专利名称：一种杉木遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及杉木遗传转化方法，具体涉及一种以杉木悬浮细胞系为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。
背景技术：
杉木是我国特有的用材树种，是南方各省区最重要的造林树种之一。杉木生长快，产量高，性材好，用途多，木材销路好，其木材是优质的建筑材，装饰用材，是我国最重要的商品材树种。选育出生长速度快、繁殖力高、抗逆性强的杉木优株和无性系对林业生产具有十分重要的意义。然而针叶树生长周期长、树体高大，而且由于长期异交，具有高度的杂合性和大量的遗传负荷。因此传统育种周期长，难以适应速生树木遗传改良的需要。林木遗传基因工程是林木生物技术的前沿领域，它不仅为林木遗传改良中的种质创新开辟了一条新的途径，同时也是研究基因功能的重要手段。将基因工程与常规育种技术相结合，可大大缩短林木育种周期，加速育种进程。林木基因工程是通过适合的基因转移技术，导入有用的外源基因，获得转基因植株，进行林木遗传改良或有关的研究。近年来，林木基因工程取得了较大的进展。目前，已有几百种植物得到遗传改良，在丰产，抗病，抗寒等领域广泛应用。但在针叶树中却由于缺乏良好的转化方法和再生系统而受到严重限制。长期以来，人们认为根癌农杆菌的宿主主要为双子叶`植物，但自从D.Cleene和D.Ley首次报道根癌农杆菌菌株B6也能感染裸子植物受伤组织，并产生冠瘿瘤后，许多学者开始利用根癌农杆菌进行裸子植物尤其是针叶树的基因转化的研究。并且已经证明外源基因在部分针叶树如白云杉、挪威云杉、火炬松及北美黄杉等的细胞组织中得到表达。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，进行农杆菌介导的遗传转化，以建立稳定高效的杉木遗传转化体系。技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种杉木遗传转化方法，包括以下步骤:
(1)转化受体的建立:
取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23°C，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为 DCR 基本培养基，附加 Vc 10 mg/L, GA 0.1-2 mg/L, ΑΒΑ 2-5 mg/L, CH 0.5g/L，麦芽糖 30 g/L；
(2)农杆菌菌液制备:
活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28°C、220r/min振荡培液体养至OD6tltl为0.6-0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体；
(3)侵染:
将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置l_3min后，置于23°C，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16 36h ；
(4)脱菌培养:
用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL ;并放入23°C恒温培养箱中暗培养。每隔21天继代一次，诱导3(Γ60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加 Vc 10 mg/L, GA 2-8 mg/L，肌醇 5 g/L, CH 0.5 g/L, A C2 g/L，麦芽糖 25 g/L,水晶洋菜2.8 g/L ；
(5)筛选培养:
待杉木子叶胚成熟后，将其挑到加有200 mg/L头孢霉素的DCR基本培养基上，23°C光照培养。培养21天后，转移到加有100 mg/L头孢霉素，20 mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养；每21天继代一次。步骤(2)中，杉木液体继代培养基重悬菌体，菌液的0D_为0.5。步骤(4)中，无菌水中含有500mg/L头孢霉素。
所述的EHA105带有35S KUS基因和NPT-1I基因。步骤(5 )中，继代2次后，就可用于移栽。有益效果:与现有技术相比，本发明的杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，以GUS基因为报告基因通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生，建立起稳定高效的杉木遗传转化体系。利用本技术体系，可以以较低成本对杉木进行遗传改良，将基础理论研究中获得的抗病、抗逆、木材形成等相关的基因进行遗传转化，获得具有速生、抗病、抗逆性强等特点的优质杉木品种。
