一种豆粕饲料添加剂的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种豆粕饲料添加剂的生产方法，包括：将枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）CGMCC?No.7690接入种子培养基中培养，制备种子液；将所述种子液接入液体发酵培养基中，逐级进行2～4次10倍放大发酵，获得液体发酵菌液；将所述液体发酵菌液接入灭菌豆粕中，置于发酵床上进行固体发酵，控制发酵床温度为25～60℃，通气量为0.1～10L/min，发酵时间为24～96h，发酵期间翻料1～5次，获得豆粕饲料添加剂。本发明采用枯草芽孢杆菌进行单菌种液固联合发酵，获得的豆粕饲料添加剂中，小肽含量和粗蛋白含量显著增加，抗营养因子被大量降解。
【专利说明】一种豆粕饲料添加剂的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于豆柏发酵【技术领域】，具体涉及一种豆柏饲料添加剂的生产方法。
【背景技术】
[0002]二十世纪九十年代以来，在英国疯牛病危机之后，世界各国纷纷禁止动物源蛋白质在饲料中使用。这意味着能够提供优质蛋白质的大豆和大豆蛋白制品必将在今后的畜禽饲料配制中扮演更加重要的角色。
[0003]然而，大豆中含有的抗营养因子降低了养分的有效性，限制了其在动物饲料中的使用。目前，人们把对营养物质的消化、吸收和利用产生不利影响以及使人和动物产生不良生理反应的物质，统称为抗营养因子(antinutritional factors, ANFs)。大豆中抗营养因子主要包括抗原蛋白(大豆球蛋白、P -伴大豆球蛋白等)、凝集素、胰蛋白酶抑制因子、异黄酮、不良寡糖(棉籽糖、水苏糖等)、植酸等。这些抗营养因子通过干扰营养物质的消化吸收、破坏正常的新陈代谢和引起不良的生理反应等多种方式危害人和动物尤其是幼龄动物的生长和健康，在很大程度上影响了大豆及其制品的利用。
[0004]目前消除大豆抗营养因子的方法主要包括热处理；植物育种与基因改良；微生物发酵等。热处理技术对胰蛋白酶抑制因子、凝集素、脲酶等热敏性抗营养因子有很好的钝化效果，但进行热处理时，必须保证热处理的强度适宜。加热不足则抗营养因子破坏不够；力口热过度则氨基酸利用率下降，会降低蛋白质的生物学效率。通过植物育种途径，培育低抗营养因子或无抗营养因子的植物品种以及改善大豆蛋白品质，是降低或消除抗营养因子的根本途径，但转基因大豆的安全性问题还需要进一步的研究证实。此外，抗营养因子是植物用于防御的物质，降低其含量可能对植物本身引起负作用，如产量、抗病能力降低，而且育种周期较长、成功率低，成本较高。
[0005]而通过微生物发酵的方法消除大豆抗营养因子就不存在上述问题。生物发酵过程中，微生物大量增殖，其结果不仅提高了发酵大豆蛋白基料的蛋白质水平，而且部分大豆蛋白质发酵时转化为菌体蛋白，改变了大豆蛋白质的营养品质。微生物在发酵过程中可产生水解酶、发酵酶和呼吸酶，这些酶能够将大豆蛋白分解成小分子蛋白和小肽分子，游离氨基酸和UGF (未知生长因子)等物质，可以消除植物蛋白原料中的抗营养物质，有利于动物的消化吸收。微生物在发酵过程中还将大部分动物不能直接利用的植酸等无机盐转化为细胞中的有机盐，不仅提高了利用率，还可降低饲料中总磷等的含量，减少饲料对养殖环境的污染。
[0006]现有通过微生物发酵的方法消除大豆抗营养因子技术中常常是多菌种联合发酵，各种菌种相互影响，所得产品质量不够稳定；有的还需要添加复合酶协助菌种发挥作用，但复合酶本身的耐受性和稳定性的研究和开发还不够完善，另外，添加酶的量要适量，过量会扰乱消化道的正常消化机能而产生不良作用。最终获得的发酵豆柏中，蛋白类抗营养因子的转化率也有待提高。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种豆柏饲料添加剂的生产方法，利用该方法获得的豆柏饲料添加剂中抗营养因子含量显著降低。
