专利名称：一种周年大规模转化玉米的方法
技术领域：
本发明所属的技术领域是农业生物技术领域和作物育种领域。
背景技术：
玉米是世界上最重要的三大粮食作物之一，也是重要的工业原料和生物能源物质，在我国乃至全世界的粮食生产中都占有举足轻重的地位。在提高玉米单产的诸多因素中，新品种选育的作用约占40%。随着分子生物学技术的长足发展，转基因技术开始在玉米新品种选育中发挥重要的作用。转基因技术是根据育种目标，利用现代生物技术手段从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化导入受体作物，经过筛选获得稳定表达的转基因株系，结合田间试验与大田选择育成转基因新品种或新种质。转基因育种最大的优点是针对性很强，可以根据目标性状定向选择合适的基因导入需要改良的作物中，以达到预期的目的。通过转基因技术的应用，不仅可以提升传统育种的研发效率，而且提升了育种研发的准确率、减少盲目性和重复浪费，丰富了传统的育种手段，使作物育种的产业发展水平迈向新的台阶。目前，转基因育种在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中已经取得了巨大的成功，其中，转基因玉米已经成为仅次于转基因大豆的全球种植面积第二大的转基因作物。在研发转基因作物新品种时，最重要的技术环节之一就是作物遗传转化技术。目前玉米最常用的遗传转化方法主要是农杆菌介导法，所用的材料可分为幼胚和非幼胚类型，其中前者还包括直接用幼胚或幼胚诱导的胚性愈伤组织进行遗传转化，而后者包括直接用茎尖分生组织和利用成熟胚、叶片、茎尖等诱导的胚性愈伤组织等作为材料进行再生。幼胚和幼 胚诱导的胚性愈伤组织操作相对简单，植株再生相对比较容易，转化率也较高，是玉米转基因中最常用的受体材料。但是幼胚转化所用的受体材料基因型限制严重、材料易受季节和温室条件限制，不能够持续不断的高通量的进行玉米转化，在产业化应用上具有很大的局限性。非幼胚类型的材料中，直接用茎尖分生组织虽然转化和再生容易，且不受基因型限制，但转化率低，获得的再生植株大多是嵌合体，后代需要做大量的筛选工作。而采用成熟胚、叶片、茎尖等材料较难诱导出胚性愈伤组织，再生较困难。玉米胚芽鞘节作为材料进行转化相对于幼胚而言，转化效率较低。但是由于其不受温室条件和生长季节的限制，操作简便，可以实现高通量、持续不断的遗传转化，因而在玉米的商业化转基因研发中，具有相当大的应用潜力。由于转基因植物目前尚无法实现定点整合，因此只有获得大量的转基因植株才能够提高获得理想目标性状的几率。而由于上述原因，目前我国的玉米转基因规模一直偏小，转化率偏低，从而无法筛选出优良目标性状的单株，严重阻碍了转基因玉米向产业化方向发展。本专利发明将幼胚转化和胚芽鞘节愈伤组织转化巧妙地结合起来，有效地克服了取材困难、转化周期短等缺点，为玉米转基因产业化奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的提供一种周年连续大规模转化玉米的方法，将幼胚和胚芽鞘节诱导愈伤组织为外植体的两种转化方法结合，主要包括以下步骤:I)在玉米生长季节分批播种玉米受体材料，间隔4-7天播种一次；2)将上述步骤I)中播种的玉米在散粉前严格套袋，自交或姊妹交，每天将授粉株数控制在相同的数量；3)上述步骤2)中授粉的玉米在授粉后9-13天，幼胚长至1.5-2.0mm时，剥取幼胚进行根癌农杆菌介导的转化，将幼胚放入侵染液中侵染，置于共培养培养基上培养，移入恢复培养基上暗培养一周，随后移入筛选培养基上筛选2 — 4轮,在胚状体诱导培养基上诱导形成胚状体，转入到分化培养基上进行分化，再生幼苗；4)在当年无法获得上述步骤3)的幼胚的时间段里，将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；5)将上述步骤4)中得到的幼苗切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；6)将上述步骤5)中得到的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上进行继代；7)用农杆菌介导法将外源基因转化上述步骤6)中的愈伤组织；8)将上述步骤7)中得到的愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体；