图1是杉木胚性愈伤显微照片 图2是杉木成熟子叶胚 图3是杉木⑶S瞬间表达检测图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例中，所使用到的培养基配方如下，未特别列出的，为常规培养基。以下实施例中，使用的DCR (Gupta and Durzan medium)基本培养基的构成和标准配方为:340 mg/L KNO3, 556 mg/L Ca (NO3) 2.4Η20，400 mg/L NH4NO3,170 mg/L KH2PO4,85mg/L CaCl2.2H20，370 mg/L MgSO4*7H20, 37.3 mg/L Na2_EDTA.H20，27.9 mg/L FeS04.7H20，6.2 mg/L H3BO3,22.3 mg/L MnSO4*4H20,8.6 mg/L ZnS04*7H20,0.25 mg/L Na2MoO4*2H20,0.25mg/L CuS04*5H20, 0.83 mg/L KI, 0.025 mg/L CoCl2,200 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,1.0 mg/L Thiamine1HCl,0.5 mg/L Nictinic*acid,0.5 mg/L Pyridoxine*HCl。LB 培养基配方:5 g/L Yeast extract, 10 g/L Tryptone, 5 g/L NaCl。
实施例1转化受体的建立。(I)取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞约5mL，将其接种到250mL的无菌三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散，目的是使细胞分散。杉木胚性愈伤组织细胞的显微照片如图1所
/Jn ο(2)量取50mL杉木液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23°C，85r/min的恒温摇床振荡培养。杉木液体培养基为DCR基本培养基，附加10mg/L VC, 0.1 2.0mg/L GA，2 5mg/L ΑΒΑ, 0.5g/L CH，30g/L 麦芽糖。(3)每7天继代一次，第三次继代后3天后(即从第4代的第三天开始)即可用于农杆菌侵染。植物基因转化过程中的受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，建立的能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。目前为止，对植物基因转化受体系统的研究已经进行了大量的工作，先后建立了多种有效的受体系统，适应于不同转化方法的要求和不同的转化目的。现已建立的受体系统包括愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、生殖细胞再生系统。目前，以植物体胚发生体系或体胚作为受体系统越来越受到重视。该系统主要有以下特点:其一、组成胚状体的胚性细胞接受外源DNA能力很强，是理想的基因转化感受态细胞，而且这些细胞繁殖量大，同步性好，因此转化率很高；其二、胚状体个体间遗传背景一致，无性系变异小，成苗快，数量多，而且还可以制成人工种子，有利于转基因植株的生产和推广；其三、胚状体多为单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少；其四、胚状体具有两极，在发育过程中同时可分化出芽和根，形成完整的植株，减少了不定芽发育过程中生根困难的难题。本实验室已经 建立了成熟的杉木体胚发生体系。本发明以杉木体胚发生体系为基础，以杉木悬浮细胞系为受体材料，建立杉木遗传转化系统。实施例2农杆菌菌液制备。(I)将_70°C保存的带有35S:⑶S基因(用于转化检测)和NPT-1I基因(用于筛选)的EHA105菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有适量抗生素(卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L)的LB培养基上，将其置于28°C恒温培养箱中培养。(2)待其长出单菌落后，用接种环挑取单菌落，接种到含有适量抗生素(卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L)的LB培养基上，再活化一次，然后将其置于28°C恒温培养箱中培养。(3)待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有IOmL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、220r/min振荡培养。(4)约20h后，吸取2mL菌液，接种到含有50mL加有适量抗生素(卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L)的LB液体培养基的三角瓶中，28°C、280r/min振荡培养至OD6tltl为0.6-0.8。(5)待农杆菌培养到OD6tltl为0.6-0.8时，取25mL菌液于50mL离心管中，于5000r/min,4°C离心IOmin,去除上清,收集菌体。(6)用杉木液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至OD6tltl为0.5左右。目前，植物基因工程研究中，农杆菌介导的转基因方法是转化机理最清楚、应用最广泛、成功率最高的一种方法。在转化过程中，农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化效率具有重要作用。如果农杆菌本身生长不良，则其侵染能力大大下降。因此制备纯度高、生长旺盛、侵染能力强的农杆菌侵染液是转化的关键。这种侵染菌液也称为工程菌液。农杆菌的培养可分为固体平板培养和液体振荡培养。