一种水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法
【专利摘要】本发明属于转基因环境生物安全检测分析【技术领域】，具体为一种水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法。本发明利用人工修饰EPSP合成酶抗除草剂转基因水稻和非转基因水稻及其野生稻近缘种群体为分析材料，进行人工杂交，建立含有epsps转基因和不含该转基因的杂种F1群体以及含该转基因和不含该转基因的F2分离代实验群体；将这些实验群体分别在有草甘膦和无草甘膦的环境下进行不同方式种植，并对5个适合度相关性状进行测量。通过计算转基因对群体带来的复合适合度指数，检测抗除草剂转基因逃逸对野生近缘种带来的环境风险。本发明检测结果准确，效率高，对于抗除草剂转基因水稻生产的环境安全保证具有良好的应用前景。
【专利说明】一种水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境生物安全检测分析【技术领域】，具体涉及水稻抗除草剂转基因Cepsps)逃逸导致的环境风险检测评价方法。
【背景技术】
[0002]转基因技术的迅速发展，极大地推动了转基因植物的培育和种植，转基因作物的商品化应用，为农作物产量的提高、减少农药的施用、改善农业生态环境以及粮食安全问题带来了新的机遇。然而，转基因作物商品化种植面临的一个巨大瓶颈就是环境生物安全的检测和评价，特别是作物转基因的逃逸及其可能带来的环境风险，即转基因通过基因漂移逃逸到作物的野生近缘种之后，可能带来严重的杂草问题和野生近缘种群体的局部濒危和灭绝等一系列后果。这种环境风险的存在严重地制约了转基因作物商品化种植的决策。因此，在商品化种植之前必须对转基因逃逸可能带来的潜在环境风险进行检测和评估，以确保转基因作物的安全和可持续利用。
[0003]抗除草剂转基因作物通过改变作物的抗除草剂性能和除草方式来提高生产效率，是目前种植面积最大的转基因作物类型。但是对抗除草剂转基因逃逸到作物的野生近缘种中是否会导致生态风险，至今尚无有效的检测和评价工具。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种检测评价抗除草剂转基因逃逸后是否导致环境风险的方法。
[0005]抗除草剂转基因逃逸是否会带来环境风险，这在很大程度上取决于该转基因逃逸到作物的野生近缘种后是否会导致作物野生近缘种适合度(指在一定条件环境下，生物体能够生存并传递其基因给后代的能力)发生较大程度的改变，当适合度有较大程度的增加(适合度利益)或降低(适合度成本)均可能导致不同的环境风险。本发明利用抗除草剂转基因i印sps)在人工受控的实验条件下对水稻的野生近缘种群体带来适合度“利益”和“成本”变化的关键性状进行分析，对转基因逃逸是否导致环境风险以及风险的程度进行检测，以达到抗除草剂转基因作物安全种植的目的。
[0006]本发明提出的抗除草剂转基因逃逸导致的环境风险的检测评价方法，具体步骤包括:
(1)构建含有人工修饰EPSP合成酶(印sps)抗除草剂转基因和不含该转基因的水稻野生近缘种实验群体；
(2)设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验；
(3)建立转基因逃逸导致环境风险的检测和评价标准。
[0007]其中:步骤(1)所述构建含有该人工修饰抗除草剂转基因和不含该转基因水稻野生近缘种实验群体，是按照一定的组合方式，利用人工杂交的方法，获得目标转基因水稻和野生近缘种的杂种F1代和自交分离F2代实验群体来实现，具体步骤为:
选择印sps抗除草剂转基因水稻及其非转基因亲本品种，分别与野生近缘种的个体进行杂交，获得含抗除草剂转基因的转基因水稻与其野生近缘种(包括杂草稻)的杂种F1群体CA),以及不含转基因的水稻亲本品种与野生近缘种的杂种F1群体(B);通过对含转基因的杂种Fl群体(A)进行套袋自交，获得F2代分离群体；同时利用目标转基因(印印^ DNA序列设计的引物，对F2代分离群体进行PCR扩增和检测，鉴定含有转基因的F2群体(C)和不含转基因的F2群体(D);建立含有抗除草剂转基因和不含转基因的F2代实验分离群体。
[0008]所获得的含有抗除草剂转基因的杂种F1群体(Α)、不含转基因的杂种F1群体(B)，含有转基因的自交F2分离群体(C)和不含转基因的自交F2分离群体(D)，用于进行受控实验条件下的适合度分析实验。