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9)将上述步骤8)中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗；10)将上述步骤3)和9)中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株；上述的浸染液是N6 +蔗糖68.5g/L +葡萄糖36g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4-D1.5mg/L ；共培养培养基是N6 +蔗糖30g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L +硝酸银0.85mg/L + L-半胱氨酸0.3g/L + 二硫代苏糖醇0.15g/L +乙酰丁香酮IOOmM ；恢复培养基是N6+蔗糖30g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L +硝酸银0.85mg/L + 2-吗啉乙磺酸0.5g/L +头孢霉素0.25g/L ；筛选培养基是N6基本培养基+蔗糖30g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L + 硝酸银 0.85mg/L + 2-吗啉乙磺酸 0.5g/L +头孢霉素 0.25g/L + Bialaphos 1.5_3mg/L ；胚状体诱导培养基是MS +鹿糖60g +头孢霉素0.25g/L + Bialaphos 1.5mg/L ；分化培养基是MS +蔗糖30g ；发芽培养基是MS +麦芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L +2-吗啉乙磺酸 2g/L + MgCl2*6H20 1.6g/L + 抗坏血酸 0.lg/L + 6_BA 3mg/L + 毒莠定0.0lg/L ；愈伤组织诱导培养基是MS +蔗糖30g/L +维生素B1 0.5mg/L +酶水解酪蛋白0.5g/L + 脯氨酸 1.5g/L + 硝酸银 5mg/L + 2, 4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.001mg/L ；胚状体诱导培养基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 6-BA 2mg/L ；再生培养基是MS +蔗糖20g/L +肌醇0.lg/L。
步骤I)中所述的分批种植每次数量一般在300-1，000株左右；在一个生长季节利用幼胚转化可获得10，000株以上的转基因再生玉米；步骤4)每两周处理一批种子，每次500-2，000粒，可获得500个以上合格的胚芽鞘节;步骤5)所述的胚芽鞘节是指幼苗凸起的顶端分生组织。除玉米生长季节之外采用胚芽鞘节诱导愈伤转化每年可获得10，000株以上的转基因再生玉米；获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。本发明的主要技术效果在于:I)本发明巧妙地将幼胚和胚芽鞘节诱导愈伤组织两种外植体转化方法结合在一起，有效地克服了玉米转化缺乏受体材料、费用昂贵的缺点，易于实现周年规模化转化，从而获得大批转基因苗；2)幼胚转化的受体材料分批种植可持续3-4个月提供幼胚，有效地实现了规模化转化。3)采用的胚芽鞘节可随时由成熟种子发芽获取，不受季节限制，在冬季也无需象幼胚一样在温室或南繁获取，因此转化时取材方便、费用低廉；4)发明采用的胚芽鞘节诱导愈伤组织效率比成熟胚、叶片等外植体高，且单个胚芽鞘节可获取2-3次愈 伤组织，因此容易实现大规模的植株再生、扩繁效果明显；5)发明采用胚芽鞘节诱导的I型愈伤组织状态要明显好于由成熟胚、叶片获得的愈伤组织，容易转化成II型愈伤组织，从而分化成苗，再生效率较高，具有很好的应用前景。
图1为田间玉米分批种植图2为幼胚转化共培养图3为玉米萌芽的种子。图4为切取的玉米胚芽鞘节。图5为胚芽鞘节诱导出愈伤组织。图6为愈伤组织的扩繁。图7为⑶S染色。图8为抗性愈伤组织的筛选。图9为抗性胚状体。图10为分化成苗。图11为生根培养。图12为大批转基因再生苗。图13为PCR检测。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例一大规模根癌农杆菌介导玉米幼胚的转化1.田间分批材料的种植在玉米生长季节分批播种玉米受体材料，一般间隔4-7天播种一次。早春气温低时可采取育苗、铺地膜、架小拱棚等办法促进玉米生长。在玉米散粉前严格套袋，自交或姊妹交，每天将授粉株数控制在大致相同的数量。授粉9-13天，幼胚长至1.5-2.0mm时取果穗剥胚，尽量缩短取果穗和剥胚中间间隔的时间。2.根癌农杆菌(含目的基因)的制备(I)农杆菌感受态的制备:挑取根癌农杆菌单菌落于YEP液体培养基中振荡培养过夜，取过夜培养菌液接种于50ml含相应抗生素的YEP液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.3-0.5，5，OOOrpm,离心5min收集菌体，以10 ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，
