] 在一实施方式中，所述决定因子由从在NCMB以登录号No. NCMB41927保藏的种 子生长的植物，和/或由从在NCMB以登录号No. NCMB41928保藏的种子生长的植物，和/ 或由从在NCMB以登录号No. NCMB42068保藏的种子生长的植物，和/或由从在NCMB以 登录号No. NCMB42069保藏的种子生长的植物渐渗杂交。
[0033] 在本发明的特定方面，渐渗杂交进番爺（Solanum lycopersicum)植物的QTL1，2 和3中的一种或更多组成了其抗性赋予部分。
[0034] 本文所用的"渐渗杂交"旨在表示利用杂交及在性状变得可见的第1代选择来将 遗传决定因子导入不携带遗传决定因子的植物。对于显性性状，选择可起始于具有性状的 植物和无性状的植物之间的杂交的F1。对于隐性性状，此适宜于F2。替代性地及对于多基 因性状，优选地，在与QTL连锁的分子标志物的辅助下进行选择。标志物辅助的选择可在包 含携带任意数的期望的QTL的植物的任何代或群中进行。
[0035] 保藏号NCMB41927或其后代种子，或保藏号NCMB42068或其后代种子，可适宜 地用作将QTL1 (其位于LG6上），和/或QTL2 (其位于LG7上）渐渗杂交至番茄（Solanum lycopersicum)植物的源。在 NCMB41927 和 NCMB42068 中，QTL1 连锁于 SEQ ID N0:1，及 SEQ ID N0:4,及SEQ ID N0:5;QTL2连锁于SEQ ID N0:2,及SEQ ID N0:6,及SEQ ID N0:7。 保藏号NCMB41928或其后代种子可用作渐渗杂交QTL2 (其位于LG7上），和/或QTL3 (其 位于 LG9 上）的源。在 NCMB41928 中，QTL2 连锁于 SEQ ID N0:2,及 SEQ ID N0:6,及 SEQ ID NO:7 ;QTL3 连锁于 SEQ ID NO:3,及 SEQ ID NO:8,及 SEQ ID NO:9。
[0036] 保藏号NCMB42069或其后代种子可用作渐渗杂交QTL1 (其位于LG6上）和/或 QTL2 (其位于LG7上）和/或QTL3 (其位于LG9上）的源。在NCMB42069中，QTL1连锁于 SEQ ID N0:1，及SEQ ID N0:4,及SEQ ID N0:5;QTL2连锁于SEQ ID N0:2,及SEQ ID N0:6， 及 SEQ ID NO:7 ;QTL3 连锁于 SEQ ID NO:3,及 SEQ ID NO:8,及 SEQ ID NO:9。
[0037] SEQ ID编号定义于表2。
[0038] 在一实施方式中，在番茄中赋予对凤果花叶病毒的抗性的一种或更多本发明的 QTL以纯合形式存在。关于本发明的性状，携带抗性性状的植物可如下在从不携带性状的植 物和携带所述的性状的植物之间的杂交后代之中适宜地鉴定：从作为初始杂交的结果的种 子和自交步骤生长F2植物，及选择显示期望的性状的植物。选择植物可通过生物-测定在 表型上进行，或可通过鉴定一种或更多贡献于性状的本发明的QTL或其抗性-赋予部分，由 标志物辅助的选择进行。
[0039] 1种或2种或全部3种本发明的QTL以隐性方式赋予抗性。对应表型性状（对 PepMV的抗性），因而也以隐性方式遗传。当全部3种QTL以隐性方式赋予抗性时，需生长 大群的F2植物，以选择具有表型性状，和/或携带全部3种本发明的QTL的植物。或者，可 起始选择更低水平的抗性和/或1种或2种本发明的QTL。赋予抗性的分离的遗传决定因 子也可以中间方式，或以显性方式遗传。当涉及中间或显性遗传时，对表型性状的选择更容 易。可出现用以获得最高水平的抗性的隐性和/或中间和/或显性QTL的组合。
[0040] 选择可就表型，或就所述本发明的抗性-赋予QTL的存在进行。选择也可通过使 用一种或更多分子标志物进行。分子标志物的使用需要更小筛选用群，及可在非常早期阶 段进行。
[0041] 在一实施方式中，本发明的番茄植物包含：
[0042] · QTL1或其抗性赋予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB42068和/或 NCMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5(表2)，和/或
[0043] · QTL2或其抗性赋予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB41928和/或 NCMB42068和/或NCMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7(表 2)，和 / 或
[0044] · QTL3或其抗性赋予部分，其在保藏NCMB41928和/或NCMB42069中连锁到由 下列表征的分子标志物：SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9(表2)。
[0045] 在一实施方式中，本发明的番爺植物包含QTL1，其优选关联于由下列表征的分子 标志物：SEQ ID N0:1，和/或SEQ ID N0:4,和/或SEQ ID N0:5;及QTL2,其优选关联于由 下列表征的分子标志物：SEQ ID N0:2,和/或SEQ ID N0:6,和/或SEQ ID N0:7;及QTL3， 其优选关联于由下列表征的分子标志物：SEQ ID N0:3,和/或SEQ ID N0:8,和/或SEQ ID N0:9。本发明的该植物的代表性的种子保藏为NCMB42069。
[0046] 根据本发明发现，QTL1位于番茄基因组的第6染色体的物理位置32, 363, 349bp和 34, 505, 939bp之间，且可由分子SNP标志物的存在鉴定。此SNP标志物位于番茄（Solanum lycopersicum)基因组版本SL2. 40的公共物理图谱的34, 456, 931bp，及特征在于SEQ ID NO: 1 (表2)。其他分子SNP标志物，其可用于给QTL1区分界，特征在于在33, 558, 627bp的 SEQIDN0:4和在34,505,939bp的SEQIDN0:5(表2)。在保藏NC頂B41927和NC頂B42068 和NCMB42069的植物中，这些SNP标志物指示及连锁到QTL1，因此也指示那些保藏的植物 中对PepMV的抗性。
