专利名称：钾离子在厚壳贻贝幼虫变态调控中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学离子钾离子的新用途，具体地说，是钾离子在厚壳贻贝幼虫变态调控中的用途。
背景技术：
厚壳贻贝(Jfytilus coruscus )，软体动物门/双壳纲，分布于我国的黄海、渤海和东海沿岸以及台湾等地。厚壳贻贝用足丝附着在附养物上生活，利用鳃滤食。选食海水中的微小生物以及有机碎屑等。其繁殖季节一年两次，是海产贝类中生长最快的种类之一。厚壳贻贝的发育阶段包括受精卵、桑葚期、囊胚期、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、匍匐幼虫等阶段，在变成附着成体之前有一个浮游幼虫阶段，幼虫附着于基质上，变态成为稚贝。目前的厚壳贻贝人工育苗过程中，幼虫的附着变态率低于10%，同时厚壳贻贝幼虫的附苗时间很长，一般需要2周，如此低的附着变态率和较长的幼虫附苗时间严重制约了厚壳贻贝养殖业的发展。为了改善水产养殖苗种生产技术，探索和控制厚壳贻贝浮游幼虫的附着变态行为，寻找厚壳贻贝幼虫变态的诱导剂，以提高幼虫变态率对于节约厚壳贻贝养殖成本、促进厚壳贻贝养殖业的发展具有重要的实践意义，同时也有助于解析厚壳贻贝幼虫的附着变态机制，并进一步指导海洋防污。目前已有人使用肾上腺素来提高厚壳贻贝浮游幼虫的附着变态率，但是其成本高，不适用于大规模苗种生产。因此亟需一种经济实用的厚壳贻贝幼虫变态调控的诱导剂。钾离子是 由钾原子失去最外层的一个电子得到的，显正I价，书写为K+，显无色。钾盐溶于水或熔融也可以得到钾离子，钾离子可以与任意离子共存。钾离子对生物体具有重要的生理功能。对于植物体，钾离子是植物细胞中含量最丰富的阳离子之一，能形成细胞跨膜电势，促进细胞内酶的活性，增强植物光合作用、物质合成和转运，提高能量代谢等。对于人类及其他哺乳动物，钾离子也是细胞内液的主要阳离子，体内98%的钾存在于细胞内，心肌和神经肌肉都需要有相对恒定的钾离子浓度来维持正常的应激性。血清钾过高时，对心肌有抑制作用，可使心跳在舒张期停止，血清钾过低能使心肌兴奋，可使心跳在收缩期停止。血钾对神经肌肉的作用与心肌相反。而目前关于钾离子与厚壳贻贝幼虫变态调控的关系还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种钾离子的新用途。本发明的再一的目的是，提供一种促进厚壳贻贝幼虫变态的方法。本发明的另一的目的是，提供一种钾离子的拮抗剂的新用途。本发明的第四个目的是，提供一种抑制厚壳贻贝幼虫变态的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
钾离子在促进厚壳贻贝幼虫变态和缩短厚壳贻贝幼虫的附苗时间中的用途。
所述的钾离子是钾盐。优选的，所述的钾盐是氯化钾或硫酸钾。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
一种促进厚壳贻贝幼虫变态的方法，所述的方法包括以下步骤:将厚壳贻贝幼虫放入10-50 mM KCl溶液中暴露处理1-24 h，然后冲洗干净，转移至盛有过滤海水的器皿中继续培育。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
钾离子的拮抗剂在抑制厚壳贻贝幼虫变态中的用途。优选的，所述的钾离子的拮抗剂是四乙胺。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
一种抑制厚壳贻贝幼虫变态的方法，所述的方法包括以下步骤:将厚壳贻贝幼虫暴露于0.1-1 mM四乙胺溶液中处理15-60 min。本发明优点在于:
1、提供了钾离子在厚壳贻贝幼虫变态调控中的用途，通过实验证实了钾离子可提高厚壳贻贝幼虫变态率，还能缩短厚壳贻贝幼虫的附苗时间，因此能用于提高厚壳贻贝苗种生产的成功率并缩短生产周期，且钾盐的价格便宜、无毒性，因而适用于大规模苗种生产；
2、证实了氯化钾的拮抗剂 四乙胺能够能有效抑制厚壳贻贝幼虫的变态，因此氯化钾的拮抗剂可用于海洋防污；
3、证实了钾离子及其拮抗剂对厚壳贻贝幼虫变态调控的影响，将有助于阐明厚壳贻贝幼虫的附着变态机制，探明其发育机理。
具体实施例方式下面对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1 I实验材料
厚壳贻贝性成熟个体采自于浙江嵊泗县枸杞海域；氯化钾、硫酸钾、四乙胺购自国药化学试剂有限公司。2实验方法