5,OOOrpm离心5min收集菌体，以Iml预冷的20mM CaCl2悬浮细胞,分装成每管200 μ I,液氮中速冻I分钟，置于_70°C保存备用。(2)植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化:取200 μ I感受态细胞，加入I μ g鉴定正确的质粒DNA (表达载体)，混匀，冰浴30分钟；液氮中速冻I分钟，37°C水浴5分钟，加入Iml含相应抗生素的YEP培养基，28°C慢速振荡培养4小时，1，OOOOrpm离心30sec,弃上清；加入300 μ I含相应抗生素的YEP培养基重新悬浮细胞，涂布于含有相应抗生素的YEP平板上，28°C培养约48小时。(3)根癌农杆菌菌液的制备:从_80°C冰箱中挑取含有目的载体的农杆菌单菌落，用枪头在加有相应抗生素的固体AB培养板上划线，在28°C黑暗条件下培养2-3天。从AB平板上挑取单斑在含有相应抗生素的YEP平板上划线，在20°C黑暗条件下培养3天。用细菌接种环(5毫米)刮取培养三天的菌落，悬浮在5ml的浸染液中，将菌液混匀，将其浓度调整为OD55tl=0.35，230C IOOrpm摇动4_5小时后进行转化。上述的YEP液体培养基和固体AB培养板是分子生物学中常用的两种培养基。3.根癌农杆菌介导玉米幼胚的转化(I)玉米幼胚的剥取:玉米种子播种于温室或大田中，授粉后9-13天，幼胚长约1.5-2.0mm时，取玉米幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。(2)根癌农杆菌感染玉米材料、共培养及恢复培养:将剥取的幼胚放入浸染液中。当农杆菌准备好时，用含有100 μ M AS (乙酰丁香酮)的浸染液将幼胚清洗2遍，加入农杆菌菌液，振荡30秒，静置5分(在大规模操作中，为了使每一管浸染时间平衡，应多人同时配合，一个人向离心管中加菌液，并开始计时，另外几个人按加管先后顺序分组振荡，当计时5分种结束时，仍然按加管先后顺序将管中混合物撒向灭菌滤纸)。置于共培养培养基上23°C培养3天，3天后将转化后材料移入恢复培养基上暗培养一周。(3)抗性愈伤组织的筛选与再生:在恢复培养基上暗培养一周后的转化材料移入筛选培养基上筛选一轮，每2周为一轮,然后移入第二轮筛选培养基上筛选。转化后5-10周即可出现type II型抗性愈伤组织，将其转入胚状体诱导培养基上培养10-14天。将诱导形成的胚状体转入到分化培养基上进行分化，经过8-10天生长后，出现再生幼苗。上述的浸染液是在N6基本培养基中添加如下物质:蔗糖68.5g/L，葡萄糖36g/L，L-脯氨酸 0.7g/L，2， 4-D 1.5mg/L，ρΗ5.2。
上述的共培养培养基是在N6基本培养基中添加如下物质:蔗糖30g/L，L-脯氨酸 0.7g/L，2，4-D 1.5mg/L,硝酸银 0.85mg/L, L-半胱氨酸 0.3g/L，DTT (二硫代苏糖醇)
0.15g/L,乙酰丁香酮 IOOmM, ρΗ5.8。上述的恢复培养基是在Ν6基本培养基中添加如下物质:蔗糖30g/L，L-脯氨酸
0.7g/L, 2，4-D 1.5mg/L，硝酸银 0.85mg/L，MES (2-吗啉乙磺酸)0.5g/L，头孢霉素 0.25g/L, ρΗ5.8ο上述的筛选培养基是在Ν6基本培养基中添加如下物质:蔗糖30g/L，L-脯氨酸
0.7g/L, 2，4-D 1.5mg/L,硝酸银 0.85mg/L, MES 0.5g/L,头孢霉素 0.25g/L, Bialaphos
1.5_3mg/L, pH5.8。上述的胚状体诱导培养基是在MS基本培养基中添加如下物质:蔗糖60g，头孢霉素 0.25g/L, Bialaphos 1.5mg/L, pH5.8。上述的分化培养基是在MS基本培养基中添加如下物质:蔗糖30g，pH5.8。4.数据统计我们以除草剂作为筛选压，经过一个生长季节的转化，获得了 14，320个转基因玉米再生植株(表1)。
权利要求