[0047] 贡献于P印MV抗性的第2QTL(QTL2)，定位于第7染色体物理位置60, 667, 821bp和 62, 460, 220bp之间。QTL2可由位于番爺（Solanum lycopersicum)基因组版本SL2. 40的公 共图谱上物理位置61，550, 890bp的SNP标志物的存在鉴定，及特征在于SEQ ID N0:2(表 2)。其他分子SNP标志物，其可用于给QTL2区分界，特征在于在61，387, 356bp的SEQ ID N0:6和在 62,253,846bp的SEQIDN0:7(表2)。在保藏NC頂B41927 和NCIMB41928 和 NCMB42068和NCMB42069的植物中，这些SNP标志物指示及连锁到QTL2,因此也指示那些 保藏的植物中对PepMV的抗性。
[0048] 导致P印MV抗性的第3QTL (QTL3)，位于第9染色体物理位置60, 998, 420bp和 62, 512, 587bp之间。此QTL的存在可由位于番爺（Solanum lycopersicum)基因组版本 SL2. 40的公共物理图谱上的61，603, 006bp的SNP标志物检测，该SNP标志物特征在于SEQ ID N0:3 (表2)。其他分子SNP标志物，其可用于鉴定QTL3区，特征在于在61，872, 648bp的 SEQIDN0:8和在62，191，735bp的SEQIDN0:9(表2)。在保藏NC頂B41928和NC頂B42069 的植物中，这些SNP标志物指示及连锁到QTL3,因此也指示那些保藏的植物中对P印MV的抗 性。
[0049] 在一实施方式中，包含赋予对凤果花叶病毒（PepMV)的抗性的遗传决定因子的番 茄植物，可通过鉴定QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分，和/或QTL2或其P印MV-抗性-赋 予部分，和/或QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分的存在获得，其中QTL1?3定义为 ：
[0050] · QTL1，其位于在物理位置32, 363, 349bp和34, 505, 939bp之间，优选位置 33, 558, 627bp 和 34, 505, 939bp 之间的连锁群（LG)6 上；
[0051] · QTL2,其位于物理位置60, 667, 821bp和62, 460, 220bp之间，优选位置 61，387, 356bp 和 62, 253, 846bp 之间的 LG7 上；
[0052] · QTL3,其位于物理位置60, 998, 420bp和62, 512, 587bp之间，优选位置 61，494, 664bp 和 62, 385, 023bp 之间，更优选位置 61，723, 339bp 和 62, 385, 023bp 之间的 LG9 上。
[0053] 在一实施方式中，本发明涉及番茄植物，其可由包括下列步骤的方法获得：
[0054] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41927或 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41928)与不包含 这些遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
[0055] (b)任选地实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代 群；
[0056] (c)自群选择包含QTL1和/或QTL2的植物，或包含QTL2和/或QTL3的植物；
[0057] (d)使包含QTL1和/或QTL2的选择的植物与包含QTL2和QTL3的植物（其代表 性的种子保藏为NCMB41928)杂交，或使包含QTL2和/或QTL3的选择的植物与包含QTL1 和QTL2的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41927或NCMB42068)杂交；
[0058] (e)使步骤（d)中获得的植物自交，以获得分离的群；
[0059] (f)选择包含 QTL1 和 QTL2,或 QTL2 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL2 和 QTL3的植物。
[0060] QTL1和/或QTL2可首先渐渗杂交，或QTL2和/或QTL3首先渐渗杂交至缺少任一 种QTL的番茄（Solanum lycopersicum)植物，之后导入QTL2和/或QTL3,或QTL1和/或 QTL2。随后就凤果花叶病毒抗性中涉及的1种或2种或3种所述的QTL进行选择。
[0061] 在进一步实施方式中，本发明涉及携带导致针对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定 因子的番茄植物，其可由包括下列步骤的方法获得：
[0062] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41927或 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41928)，或包含 QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB42069)与不包含这些遗传决定 因子的植物杂交，以获得F1群；
[0063] (b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
[0064] (c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含至少 QTL1，2和3中的另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤（b);
[0065] (d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0066] 在进一步实施方式中，本发明的番茄植物可通过使包含QTL1和/或QTL2和/或 QTL3的第1亲本植物与包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2亲本植物杂交及在随后 代中选择任选地在进一步自交和/或杂交步骤之后包含QTL1和QTL2,或QTL1和QTL3,或 QTL2和QTL3,或QTL1和QTL2和QTL3的植物而获得。