2.1厚壳贻贝眼点幼虫的培育
收集厚壳贻贝的性成熟个体，用工具将附着于厚壳贻贝体表的污泥、藤壶等刷去，并用海水漂洗干净。阴干24 h后转移至10 L盛有20°C过滤海水(GF/C: 1.2 μ m滤膜，FSff:过滤海水)的聚碳酸酯容器中。成体开始释放出精子和卵子，并搅匀使其受精。将受精卵放置在18°C培养箱中黑暗培养2d。2d后，受精卵发育为D形面盘幼虫，在盛有2 L过滤海水的烧杯中培育幼虫，密度保持为5个/ml，18±l°C条件下每天投喂约2-5万cellls/ml等鞭金藻，每两天全量换水一次，培养至眼点幼虫供实验用。2.2待试溶液的配制
配制氯化钾母液溶液，其中K+浓度为I M，按照倍比稀释法取母液调成待试溶液，包括五个浓度梯度:5 mM、9 mM> 10 mM、30 mM、50 mM、52 mM、60mM。配制硫酸钾母液溶液，其中K+浓度为I M，按照倍比稀释法取母液调成待试溶液，包括五个浓度梯度:5 mM、9 mMUO mM、30 mM、50 mM、52 mM、60mM。配制四乙胺的母液浓度为I禮，按照倍比稀释法取母液调成测试溶液，包括三个浓度梯度:0.1 mM> I mM> 1.05 mM> 1.5 mM。其中，氯化钾母液、硫酸钾母液和四乙胺母液的配制均是直接将这三种化学物质分别溶于0.22μπι过滤海水中，调节pH至7.8-8.2。实验所用的烧杯、玻璃棒、移液管以及培养皿均要求灭菌处理，母液和测试溶液均在实验的当天进行配制。2.3测试钾离子溶液和四乙胺对厚壳贻贝幼虫变态率的影响
实验采用28 d以上成熟眼点幼虫成熟幼虫(壳高> 218 μπι，壳长> 280 ym)0将20只幼虫放入含有20 mL K+待试溶液的玻璃培养皿(60 mm直径X 15 mm高)。各种K+浓度待试溶液中的幼虫经过24 h暴露处理后，用0.22 μ m过滤海水冲洗3次，再将幼虫转移至盛有20 mL 0.22 μ m过滤海水的玻璃培养皿。另以过滤海水替代K+测试液作为对照组，操作同K+测试液的操作。实验开始后24、48、72、96 h，显微镜下观察幼虫的变态率、死亡率及其行为变化，并统计幼虫的附苗时间。为检测四乙胺对厚壳贻贝眼点幼虫的变态效果，实验过程中将幼虫暴露于不同浓度梯度的四乙胺溶液中，处理15 min后，将氯化钾母液加入培养皿中，调整K+最终浓度为50 mM。暴露24 h后，洗涤幼虫3次，转移至仅含有灭菌海水的培养皿中，实验开始后24、48、72、96 h，显微镜下观察幼虫的变态率、死亡率及其行为变化，幼虫的变态通过新生贝壳生长来判断(具体可参见常亚青《贝类增养殖学》——第三章贝类的繁殖和发育中的P55，中国农业出版社，2007年第一版)。另设两个对照组:1)对照组一:以过滤海水替代四乙胺溶液，其他处理同上；2)对照组二:将幼虫暴露于不同浓度梯度的四乙胺溶液中，处理15 min后,将过滤海水加入培养皿中,暴露24 h后，洗涤幼虫3次，转移至仅含有灭菌海水的培养皿中。以上测试组及对照组均在黑暗环境中保持18±1°C。3实验结果
在24 h暴露实验中，KCl溶液在48 h后都没有观察到幼虫变态，72 h后KCl溶液表现出诱导活性，96 h后其40%幼虫变态成为稚贝，其最佳浓度为50 mM，且无死亡。当浓度为52 mM时，幼虫变态率下降，96 h后12%幼虫变态成为稚贝，死亡率上升为48%。当浓度为60 mM时，幼虫变态率大幅下降，96 h后10%幼虫变态成为稚贝并出现大量死亡，死亡率为55%。KCl浓度为10 mM的试验组96 h后23%幼虫变态成为稚贝，死亡率为2%。KCl浓度为9 mM的试验组96 h后10%幼虫变态成为稚贝，死亡率为3%。K2SO4溶液在48 h后也都没有观察到幼虫变态，72 h后K2SO4溶液表现出诱导活性，96 h后其38%幼虫变态成为稚贝，其最佳浓度为50 mM，且无死亡。当浓度为52 mM时，幼虫变态率下降，96 h后11%幼虫变态成为稚贝，死亡率上升为50%。当浓度为60 mM时，幼虫变态率大幅下降，96 h后5%幼虫变态成为稚贝并出现大量死亡，死亡率为51%。K2SO4浓度为10 mM的试验组96 h后25%幼虫变态成为稚贝，死亡率为0%。K2SO4浓度为9 mM的试验组96 h后9%幼虫变态成为稚贝，死亡率为1%。对照组直至96 h后仍未观察到幼虫变态。上述结果提示，钾离子可作为诱导厚壳贻贝幼虫变态的有效诱导物，能应用于厚壳贻贝养殖的苗种生产技术的改善。 测试氯化钾溶液、硫酸钾溶液处理的厚壳贻贝幼虫的附苗时间，发现对照组厚壳贻贝幼虫附苗时间为13 d，该结果与一般生产过程中结果近似(一般生产过程中大约2周左右),而5 mM、9 mMUO mM、30 mM、50 mM、52 mM、60 mM氯化钾溶液处理的厚壳贻贝的平均附苗时间分别为 10 d、9 d、6 d、5 d、4 d、9 d、10 d ；5 mM、9 mM、10 mM、30 mM、50 mM、52 mM、60 mM硫酸钾溶液处理的厚壳贻贝幼虫的平均附苗时间分别为9 d、9 d、6 d、5 d、4 d、10 d、