1.一种周年连续大规模转化玉米的方法，将幼胚和胚芽鞘节诱导愈伤组织为外植体的两种转化方法结合，主要包括以下步骤: 1)在玉米生长季节分批播种玉米受体材料，间隔4-7天播种一次； 2)将上述步骤I)中播种的玉米在散粉前严格套袋，自交或姊妹交，每天将授粉株数控制在相同的数量； 3)上述步骤2)中授粉的玉米在授粉后9-13天，幼胚长至1.5-2.0mm时，剥取幼胚进行根癌农杆菌介导的转化，将幼胚放入侵染液中侵染，置于共培养培养基上培养，移入恢复培养基上暗培养一周，随后移入筛选培养基上筛选2 — 4轮，在胚状体诱导培养基上诱导形成胚状体，转入到分化培养基上进行分化，得再生苗； 4)在当年无法获得上述步骤3)的幼胚的时间段里，将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗； 5)将上述步骤4)中得到的幼苗切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织； 6)将上述步骤5)中得到的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上进行继代； 7)用农杆菌介导法将外源基因转化上述步骤6)中的愈伤组织； 8)将上述步骤7)中得到的愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体； 9)将上述步骤8)中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗； 10)将上述步骤3)和9)中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于: 浸染液是 N6 +鹿糖 68.5g/L + 葡萄糖 36g/L + L-脯氨酸 0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L ； 共培养培养基是N6 +蔗糖30g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4_D 1.5mg/L +硝酸银0.85mg/L + L-半胱氨酸0.3g/L + 二硫代苏糖醇0.15g/L +乙酰丁香酮IOOmM ； 恢复培养基是N6 +蔗糖30g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L+硝酸银0.85mg/L + 2-吗啉乙磺酸0.5g/L +头孢霉素0.25g/L ； 筛选培养基是N6基本培养基+蔗糖30g/L + L-脯氨酸0.7g/L + 2，4_D 1.5mg/L +硝酸银 0.85mg/L + 2-吗啉乙磺酸 0.5g/L +头孢霉素 0.25g/L + Bialaphos 1.5_3mg/L ；胚状体诱导培养基是MS +鹿糖60g +头孢霉素0.25g/L + Bialaphos 1.5mg/L ；分化培养基是MS +蔗糖30g ； 发芽培养基是MS +麦芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L + 2-吗啉乙磺酸 2g/L + MgCl2*6H20 1.6g/L +抗坏血酸 0.lg/L + 6-BA 3mg/L + 毒莠定 0.0lg/L ； 愈伤组织诱导培养基是MS+蔗糖30g/L+维生素B1 0.5mg/L+酶水解酪蛋白0.5g/L + 脯氨酸 1.5g/L + 硝酸银 5mg/L + 2, 4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.001mg/L ； 胚状体诱导培养基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 6-BA 2mg/L ； 再生培养基是MS +蔗糖20g/L +肌醇0.lg/L。
3.如权利要 求1所述的方法，其特征在于获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。
全文摘要
本发明涉及一种周年大规模转化玉米的方法，属于农业生物技术和作物育种领域。其主要步骤包括(1)在玉米生长季节分批相隔4-7天播种玉米受体材料；(2)授粉是自交或姊妹交，每天将授粉株数控制在大致相同的数量；(3)授粉后9-12天剥取幼胚进行根癌农杆菌介导法转化；(4)在无法获取幼胚的其它时间采用玉米种子萌发获得幼苗；(5)截取胚芽鞘节诱导愈伤组织并进行继代；(6)采用根癌农杆菌介导法转化愈伤组织。该方法有效克服了玉米转化缺乏受体材料、费用昂贵的缺点，易于实现周年规模化转化，从而获得大批转基因苗。
文档编号A01H4/00GK103173487SQ201310142200
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者万向元, 方才臣, 吴锁伟, 赵虎基, 刘艳艳, 张丹凤, 肖中华, 徐媛媛, 王燕, 安学丽, 王超 申请人:北京金冠丰生物技术有限公司