[0067] 在进一步实施方式中，使从保藏为NCMB41927的种子生长的植物或从保藏为 NCMB42068的种子生长的植物与从保藏为NCMB41928的种子生长的植物杂交，使得到的 F1自交，并随后实施就包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的植物的选择。在优选的方面， 就优选纯合地包含全部3种QTL的植物进行选择，该植物对凤果花叶病毒是高度抗性或免 疫的。
[0068] 在优选的实施方式中，本发明涉及番茄植物，其可由包括下列步骤的方法获得：
[0069] (a)使包含QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB42069)与 不包含所述的QTL的植物杂交，以获得F1群；
[0070] (b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
[0071] (c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含QTL1，2 和3中的至少另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤（b);
[0072] (d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0073] 获得包括任意数的QTL1，2和/或3,优选QTL1和QTL2和QTL3,更优选纯合地全部 QTL1和QTL2和QTL3的本发明的番爺（Solanum lycopersicum)植物的方法，可以本领域技 术人员已知的各种方式实施。用于获得所述植物的源适宜地是包含QTL1或QTL2或QTL3的 植物，包含QTL1和QTL2或QTL2和QTL3或QTL1和QTL3的植物，或包含QTL1和QTL2和QTL3 的植物。包含QTL1和QTL2的适合的源的代表性的种子以保藏号NCMB41927或NCMB42068 保藏在NCMB，及包含QTL2和QTL3的适合的源的代表性的种子保藏为NCMB41928。
[0074] 包含QTL1和QTL2和QTL3的适合的源的代表性的种子以保藏号NCMB42069保藏 在 NCMB。
[0075] 需知，提供本发明的一种或更多遗传决定因子的亲本未必是从保藏的种子直接生 长的植物。亲本也可为自该种子的后代植物，或由其他手段自鉴定为具有包含1种或2种 或3种本发明的QTL的遗传决定因子的种子的后代植物。
[0076] 对凤果花叶病毒的抗性是通过天然的感染或人工感染（诸如接种）的由凤果花叶 病毒感染的导致的症状的减小或缺失。症状的减小或缺失是相比不携带本发明的遗传决定 因子或一种或更多QTL的番爺（Solanum lycopersicum)植物减小或缺失，如根据例如实施 例2测试的。
[0077] 在本发明的优选的方面，QTL1的纯合存在和QTL2的纯合存在和QTL3的纯合存在 导致最高水平的抗性或免疫。最高水平的抗性或免疫以隐性方式遗传。
[0078] 本发明的抗性优选是免疫。免疫被定义为在接种或感染之后病毒粒子不，或不显 著地，在植物中蓄积的抗性系统。免疫可通过对病毒粒子的ELISA测定测量，该测定为本领 域技术人员所熟知。免疫在ELISA测定中给出低或负分值。低或负分值指示与非-病毒-感 染的植物相当的病毒滴度。免疫由至少QTL1和QTL2和QTL3以纯合形式存在适宜地赋予。
[0079] 此外本发明涉及要求保护的番茄植物的细胞。该细胞可为分离的形式或可为完全 番茄植物或其部分的部分，仍构成本发明的细胞，因为该细胞在其遗传构成中携带导致定 义本发明的番茄植物的抗性特征的遗传信息。本发明的番茄植物的各细胞携带导致所述性 状的表型表达的遗传信息。本发明的该细胞也可为可用于再生本发明的新番茄植物的可再 生的细胞。
[0080] 本发明也涉及要求保护的植物的组织。组织包含在它们的遗传构成中携带导致定 义本发明的番茄植物的抗性特征的遗传信息的细胞。组织可为未分化的组织或已分化的组 织。未分化的组织是例如茎端，花药，花瓣，花粉和可用于微繁殖以获得生长为本发明的新 植物的新小植株。组织也可生长自本发明的细胞。
[0081] 本发明根据其再一方面涉及要求保护的植物的种子。尽管种子不显示本发明的番 茄植物的遗传性状，它们包含导致当植物自种子生长时，使此植物为本发明的植物的抗性 特征的遗传信息。
[0082] 本发明也涉及本发明的植物后代，细胞，组织和种子。该后代可本身是植物，细胞， 组织或种子。
[0083] 如本文所用词汇〃后代〃旨在表示来自与包含导致PepMV抗性的遗传决定因子的 本发明的植物杂交的第1个和全部进一步后代。本发明的后代是任何与携带导致PepMV抗 性的性状的本发明的植物杂交的后代。在一实施方式中，本发明的后代植物携带构成导致 对凤果花叶病毒（P印MV)的抗性的本发明的遗传决定因子的QTL1，QTL2和QTL3中的一种 或更多。优选地，后代包含QTL1，QTL2和QTL3的2种或更多，更优选本文定义的QTL1，QTL2 和QTL3的全部3种。
[0084] 后代植物优选显示至少一些水平的对凤果花叶病毒的抗性，尤其是高水平的抗性 和更尤其是针对凤果花叶病毒的免疫。
[0085] 〃后代〃也包括携带导致本发明的PepMV抗性性状的遗传决定因子且从其他植物 或本发明的植物的后代由植物性繁殖或增殖得到的植物。
[0086] 本发明由此还涉及要求保护的植物的种子及适宜于有性繁殖的植物部分。该部分 例如选择自：小孢子，花粉，子房，胚珠，胚囊和卵细胞。此外，本发明涉及适宜于营养繁殖的 植物部分，尤其是插枝，根，茎，细胞和原生质体。
[0087] 根据其再一方面，本发明提供要求保护的植物的组织培养物。组织培养物包含可 再生的细胞。该组织培养物可源于叶，花粉，胚胎，子叶，下胚轴，分生组织细胞，根，根端，花 药，花，种子和茎。组织培养物可再生为携带本发明的遗传决定因子的植物。适宜地，再生 的植物表达凤果花叶病毒抗性的表型。
[0088] 本发明此外涉及杂交体种子及涉及产生杂交体种子的方法，所述方法包括使第1 亲本植物与第2亲本植物杂交，及收获得到的杂交体种子，其中所述第1亲本植物和/或所 述第2亲本植物是要求保护的植物。
[0089] 本发明也涉及携带本发明的PepMV抗性性状的近交及加倍的单倍体。