固体培养一般需要2 3天，液体培养生长更快，一般需要I 2天。农杆菌接种在液体培养基后，并不立即开始增殖，一般需I 2小时才开始分裂。当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供养缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。处于对数生长状态的农杆菌侵染能力最强。研究表明，当农杆菌培养至0D_为0.6-0.8时，菌体处于对数生长期，此时侵染能力最强。实施例3侵染。将菌液摇匀，吸取3mL稀释的菌液加到 继代3天的杉木悬浮细胞(实施例1)中，静置l-3min后，置于23°C，85r/min的恒温摇床继续振荡培养，即共培养。侵染是指把工程菌接种到受体材料表面，方法就是将制备好的农杆菌菌液加入受体材料培养液中，浸泡一定时间后，进行共培养。在侵染过程中要掌握侵染时间，有助于减少后期培养过程中可能造成的污染，并可减轻细菌对植物的毒害作用。浸染时间太短，不能使足够多的农杆菌附着于外植体伤口处，从而降低遗传转化的频率。浸染时间过长，容易引起外植体的过敏反应，同时在后继培养过程中可能造成农杆菌污染，最终导致转化材料褐化死亡。接种菌体后的外植体在细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养的过程称为共培养。农杆菌和外植体共培养是整个转化过程中非常重要的环节，因为农杆菌附着，T-DNA的转移及整合都在这个时期内完成。研究表明，农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于16h。而共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞则因受到毒害而死亡。本实验中杉木悬浮系细胞经农杆菌侵染后，其共培养仍在液体培养基中进行。实施例4脱菌培养。(I)将共培养约36h后的杉木悬浮细胞摇晃几下，然后将其倒入IOOmL量筒中，静置l-2min，待材料沉淀后，倒去上清，再将材料倒回三角瓶中，并量取约50mL加有头孢霉素100mg/L的无菌水倒入三角瓶中，再摇晃几下，倒入IOOmL量筒中；重复3_4次，直至上清液清澈。此过程为洗菌。(2)用杉木液体培养基将量筒中的杉木愈伤重悬，并倒入250mL三角瓶中。(3)将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL。体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加Vc I Omg/L, GA2-8mg/L，肌醇 2-10g/L, CH 0.5g/L，AC 2g/L，麦芽糖 25g/L，水晶洋菜 2.8g/L。(4)每隔21天继代一次。(5)体胚诱导约30天后，可看到柱状胚，约60天后可看到子叶胚，杉木成熟子叶胚图，如图2所示。
外植体与农杆菌共培养一段时间后其表面及浅层组织中共生有大量的农杆菌，为杀死和抑制农杆菌的生长必须进行脱菌培养，从而使外植体更好地生长发育。所谓脱菌培养即把共培养后的植物材料转移到含有抗生素的培养基上培养。常用的抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素及羧噻吩青霉素。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑制作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效应。本实施例中使用头孢霉素杀死和抑制农杆菌的生长使用浓度为500mg/L。实施例5筛选培养。待杉木子叶胚成熟后，将其挑到DCR基本培养基上，在23°C下进行光照培养，培养基中加有200mg/L头孢霉素；21天后转移到加有100mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养，每21天继代一次。一般继代2次后，就可以用于移栽。选择转化的细胞也是转化过程中的一个重要环节。转化的细胞和非转化的细胞在生长发育过程中存在着竞争，如果转化细胞不能生长起来，转化就不能成功。因此选择培养是必不可少的步骤。选择抗生素加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，称之为选择压。本实施例中选择标记基因用的是NPT-1I (新霉素磷酸转移酶)。表达NPT-1I基因的细胞表现出对抗生素卡那霉素的抗性。因此实施例中用卡那霉素作为选择压。按照选择压加入的时期不同，可以分为三种，即前期选择、延迟选择和后期选择。前期选择是受体材料共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，即先选择后再生；后期选择即先再生后选择。由于未转化的细胞在含选择压的培养基上不能生长，转化细胞生长能力太弱亦难于生长形成转化体；而在无选择压培养基中非转化细胞同样能生长，并对转化细胞有滋养作用，从而有利于转化细胞的生长，因此本实施例选用后期选择。`实施例6⑶S细胞学检测