[0009]步骤(2)所述设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验，是将获得的A、B、C、D实验群体分别按20cm X 20cm (杂草稻)或40cm X 40cm (普通野生稻)的种植株间距离和行间距离，将含转基因和不含转基因的A和B群体或C和D群体在一个小区内进行单一种植和相间混合种植(见图1-3);即分为3种不同种植模式:(I)转基因植株的单一种植模式，(2)非转基因植株的单一种植模式，(3)转基因植株和非转基因植株的相间混合种植模式。
[0010]将受控的实验环境分别设计为有除草剂选择压(草甘膦在水稻田中除草的正常使用量的1/4剂量)的环境和无除草剂选择压的环境，将上述实验群体分别重复种植于有除草剂选择压的环境和无除草剂选择压的环境，并对实验群体所有植株生活史各生长阶段的适合度相关性状分别进行测量。
[0011]步骤(3)所述建立抗除草剂转基因逃逸之后导致环境风险的检测和评价标准，即建立复合适合度指数，来评价转基因逃逸后带来的环境风险的程度，用％表示:· 各形态性状的适合度指数(％)=(含转基因植株的测量值-不含转基因植株的测量值)/不含转基因植株的测量值X 100% ；
复合适合度指数为5个形态性状，即:株高，单株分蘖数，单株穗数，单株种子产量和结实率适合度指数的平均数。
[0012]通过复合适合度指数的值，评价转基因逃逸之后导致的环境风险(％)。复合适合度指数的绝对值即为环境风险的评价值。复合适合度指数的绝对值越接近于0，环境风险越低，反之风险越高。
[0013]评价转基因逃逸后导致的环境风险程度，主要以F2群体的复合适合度指数为依据(因为含转基因和不含转基因F2分离群体的遗传背景一致)，以F1群体的复合适合度指数为辅助参考。
[0014]本发明中，所述按照一定的组合方式，利用人工杂交获得目标转基因水稻和野生近缘种的杂种F1代和自交分离F2代实验群体，具体步骤为:
(1)确定杂交组合:
A.抗除草剂转基因水稻X水稻野生近缘种；
B.非转基因水稻X水稻野生近缘种；
(2)通过人工杂交，分别获得含抗除草剂转基因杂交组合A，以及不含转基因组合B的杂种F1群体；(3)对组合A的杂种F1群体进行套袋自交和抗除草剂转基因的分子检测，鉴定F2分离群体中包含转基因的个体和不包含转基因的个体；
(4)基于鉴定结果，分别建立含抗除草剂转基因的F2分离群体(+)和不含转基因的F2分离群体(一)。
[0015]本发明中，所述适合度相关性状的选择和测量方法如下:
(1)株高(Cm):从植株的地面到最长茎、叶或穗顶端的高度；
(2)单株分蘖数(个):每一单个植株的所有分蘖数总合；
(3)单株穗数(个):每一单个植株所有的穗数总合；
(4)单株种子产量(粒):每一单个植株的所有饱满种子数总合；
(5)结实率(％):单株饱满种子数/单株总小花数X100%ο
[0016]本发明中，具体选择如下适合度相关性状数据进行测量和分析:
根据受控实验中各处理含有转基因的实验群体和不含转基因实验群体所测量的数据的比较分析，来检测转基因对野生近缘种带来的适合度利益或适合度成本，并以此为依据确定转基因逃逸导致的环境风险；如转基因对实验群体带来的适合度变化程度越高则转基因逃逸的环境风险越高，反之则风险低或无风险；
适合度利益或适合度成本的指数值(r )计算公式为: w =(含转基因植株的测量值-不含转基因植株的测量值)/不含转基因植株的测
量值 X 100%........................................................................(I)
w的值变化在一c?~+ c?之间，当r值为正值，表示存在适合度利益，当r值为负值，表示存在适合度成本，当r值为ο或接近于0，表示没有适合度变化。
[0017]复合适合度指数(r_p)为各性状适合度的平均值，计算公式为:
【权利要求】
1.一种水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法，其特征在于具体步骤为: (1)构建含有人工修饰EPSP合成酶(e/zs/zs)抗除草剂转基因和不含该转基因的水稻野生近缘种实验群体； (2)设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验； (3)建立转基因逃逸导致环境风险的检测和评价标准； 其中: 步骤(1)所述构建含有人工修饰抗除草剂转基因和不含该转基因水稻野生近缘种实验群体，是按照一定的组合方式，利用人工杂交的方法，获得目标转基因水稻和野生近缘种的杂种F1代和自交分离F2代实验群体来实现，具体步骤为: 选择印sps抗除草剂转基因水稻及其非转基因亲本品种，分别与野生近缘种的个体进行杂交，获得含抗除草剂转基因的转基因水稻与其野生近缘种的杂种F1群体，记为A，以及不含转基因的水稻亲本品种与野生近缘种的杂种F1群体，记为B ;通过对含转基因的杂种F1群体进行套袋自交，获得F2代分离群体；同时利用目标转基因(印5/zs)DNA序列设计的引物，对F2代分离群体进行PCR扩增和检测，鉴定含有转基因的F2群体，记为C，以及不含转基因的F2群体，记为D ;以此建立含有抗除草剂转基因和不含转基因的F2代实验分离群体；所获得的含有抗除草剂转基因的杂种F1群体、不含转基因的杂种F1群体，含有转基因的自交F2分离群体和不含转基因的自交F2分离群体，用于进行受控实验条件下的适合度分析实验； 步骤(2)所述设计用于转基因逃逸导致环境风险检测的田间种植实验，是将获得的A、B、C、D实验群体分别按杂草稻为20cm X 20cm或普通野生稻为40cm X 40cm的种植株间距离和行间距离，将含转基因和不含转基因的A和B群体或C和D群体在一个小区内进行单一种植和相间混合种植；即分为3种不同种植模式:I)转基因植株的单一种植模式，2)非转基因植株的单一种植模式，3)转基因植株和非转基因植株的相间混合种植模式； 将受控的实验环境分别设计为有除草剂选择压的环境和无除草剂选择压的环境，将上述实验群体分别重复种植于有除草剂选择压的环境和无除草剂选择压的环境，并对实验群体所有植株生活史各生长阶段的适合度相关性状分别进行测量； 步骤(3)所述建立抗除草剂转基因逃逸之后导致环境风险的检测和评价标准，即建立复合适合度指数，来评价转基因逃逸后带来的环境风险的程度，用％表示: 各形态性状的适合度指数(％)=(含转基因植株的测量值-不含转基因植株的测量值)/不含转基因植株的测量值X 100% ； 复合适合度指数为5个形态性状，即:株高，单株分蘖数，单株穗数，单株种子产量和结实率适合度指数的平均数； 通过复合适合度指数的值，评价转基因逃逸之后导致的环境风险(％)，复合适合度指数的绝对值即为环境风险的评价值；复合适合度指数的绝对值越接近于0，环境风险越低，反之风险越闻； 评价转基因逃逸后导致的环境风险程度，主要以F2群体的复合适合度指数为依据，以F1群体的复合适合度指数为辅助参考。
2.根据权利要求1所述的水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法，其特征在于所述按照一定的组合方式，利用人工杂交获得目标转基因水稻和野生近缘种的杂种F1代和自交分离F2代实验群体，具体步骤为: (1)确定杂交组合如下: (a)抗除草剂转基因水稻X水稻野生近缘种； (b)非转基因水稻X水稻野生近缘种； (2)通过人工杂交，分别获得含抗除草剂转基因杂交组合a，以及不含转基因组合b的杂种F1群体； (3)对组合a的杂种F1群体进行套袋自交和抗除草剂转基因的分子检测，鉴定F2分离群体中包含转基因的个体和不包含转基因的个体； (4)基于鉴定结果，分别建立含抗除草剂转基因的F2分离群体(+)和不含转基因的F2分离群体(一)。
3.根据权利要求1所述的水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法，其特征在于所述适合度相关性状的选择和测量方法如下: (1)株高，单位cm:从植株的地面到最长茎、叶或穗顶端的高度； (2)单株分蘖数:每一单个植株的所有分蘖数总和； (3)单株穗数:每一单个植株所有的穗数总和； (4)单株种子产量:每一单个植株的所有饱满种子粒数总和； (5)结实率:单株饱满种子数/单株总小花数X100%。
4.根据权利要求1所述的水稻抗除草剂转基因逃逸导致环境风险的检测评价方法，其特征在于具体选择如下适合度相关性状数据进行测量和分析: 根据受控实验中各处理含有转基因的实验群体和不含转基因实验群体所测量的数据的比较分析，来检测转基因对野生近缘种带来的适合度利益或适合度成本，并以此为依据确定转基因逃逸导致的环境风险；如转基因对实验群体带来的适合度变化程度越高则转基因逃逸的环境风险越高，反之则风险低或无风险； 适合度利益或适合度成本的指数值r计算公式为: r =(含转基因植株的测量值-不含转基因植株的测量值)/不含转基因植株的测量值 X 100%(I) w的值变化在一c?~+c?之间，当r值为正值，表示存在适合度利益，当r值为负值，表示存在适合度成本，当r值为ο或接近于0，表示没有适合度变化； 复合适合度指数rramp为各性状适合度的平均值，计算公式为: K- = Σ W1- / 5(2) 其中，i为第i个不同的适合度相关性状?’当K-的值为O时，表明转基因逃逸后不会导致环境风险，当的值小于5%时，表明转基因逃逸后导致的环境风险较小，而当的值大于5%时，表明转基因逃逸后导致的环境风险较大。
【文档编号】A01H1/04GK103563739SQ201310590335
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】卢宝荣, 蔡星星, 汪魏, 杨箫 申请人:复旦大学