[0090] 在一实施方式中，本发明涉及本发明的番茄植物，其由常规繁殖，或遗传修饰，尤 其是由顺式发生或反式发生携带导致PepMV抗性的本发明的遗传决定因子，及通过自适合 的源导入负责性状的遗传信息而获取了所述决定因子。顺式发生是植物用来自作物植物本 身或来自性相容的供体植物的编码（农业）性状的天然的基因来进行遗传修饰。反式发生 是植物用来自非-可杂交的物种的基因或合成基因的遗传修饰。
[0091] 在一实施方式中，获取本发明的遗传决定因子的来源由自下列生长的植物形成： 种子，其中代表性的样品以登录号No. NCMB41927保藏，或以登录号No. NCMB41928保藏， 或以登录号No. 42068保藏，或以登录号No. NCMB42069保藏，或保藏的种子，或其有性后代 或营养性后代，或包含遗传决定因子的另一源，或这些源的组合。
[0092] 在优选的实施方式中，本发明涉及非-转基因番爺（Solanum lycopersicum)植 物。为获得抵抗凤果花叶病毒的本发明的植物，用于获取本发明的一种或更多QTL1，QTL2 或QTL3的源适宜地是携带QTL1和/或2和/或3 (如包含在NCMB41927和/或NCMB41928 和 / 或 NCMB42068 和 / 或 NCMB42069 中的）的番茄（Solanum lycopersicum)植物，或 替代性地携带一种或更多所述的QTL且可与番爺（Solanum lycopersicum)杂交的爺属 (Solanum)物种的植物。任选地，在与相关的物种杂交之后，可实施技术诸如胚胎拯救，回交 或本领域技术人员知道的其他技术，以获得种间杂交的种子，该种子可用作用于显示对凤 果花叶病毒的抗性的非-转基因番爺（Solanum lycopersicum)植物的进一步发育的源。
[0093] 本发明也涉及本发明的植物的种质。种质由生物的全部遗传的特征构成，及根据 本发明包括至少本发明的性状。种质可用于开发PepMV抗性番茄植物的育种程序。
[0094] 本发明也涉及由本发明的植物产生的番茄果实。本发明还涉及食品，包含要求保 护的番茄植物的果实，或其部分。本发明也涉及经处理形式的食品。
[0095] 在一方面，本发明涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，包 括：
[0096] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41927和 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41928)与不包含 遗传决定因子的植物杂交，以获得F1群；
[0097] (b)任选地实施一轮或更多轮的自交及或使来自F1的植物杂交，以获得再一代 群；
[0098] (c)自该群选择包含QTL1和/或QTL2的植物，或包含QTL2和/或QTL3的植物；
[0099] (d)使包含QTL1和/或QTL2的选择的植物与包含QTL2和QTL3的植物（其代表 性的种子保藏为NCMB41928)杂交，或使包含QTL2和/或QTL3的选择的植物（其代表性 的种子保藏为NCMB41927和NCMB42068)与包含QTL1和QTL2的植物杂交；
[0100] (e)自交步骤（d)中获得的植物，以获得分离的群；
[0101] (f)选择包含 QTL1 和 QTL2,或 QTL2 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL2 和 QTL3的植物。
[0102] 本发明还涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，包括：
[0103] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41927或 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB41928)，或包含 QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB42069)，与不包含遗传决定因 子的植物杂交，以获得F1群；
[0104] (b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
[0105] (c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含QTL1，2 和3中的至少另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤（b);
[0106] (d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0107] 在一方面本发明中涉及通过如下步骤产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植 物的方法：使包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第1亲本植物与包含QTL1和/或QTL2 和/或QTL3的第2亲本植物杂交及在随后代中选择（任选地在进一步自交和/或杂交步 骤之后）包含QTL1和QTL2,或QTL1和QTL3,或QTL2和QTL3,或QTL1和QTL2和QTL3的植 物。
[0108] 在优选的方面，本发明涉及产生番茄植物的方法，包括：
[0109] (a)使包含QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的种子保藏为NCMB42069)与 不包含所述的QTL的植物杂交，以获得F1群；
[0110] (b)实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群；
[0111] (c)任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含QTL1，2 和3中的至少另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤（b);
[0112] (d)选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0113] 本发明另外地提供向包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物导入期望的性状的 方法，包括：
