专利名称：桑黄菌中环二肽c3的分离技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术：
Phellinus，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中环二妝 C3 的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇梯度洗脱，再次进行正相硅胶层析，然后是反相制备，再次甲醇凝胶层析，然后HPLC检测最后是ID-HNMR检测，即得环二肽C3，即反式_六氢_3 - (1-甲基乙基)卩比咯并[1，2_a〕卩比嗪-1，4 - 二酮(反式-1Oe)。该化合物具有抑制植物性毒素、广谱抗菌和提高肠道细胞成熟的作用。本发明的技术方案如下
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0. 1-0. 5%磷酸二氢钾0. 01-0. 05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到
2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力
0.1 0. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0. 5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ；
(4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。分离环二肽C3的方法
桑黄菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一正相硅胶层析一甲醇凝胶层析一TLC检测一反相硅胶层析一HPLC检测一甲醇凝胶层析一减压蒸干一环二肽C3。具体方法为
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱3-4次；
(3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(4)将步骤(3)得到的产物再次进行甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱； (5)将步骤(4)得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇冰=30%-70%；
(6)适度合并洗脱液，减压干燥，收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C3。本发明由桑黄菌中环二肽C3的分离技术的显著优势本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的环二肽C3。技术路线成熟明确，高效精确。
图1为环二肽C3的结构式；
图2为环二肽C3的一维核磁共振H谱。
具体实施例方式实例1:
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0. 1%酵母膏 0. 1%
硫酸镁 0. 1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量
0.5-1. lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。称取粗提物250g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为300目正相硅胶，柱高1. 0m，直径14cm，洗脱剂分别为氯仿，氯仿甲醇=300:1分别洗脱3，4，4，4个柱体积。洗脱液分别命名为Fr-1、Fr_2、Fr-3和Fr_4。将Fr_4等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。进行甲醇凝胶柱层析。然后，进行反相硅胶层析，HPLC检测收集的洗脱液，条件为Omin, 100%A水一IOmin, 100%甲醇，出峰时间为4. 38min,适当合并,减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，将洗脱液减蒸干，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为 S 7. 39 - 7. 08 (m, 5H), 4. 20 (t, J = 4. 4 Hz, 1H)，3. 53 (dt, J = 16. 8,
8.3Hz, 1H), 3. 19 (dd, J = 13. 6, 4.7 Hz, 1H)，2. 99 (dd, J = 13. 6, 4.6 Hz, 1H)，2. 59 (dd, J = 10. 3, 6.3 Hz, 1H)，2. 03 (dd, J = 11.9，6.1 Hz, 1H)，1. 90 (d, J =`5.4Hz, 1H),1. 73 - 1.48 (m, 2H).证明是反式-六氢_3 - (1-甲基乙基)卩比咯并[I, 2-a)吡嗪-1，4 - 二酮(反式-1Oe)。实例2:
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2. 5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30°C，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量0. 5-1. lvvm,搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在55°C条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10 ;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。称取粗提物IOOg与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为300目正相硅胶，柱高0.8m，直径14cm，洗脱剂分别为氯仿，氯仿甲醇=300:1-50:1分别洗脱2，3，3，3个柱体积。洗脱液分别命名为Fr-l、Fr_2、Fr_3和Fr_4。将Fr-4等体积硅胶拌样，使用硅胶为100-200目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为300目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。进行甲醇凝胶柱层析。然后，进行反相硅胶层析，HPLC检测收集的洗脱液，条件为Omin, 100%A水一IOmin, 100%甲醇，出峰时间为4. 60min,适当合并，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，将洗脱液减蒸干，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为 400MHZ，分析结果为 5 7. 39 - 7. 08 (m, 5H)，4. 20 (t, J = 4. 4 Hz, 1H)，
3.53 (dt, J = 16.8, 8.3 Hz, 1H)，3. 19 (dd, J = 13.6, 4.7 Hz, 1H)，2.99 (dd, J=13.6, 4.6 Hz, 1H), 2. 59 (dd, J = 10. 3, 6.3 Hz, 1H)，2.03 (dd, J = 11.9，6.1Hz, 1H),1. 90 (d, J = 5.4 Hz, 1H)，1. 73 -1. 48 (m, 2H) 证明是反式-六氢_3 -(1-甲基乙基)批咯并[l，2_a〕吡嗪-1,4 - 二酮·(反式-1Oe)。
权利要求
1.桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其步骤顺序如下 (1)制备桑黄菌粗提物； (2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱3-4次； (3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (4)将步骤(3)得到的产物再次进行甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱； (5)将步骤(4)得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇冰=30%-70%； (6)TLC检测，适度合并洗脱液，减压干燥，收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C3。
2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0. 1-0. 5%磷酸二氢钾0. 01-0. 05% (2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35 °C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2. 5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力0.1 0. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0. 5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ； (4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ； (5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
3.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于所述的环二肽C3为反式-六氢-3 - (1-甲基乙基)卩比咯并[l，2_a〕吡嗪_1，4 - 二酮(反式_10e)。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤⑵中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤⑵中所述的层析硅胶为正相200-300目。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤⑷中所述的凝胶为S印hadex LH-20或者S印hadex LH-25，洗脱剂为甲醇。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相材料为C-18或者C-8。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为甲醇水=30%-70%。
9.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的HPLC 条件为，Omin, 100%A 水一IOmin, 100% 甲醇。
10.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C3的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的HPLC出锋时间为4. 3-5. 6min。
全文摘要
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中环二肽C3的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇梯度洗脱，再次进行正相硅胶层析，然后是反相制备，再次甲醇凝胶层析，然后HPLC检测最后是1D-HNMR检测，最终得到环二肽C3。
文档编号A01G1/04GK103059032SQ20131003596
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者宋爱荣, 赵晨, 孙效乐, 王光远, 孔超 申请人:青岛农业大学