11d。上述结果提示，钾离子可显著缩短厚壳贻贝稚贝的附苗时间，有助于缩短育苗周期，尤其是10-50 mM的钾离子溶液。四乙胺的抑制效果实验表明，两种浓度的四乙胺溶液均能有效抑制厚壳贻贝幼虫的变态。其中0.1 mM四乙胺处理后，其变态率最终为12% ；四乙胺在I mM时抑制效果最好，仅有5%幼虫变态，且在实验过程中无任何死亡幼虫出现；浓度为1.05 mM时，幼虫变态率为2%，幼虫死亡率上升为21% ;浓度为1.5 mM时，幼虫变态率为0%，幼虫死亡率上升为20% ;浓度为0.1 mM时，幼虫变态率为7%，幼虫死亡率为2%。对照组一和对照组二的幼虫变态率在第14 d分别为50%和2%ο通过测试钾离子溶液和四乙胺溶液对厚壳贻贝幼虫变态率的影响，结果表明，钾离子通道受体参与了幼虫的变态过程，提高环境浓度诱导厚壳贻贝幼虫变态可能是通过使变态通路中可兴奋细胞膜去极化而启动的。这种可兴奋细胞很可能是幼体的神经细胞。四乙胺可作为抑制海洋贝类附着变态的有效抑制剂，有助于今后海洋防污技术的发展。同时实验结果表明，10-50 mM钾离子溶液对厚壳贻贝幼虫变态率有显著的促进作用，并且死亡率较低；0.1-1 mM四乙胺溶液对厚壳贻贝幼虫变态率有显著的抑制作用，并且死亡率较低。且实验中又设置了多个其他的钾离子溶液和四乙胺溶液浓度梯度，发现钾离子浓度高于50mM时，幼虫变态率呈现逐渐下降趋势，且死亡率不断上升；当四乙胺溶液浓度高于I mM时，随着四乙胺浓度的上升，其毒理效果逐渐显现，幼虫死亡率明显上升。实施例2
本实施例测试钾离子溶液在50 mM浓度下，分别暴露处理厚壳贻贝幼虫lh、8h、16h时对幼虫变态率和死亡率的影响，以及四乙胺溶液在I mM浓度下，分别暴露处理厚壳贻贝幼虫30min、45min、60min时对幼虫变态率和死亡率的影响，具体操作同实施例1。钾离子溶液在50 mM浓度下，分别暴露处理厚壳贻贝幼虫lh、8h、16h，再转移至过滤海水中培育，96 h后的幼虫变态率和死亡率结果见表I和表2。表I钾离子溶液不同处理条件下培育96 h后的幼虫变态率
权利要求
1.钾离子在促进厚壳贻贝幼虫变态和/或缩短厚壳贻贝幼虫的附苗时间中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的钾离子是钾盐。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的钾盐选自氯化钾或硫酸钾。
4.一种促进厚壳贻贝幼虫变态的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:将厚壳贻贝幼虫放入10-50 mM KCl溶液中暴露处理1_24 h，然后冲洗干净，转移至盛有过滤海水的器皿中继续培育。
5.钾离子的拮抗剂在抑制厚壳贻贝幼虫变态中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的钾离子的拮抗剂是四乙胺。
7.一种抑制厚壳贻贝幼虫变态的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:将厚壳贻贝幼虫暴露于0.1-1 mM四乙胺溶液中处理15-60 min。
全文摘要
本发明涉及钾离子在促进厚壳贻贝幼虫变态和缩短厚壳贻贝幼虫的附苗时间中的用途，还涉及钾离子的拮抗剂在抑制厚壳贻贝幼虫变态中的用途，以及促进或抑制厚壳贻贝幼虫变态的方法。其优点在于证实了钾离子可提高厚壳贻贝幼虫变态率，并能缩短厚壳贻贝幼虫的附苗时间，因而可用于提高厚壳贻贝苗种生产的成功率和缩短生产周期，同时钾盐的价格便宜、无毒性，适用于大规模苗种生产使用；本发明还证实了钾离子拮抗剂可抑制厚壳贻贝幼虫的变态，为海洋防污提供了一种新的途径；本发明的研究结论还将有助于阐明厚壳贻贝的附着变态机制。
文档编号A01K61/00GK103210857SQ20131010649
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者杨金龙, 李树恒, 李无霜, 梁箫, 李家乐 申请人:上海海洋大学