[0114] (a)使包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物（其代表性的种子以保藏号 NCMB41927和NCMB41928和NCMB42068和NCMB42069保藏在NCMB)与包含期望的性状 的第2番茄植物杂交，以产生F1后代；
[0115] (b)选择包含对凤果花叶病毒的抗性和期望的性状的F1后代；
[0116] (c)使选择的F1后代与亲本之一杂交，以产生回交后代；
[0117] (d)选择包含期望的性状和对凤果花叶病毒的抗性的回交后代；以及
[0118] (e)任选地连续重复步骤（c)和（d) -次或更多次，以产生包含期望的性状和对凤 果花叶病毒的抗性的选择的第4或更后回交后代。本发明包括由此方法产生的番茄植物和 由其获得的番茄果实。
[0119] 包含本发明的遗传决定因子的植物的选择可替代性地在所述方法的任何杂交或 自交步骤后进行。
[0120] 在一实施方式中，包含遗传决定因子的植物是近交系，杂交体，加倍的单倍体，或 分离的群的植物。
[0121] 本发明还提供产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，其通过使用加 倍的单倍体产生技术产生包含所述的导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的加倍 的单倍体系。
[0122] 本发明此外涉及杂交体种子及产生杂交体种子的方法，所述方法包括使第1亲本 植物与第2亲本植物杂交，及收获得到的杂交体种子，其中所述第1亲本植物和/或所述第 2亲本植物是要求保护的植物。
[0123] 在一实施方式中，本发明涉及产生杂交体番茄植物的方法，包括使第1亲本番茄 植物与第2亲本番茄植物杂交，及收获得到的杂交体番茄种子，其中第1亲本番茄植物和/ 或第2亲本番茄植物包含本发明的导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子，尤其是本 文所述的遗传决定因子。
[0124] 本发明也涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方法，其通过使用在 其基因组中包含导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的种子用于生长所述的番茄 植物。种子适宜地是这样的种子，其代表性的样品以保藏号NCMB41927或NCMB41928或 NCMB42068 或 NCMB42069 保藏在 NCIMB。
[0125] 本发明也涉及种子生产的方法，包括使包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物生 长，允许植物产生种子，及收获那些种子。种子的产生适宜地通过杂交或自交进行。
[0126] 在一实施方式中，本发明涉及通过使用组织培养产生包含对凤果花叶病毒的抗性 的番茄植物的方法。本发明此外涉及通过使用营养繁殖产生包含对凤果花叶病毒的抗性的 番茄植物的方法。
[0127] 在一实施方式中，本发明涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的方 法，其通过使用遗传修饰方法向番茄植物导入导致对凤果花叶病毒的抗性的本发明的遗传 决定因子。遗传修饰包含转基因修饰或反式发生（其使用来自非-可杂交的物种或合成基 因的基因），及顺式修饰或顺式发生（其使用来自作物植物本身或来自性相容的供体植物 的编码（农业）性状的天然的基因）。
[0128] 本发明也涉及开发包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的繁殖方法，其中使用 包含导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的种质。所述包含遗传决定因子的植物的 代表性的种子以保藏号NCMB41927和NCMB41928和NCMB42068和NCMB42069保藏在 NCMB。
[0129] 在进一步实施方式中，本发明涉及产生包含对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物的 方法，其中将包含赋予所述对凤果花叶病毒的抗性的本发明的遗传决定因子的植物的后代 或繁殖材料用作将对凤果花叶病毒的抗性渐渗杂交至另一番茄植物的源。所述包含遗传 决定因子的植物的代表性的种子以保藏号NCMB41927和NCMB41928和NCMB42068和 NCMB42069 保藏在 NCMB。
[0130] 本发明优选提供显示对凤果花叶病毒的抗性的番茄植物，该植物可由本文描述的 任何方法获得。
[0131] 本发明也涉及产生番茄果实的方法，包括使本文所述的PepMV抗性番茄植物生 长，及允许它们产生番茄果实和任选地收获果实。
[0132] 本文所用的术语'遗传决定因子'包括一种或更多QTL，或本文所述的基因或等位 基因。这些术语互换使用。
[0133] 在一方面，本发明涉及存在于番爺（Solanum lycopersicum)基因组中的分子SNP 标志物，该分子SNP标志物在番爺（Solanum lycopersicum)中与赋予对凤果花叶病毒的抗 性的QTL遗传连锁，及该分子SNP标志物特征在于是SEQ ID N0:1?9之任一个。SEQ ID N0:1?9定义于表2。
[0134] 在再一方面，本发明涉及由定义于表2的SEQ ID N0:1?9之任一个表征的分子 标志物用于在番爺（Solanum lycopersicum)植物中鉴定凤果花叶病毒抗性赋予QTL的用 途。
[0135] 遗传决定因子或QTL可通过使用分子标志物鉴定。遗传决定因子或QTL可替代性 地通过遗传图谱上的位置，或通过指示连锁群或染色体上的位置来鉴定。当遗传决定因子 或QTL不再连锁于特定分子标志物，但其遗传图谱上定义的染色体位置未改变时，此遗传 决定因子仍与其连锁到分子标志物时相同。因此，其赋予的遗传性状也仍相同。
[0136] '遗传性状'是由遗传决定因子赋予的性状或特征。遗传性状可在表型上鉴定，例 如通过实施生物-测定。但是，不可实施表型测定的植物阶段也携带导致遗传性状的遗传 信息。可使用'性状'或'表型性状'代替'遗传性状'。此外，在隐性性状的情况中，杂 合植物也携带当以纯合形式存在时导致PepMV抗性性状的遗传信息。该植物是抗性等位基 因的来源，由此也是本发明的部分。