⑶S基因存在于某些细菌体内，编码β -葡萄糖苷酸酶(β -glucuronidase,⑶S)，该酶是一种水解酶，能催化许多β_葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因而GUS基因被广泛用作转基因植物的报告基因。 使用细胞学检测⑶S基因是通过X-Gluc为底物，通过显色反应直接观察到组织器官中GUS基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被检测的材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若材料成功发生了⑶S基因转化，表达出⑶S，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，可用肉眼或在显微镜下观察到。取植株长约2cm的体胚苗为GUS染色材料。将准备好的体胚苗浸泡在染液中，于37°C保温2h至过夜。⑶S染液配方:
Cl) 50mmol/L磷酸钠缓冲溶液(pH7.0):A液:称取NaH2PO4.2H20 3.12g溶于无菌水，定容至100ml。B液:称取NaH2PO4.12H20 7.17g溶于无菌水，定容至100ml。取39ml A液与61ml B液混合；
(2)染色液:7.1ml 50mmol/L 磷酸钠缓冲溶液，0.2ml I Ommo I/L Na2EDTA, 0.2ml5mmol/L K4 [Fe (CN)6], 0.2ml K3 [Fe (CN)6]，0.05ml 0.05% (v/v)Triton-100, 2ml 20% 甲酉享,0.25ml 0.5mg/ml X-Gluc0 配制 IOmlGUS 染液备用。
以⑶S基因为报告基因，通过细胞学方法检测⑶S基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。如图3所示，肉眼或显微镜下观察，材料中的蓝色即为GUS表达位点，可见， 外源基因已被高效转化。
权利要求
1.一种杉木遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)转化受体的建立: 取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23°C，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为 DCR 基本培养基，附加 10 mg/L Vc, 0.1-2.0 mg/L GA, 2-5mg/L ΑΒΑ, 0.5g/LCH, 30g/L麦芽糖； (2)农杆菌菌液制备: 活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28°C、220r/min振荡培液体养至OD6tltl为0.6-0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体； (3)侵染: 将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置l_3min后，置于23°C，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16 36h ； (4)脱菌培养: 用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL ;并放入23°C恒温培养箱暗培养；每隔21天继代一次，诱导3(Γ60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加 Vc 10 mg/L,GA 2-8 mg/L，肌醇 2-lOg/L，CH 0.5g/L，AC 2g/L，麦芽糖 25g/L，水晶洋菜 2.8g/L ； (5)筛选培养: 待杉木子叶胚成熟后，将其挑到DCR基本培养基上，在23°C下进行光照培养，培养基中加有200mg/L头孢霉素；21天后转移到加有100mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养，每21天继代一次。
2.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，杉木液体继代培养基重悬菌体，菌液的0D_为0.5。
3.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中，无菌水中含有500mg/L头孢霉素。
4.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于:所述的EHA105带有35S:⑶S基因和NPT-1I基因。
5.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于:步骤(5)中，继代2次后，就可用于移栽。
全文摘要
本发明公开了一种杉木遗传转化方法，包括转化受体的建立，农杆菌菌液制备，侵染，脱菌培养和筛选培养。该杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，以GUS基因为报告基因通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生，建立起稳定高效的杉木遗传转化体系。利用本技术体系，可以以较低成本对杉木进行遗传改良，将基础理论研究中获得的抗病、抗逆、木材形成等相关的基因进行遗传转化，获得具有速生、抗病、抗逆性强等特点的优质杉木品种。
文档编号A01H4/00GK103088058SQ20131003566
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者施季森, 王丹, 陈金慧, 周小红 申请人:南京林业大学