[0137] 在分子标志物缺失下，或在已发生遗传决定因子和标志物之间的重组，从而标志 物不再可预测的情况下，可通过等位性测试测定遗传决定因子的等位性。为了实施等位性 测试，使对于知道的本发明的决定因子纯合的测试植物与对其遗传决定因子也纯合的待测 试的材料杂交。当杂交F2中不存在待观察的性状的分离时，遗传决定因子已被证明等位或 相同。
[0138] 当多于一种基因负责特定性状，且进行等位性测试以测定等位时，做测试的本领 域技术人员需保证，为适当地工作，对于测试，全部关联基因纯合地存在。
[0139] 遗传图谱可根据组建它们的方法而改变。本领域技术人员知道如何比较及组合 遗传图谱，其中可消除或最小化遗传图谱之间的差异。来自一个遗传图谱的信息可因此 转移或翻译到另一遗传图谱。本文所用的位置是基于2011年1月发布的SL2. 40版的 番爺基因组的公共物理图谱的物理位置（http://solgenomics. net/genomes/Solanum_ lycopersicum/genome_data. pi)〇
[0140] 基于本发明的遗传决定因子的对凤果花叶病毒的抗性包含对于一种或更多知道 的Ρ印MV基因型的抗性。知道的基因型包括本领域技术人员已知的LP，EU，CH1，CH2, US1 和US2。对凤果花叶病毒的抗性可还包含对目前尚未鉴定的PepMV基因型的抗性。尚未鉴 定的PepMV基因型可为目前感染植物，但尚未被表征属于凤果花叶病毒的基因型。其也可 为自已存在的株发展而来的新PepMV基因型，或也将会被分类为凤果花叶病毒的另一基因 型。
[0141] 【保藏】
[0142] 包含本发明的导致对凤果花叶病毒的抗性的遗传决定因子的番茄（Solanum lycopersicum) 11R. 412000 和 11R. 446400 的种子，在 2012 年 1 月 13 日，分别以保藏 号 No. NCMB41927 和 NCMB41928,保藏在 NCMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB219YA, UK。
[0143] 包含 QTL1 和 QTL2 的番爺（Solanum lycopersicum) 12R. 4211014 的种子，及包 含本发明的遗传决定因子（包含QTL1和QTL2和QTL3 (该QTL导致对凤果花叶病毒的抗 性））的番爺（Solanum lycopersicum) T12R. 107的种子，在2012年10月10日，分别以保 藏号 No. NCMB42068 和 NCMB42069,保藏在 NCMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB219YA, UK。
[0144] 保藏的种子不符合获得植物变种保护所需要的DUS标准，因此不被认为是植物变 种。
[0145] 本发明还会在以下实施例中例证。 【实施例】
[0146] 【实施例1 :本发明的番茄植物的产生】
[0147] 在导致本发明的研究中，在 申请人:的种质中，通过对凤果花叶病毒抗性实施生物 测定（见实施例2)来鉴定就凤果花叶病毒免疫的秘鲁蕃爺（S. peruvianum)植物。由连续 生物-测定重复确认抗性的免疫水平。秘鲁蕃茄（S.peruvianum)中免疫的鉴定是非常惊 人的，由于尽管已在各种研究中筛选许多登录，尚未给出关于秘鲁蕃茄（S.peruvianum)中 免疫或高度抗性植物的早先报道。
[0148] 在生物-测定中尚未鉴定出含有针对PepMV的免疫的其他秘鲁蕃茄 (S. peruvianum)植物。单免疫植物自身-不相容，由此无法获得自交的种子。由于对PepMV 免疫的遗传被预期复杂，与另一秘鲁蕃爺（S. peruvianum)植物杂交，之后自交及就抗性选 择被认为是就维持免疫而言太有风险的方法。因此植物仅增长及通过插枝营养性地维持。
[0149] 使自身-不相容的免疫秘鲁蕃爺（S. peruvianum)源植物与番爺（Solanum lycopersicum)系杂交。实施胚胎拯救，以获得此种间杂交的F1后代。就对凤果花叶病毒 的抗性筛选F1，但该群被发现敏感。
[0150] F1还是自身-不相容的，及实施各种F1植物的互交，以获得可用于进一步开发的 F2群。
[0151] 就P印MV抗性重复测试大量的F2植物，通过对各植物进行10次插枝，以获得同一 基因型。PepMV抗性测试鉴定出仅2个高度抗性F2植物。但是，那些植物中抗性水平仍小 于原秘鲁蕃爺（S. peruvianum)源的水平。
[0152] 为了更接近栽培的番爺类型，使高度抗性植物与番爺（Solanum lycopersicum) 系回交，及再次实施胚胎拯救以获得BC1群。使BC1自交及自这些获得约15BC1S1群。对 P印MV高度抗性的植物，自各群筛选75个和150个之间的植物，如在实施例2中描述。
[0153] 最终选择7个BC1S1植物有良好水平的抗性，和对这些植物制造BC2。需实施胚胎 拯救，以获得此BC2代。BC2再次自交和自此衍生166个BC2S1家族而用于进一步筛选及选 择。自那些家族中的每一个，就抗性筛选150个植物。各筛选由2步骤组成，如描述于实施 例2。当家族被认为含有良好数的抗性植物时，需用更强，欠稀释的，接种物再次重复筛选。 用此方式可鉴定最高抗性。
[0154] 在各回交及自交步骤之后，实施生物-测定，以鉴定高度抗性植物及确认高水平 的抗性。
[0155] 在第1代期间，P印MV抗性被证明与植物的短小生长强烈连锁。此副作用呈现为 自抗性源连锁拖累的结果。由于短小生长是明显负面特征，此连锁拖累使抗性不可应用于 在繁殖中直接使用。其还使其难以实施生物-测定，由于植物呈现为弱，使经延长的时间保 持它们成为挑战。自选择的短小植物获得种子被证明甚至更复杂。
[0156] 此外，显然，抗性的遗传构成非常复杂。即使已长时间在番茄中搜索对P印MV的抗 性，至今尚未产生对病毒具有高水平的抗性的栽培的番茄（S. lycopersicum)植物。对在 栽培的番茄中合并对此广布病毒的高抗性水平的可行性问题因此仍待回答。与困难的生 物 -测定组合的抗性遗传背景的复杂性使其非常难以为番爺（Solanum lycopersicum)鉴 定含有必要的高水平的抗性或免疫的期望的后代植物。
[0157] 因此实施在实施例3中描述的QTL图谱，以首先澄清抗性的遗传构造。随后起始于 BC2代，与表型筛选组合而进行标志物辅助的回交及选择，以检测会导致需要的高水平的抗 性的植物。短小生长被确定连锁于第6染色体上的QTL(QTLl)。
[0158] 通过使用用于3种QTL的标志物，在BC2S1中，可开发2个家族为具有足够高水平 的抗性，各纯合地含有QTL中的2种，并在第6染色体上不再有会导致短小生长的连锁拖 累。将自这些系的种子保藏为NCMB41927和NCMB41928。
[0159] 如上述进一步回交，筛选及选择导致进展的BC4S1群。自那些群之一，选择纯合地 包含2种QTL，即QTL1和QTL2的另一植物及保藏为NCMB42068。
[0160] BC4S1群还包含纯合地具有QTL1和QTL2和QTL3的，具有高水平的抗性或免疫 的番茄（S. lycopersicum)植物。将纯合地包含全部3种QTL的这些植物的后代保藏为 NCMB42069。
[0161] 【实施例2 :对凤果花叶病毒抗性的生物-测定】
[0162] 凤果花叶病毒包括非常攻击性的基因型，但其行为和症状表现可为无法预测的。 因此，开发抗性植物，以实施具有足够的重复性的非常充分的测定，以在栽培者的条件中确 保良好性能是极其重要的。
[0163] 自待测试的植物，制造几个插枝，以对相同的基因型的几个植物进行测定。此方法 防止'逃逸'的选择，即植物由于一些原因而被鉴定为抗性，但此推定的抗性仅是由于环 境，而非因为植物含有导致抗性的遗传决定因子。因此，以最佳方式，由一起形成同一基因 型群的插枝形成测定抗性的重复，这使得生物-测定的结果高度可靠。
[0164] 用于实施生物-测定的接种物从感染的番茄叶得到。用具有相对低病毒滴度的接 种物起始生物-测定，其中接种物例如被稀释300倍。由本领域所知的标准方法进行机械 接种。选择以此水平对PepMV显示表型抗性的植物。它们包括包含导致PepMV抗性的一种 或更多QTL的遗传决定因子。
[0165] 具有表型抗性的植物优选是在生物-测定中不显示任何P印MV症状的植物。营养 性植物部分的症状可不同及包含'荨麻头'（浅灰色的，尖的植物顶部），矮小的头，扭曲的 叶，黄萎病叶，马赛克斑，成斑或叶斑。筛选的植物也可相比包括在中生物-测定中的敏感 的对照及被认为具有特定水平的抗性那些植物而显示减少的易感性。敏感的对照可例如选 自至今本领域所知的任何番茄变种。显示减少的易感性，但不是抗性或高度抗性或免疫的 植物不纯合地包含QTL1和QTL2和QTL3。
[0166] 由优选具有高水平的抗性及未显示症状的选择的植物一次制得更多插枝，以再次 起始年轻植物阶段。以此方式，再次有用作获得最可靠的生物-测定的重复的同一基因型。 选择的植物用具有高病毒滴度的接种物再接种，为此接种物例如被稀释30倍。以此方式， 鉴定含有导致P印MV抗性的最佳遗传决定因子的最强植物。优选由纯合地存在QTL1和QTL2 和QTL3达到最高水平的抗性或免疫。
[0167] 作为扩展的生物-测定的必要的部分，实施ELISA测定以测定选择的植物不仅是 无症状的，但病毒也不在植物中增殖。病毒的蓄积会最终导致症状或植物衰弱，由此该植物 不是作为耐久抗性源有用的。因此，通过ELISA测定确认选择的植物是真正无病毒是必要 的。实施测定病毒存在的ELISA测定是本领域技术人员知道的标准方法。
[0168] 具有分值〈0. 1的植物（其在ELISA测试中具有少于0. 1的吸收），被确认为本发 明的抗性植物。这些植物具有类似于非-接种的对照的吸收。使用高浓度接种物（其已被 例如30倍稀释）具有少于0. 1的吸收的植物（这是类似于非-接种的对照的吸收）具有 特征在于高度抗性或免疫的抗性机理。
[0169] 当使用更低浓缩的接种物，例如300倍稀释的接种物时，选择在ELISA测试中具有 少于0. 1的吸收的抗性植物及回交，以起始下一循环。在生长时期期间持续症状观察和使 用各种接种物浓度的ELISA测试，以确保植物具有耐久抗性。
[0170] 在许多条件下，在生物-测定期间，在年轻植物中不可见病毒症状。在这些情况 中，ELISA测定仅是在具有减少的易感性，或具有抗性，或高度抗性，或免疫的此阶段的植物 进行选择的基础。ELISA测定优选在接种插枝之后至少14天或至少18天或至少21天，或 任选地在番茄植物的生长时期期间在更长时间之后实施。
[0171] 由于凤果花叶病毒的性质和抗性的复杂性，在生物-测定中使用的最佳接种物浓 度可改变。最佳浓度根据存在于用作获得接种物的源的植物的病毒的强度和浓度改变。最 佳浓度也依赖于存在于待测试的植物的QTL数。例如，为选择具有仅1种或2种本发明的 QTL的植物，应使用更低浓度的接种物。接种用接种物的稀释可为3倍，30倍，300倍，3000 倍，30, 000倍或发现适宜于生物-测定实施的条件的任何其他浓度。当可在ELISA测定中 测定敏感的对照和抗性植物之间的病毒滴度的明显的差异时，浓度是适合的。
[0172] 有必要总是包括抗性和敏感的对照植物作为参照进行检查是否使用的接种物浓 度对于在生物-测定中使用是适当的，。P印MV生物-测定的可靠性的本质在于：依次包括 至少2种不同接种物浓度，其中第2接种物具有更高浓度；使用许多同一基因型（优选通 过插枝），以确认抗性的存在；及在于通过ELISA测定确认病毒减少或病毒缺失或类似于 非-接种的对照植物的吸收，以选择具有减少的易感性或抗性或高抗性或免疫的植物。
[0173] 表1 :使用300倍接种物稀释对各种BC2S1家族的P印MV抗性的分离
[0174]
【权利要求】
1. 番茄植物（番茄（Solanum lycopersicum L·))，其携带包含QTL1，QTL2和QTL3中的 一种或更多的遗传决定因子，该遗传决定因子赋予对凤果花叶病毒的抗性，且该QTL如包 含在番茄植物中，其代表性的种子以下列保藏号保藏在NCMB :NCMB41927, NCIMB41928， NCMB42068 和 NCMB42069。
2. 番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L·))，其包含赋予对凤果花叶病毒 (PepMV)的抗性的遗传决定因子，其中遗传决定因子包含： ? QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置32, 363, 349bp和 34, 505, 939bp之间，优选位置33, 558, 627bp和34, 505, 939bp之间的连锁群（LG) 6上，和/ 或 ? QTL2或其P印MV-抗性-赋予部分，其位于在物理位置60, 667, 821bp和 62, 460, 220bp之间，优选位置61，387, 356bp和62, 253, 846bp之间的连锁群（LG) 7上，和/ 或 ? QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分，其位于物理位置60, 998, 420bp和62, 512, 587bp 之间，优选位置61，494, 664bp和62, 385, 023bp之间，更优选位置61，723, 339bp和 62, 385, 023bp之间的连锁群（LG)9上。
3. 权利要求1或2的番茄植物，其中遗传决定因子包含： ? QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分及QTL2或其P印MV-抗性-赋予部分，或者 ? QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分及QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分，或 ? QTL2或其P印MV-抗性-赋予-部分及QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分。
4. 权利要求1?3之任一项的番茄植物，其中遗传决定因子包含： ? QTL1或其P印MV-抗性-赋予部分，及 ? QTL2或其P印MV-抗性-赋予部分，及 ? QTL3或其P印MV-抗性-赋予部分。
5. 权利要求1?4之任一项的番茄植物，可由包括下列步骤的方法获得： (a) 使包含QTL1和QTL2的植物，其代表性的种子保藏为NCMB41927或NCMB42068， 或包含QTL2和QTL3的植物，其代表性的种子保藏为NCMB41928,或包含QTL1和QTL2和 QTL3的植物，其代表性的种子保藏为NCMB42069,与不包含遗传决定因子的植物杂交，以 获得F1群； (b) 实施一轮或更多轮的自交和/或使来自F1的植物杂交，以获得再一代群； (c) 任选地自包含QTL1，2和3中的1种或2种的群选择植物，之后与包含至少QTL1，2 和3中的另一种QTL的植物杂交，并随后重复步骤（b); (d) 选择包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
6. 权利要求1?4之任一项的番茄植物，其可如下获得：使包含QTL1和/或QTL2和 /或QTL3的第1亲本植物与包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2亲本植物杂交及在 随后代中选择，任选地在就包含QTL1和QTL2,或QTL1和QTL3,或QTL2和QTL3,或QTL1和 QTL2和QTL3的植物进一步自交和/或杂交步骤之后。
7. 权利要求1?6之任一项的番茄植物的种子，其中可自种子生长的植物包含一种或 更多权利要求2中定义的QTL1-3。
8. 权利要求7的种子，其中可自种子生长的植物抵抗凤果花叶病毒。
9. 权利要求1?6之任一项的番爺植物的后代或权利要求7或8的番爺种子的后代， 包含一种或更多权利要求2中定义的QTL1-3。
10. 权利要求9的后代，其抵抗凤果花叶病毒。
11. 适合于产生权利要求1?6,9和10之任一项的植物或适合于产生权利要求7或 8的种子的繁殖材料，其中繁殖材料适宜于性繁殖，且尤其选自小孢子，花粉，子房，胚珠，胚 囊和卵细胞，或适宜于植物性繁殖，且尤其选自插枝，根，茎，细胞，原生质体，或适宜于可再 生的细胞的组织培养，且尤其选自叶，花粉，胚胎，子叶，下胚轴，分生组织细胞，根，根端，花 药，花，种子和茎，其中自繁殖材料产生的植物包含一种或更多权利要求2中定义的QTL1? 3 〇
12. 权利要求11的繁殖材料，其中自繁殖材料产生的植物抵抗凤果花叶病毒。
13. 权利要求1?6,9和10之任一项的番爺植物，权利要求7或8的种子或权利要求 11或12的繁殖材料，包含： ? QTL1或其抗性赋予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB42068和/或 NCMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:l，SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5 和/或 ? QTL2或其抗性赋予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB41928和/或 NCMB42068和/或NCMB42069中连锁到由下列表征的分子标志物：SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7,和 / 或 ? QTL3或其抗性赋予部分，其在保藏NCMB41928和/或NCMB42069中连锁到由下列 表征的分子标志物：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
14. 权利要求1?6,9,10或13之任一项的植物的番茄果实。
15. 食品，其包含权利要求14的番茄果实，或其部分，任选地以经处理形式。
16. 权利要求1?6,9，10或13之任一项的植物，或自权利要求7或8的种子，或自权 利要求11或12的繁殖材料产生的植物在开发凤果花叶病毒抗性番茄植物的育种程序中作 为种质的用途。
17. 分子标志物，优选分子SNP标志物，存在于番爺（Solanum lycopersicum)基因组， 在番爺（Solanum lycopersicum)中，该分子标志物与赋予对凤果花叶病毒的抗性的QTL遗 传连锁，且该分子标志物特征在于是SEQ ID NO: 1?9之任一个且其中QTL优选如权利要 求2中定义。
18. 权利要求17的标志物用于在番爺（Solanum lycopersicum)植物中鉴定赋予凤果 花叶病毒抗性的QTL的用途。
【文档编号】A01H1/04GK104093303SQ201280058633
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年11月2日 优先权日:2011年11月2日
【发明者】A·福赫拉斯, E·W·古特林, D·B·德雷格尔, R·韦尔霍夫, Z·O·范赫维杰嫩 申请人:瑞克斯旺种苗集团公司