[0008]一种豆柏饲料添加剂的生产方法，包括:
[0009](I)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) CGMCC N0.7690接入种子培养基中培养，制备种子液；
[0010](2)将所述种子液接入液体发酵培养基中，逐级进行2?4次10倍放大发酵，获得液体发酵菌液；
[0011](3)将所述液体发酵菌液以I?30%接种量接入含水量为30?60%的灭菌豆柏中，置于发酵床上进行固体发酵；
[0012]所述发酵床包括依次连接的上料装置、发酵装置和下料装置；发酵装置包括2?5个从上至下错位分布的链带式发酵层间，每一发酵层间的发酵条件控制在:温度为25?60°C，通气量为0.1?10L/min ;发酵期间控制翻料在I?5次，总发酵时间控制在24?96h，发酵完成后经烘干获得豆柏饲料添加剂。
[0013]本发明采用枯草芽孢杆菌CGMCC N0.7690进行单菌种液固联合发酵，且固体发酵在发酵床上进行，该发酵床能自动控温、自动上下料、自动翻料、自动通气，实现对发酵过程中各参数的精确掌控。固体发酵前在发酵罐中进行放大发酵，为大规模的固体发酵提供足够的发酵菌液；逐级放大发酵过程中也较易发现枯草芽孢杆菌含有的杂菌，保证进行固体发酵时发酵菌液纯净，避免杂菌对枯草芽孢杆菌对豆柏的发酵转化产生不必要的影响。
[0014]本发明的发酵床能够自动上下料、自动控温、自动调节通气量、自动翻料。其中，利用上料装置和下料装置实现自动上下料，发酵过程在上下错位分布的多个发酵层间上进行，当料堆温度高于设定温度时，上层发酵层间的物料被转至下层上发酵层间，实现翻料。具体地，本发明一种豆柏饲料添加剂的生产方法，包括:
[0015](I)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) CGMCC N0.7690接入种子培养基中培养，制备种子液；
[0016]所述种子培养基可选用营养肉汤基础培养基，以IL计,营养肉汤基础培养基的配方为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH6.5?8.5。接种后置于30?45°C，100?300r/min震荡培养12?72h，保证种子液中不含其他杂菌；优选地，接种后置于35?40°C,200r/min震荡培养24?48h ;更优选地，接种后置于37°C，200r/min震荡培养24h ；制得的种子液中，含菌量优选为IO6?101(lCFU/mL，更优选为IO8?101(lCFU/mL，保证液体发酵起始时，发酵体系中含有足够的含菌量。
[0017](2)将所述种子液接入液体发酵培养基中，逐级进行2?4次10倍放大发酵，获得液体发酵菌液；
[0018]所述种子液的接种量优选为I?30% ;更优选为10?15%，最优选为10%。接种量太小易感染杂菌，也难以获得处于对数增长期的种子液；接种量太大则会出现菌体相互干扰现象。
[0019]以IL计，所述液体发酵培养基中含有:蛋白胨10?50g/L，牛肉膏3?15g/L，氯化钠5?25g/L，pH6.5?8.5。与种子培养基相比，液体发酵培养基中，各成分的含量适当增大，保证发酵过程中营养供给充足，不需要另外添加，避免添加液体发酵培养基时可能发生的染菌状况。
[0020]本发明中，所述液体发酵培养基中还含有5?100g/L的优先利用碳源。优先利用碳源有利于保证液体发酵起始时，菌体能迅速扩增繁殖，形成优势菌种，抑制其他杂菌生长。所述优先利用碳源可选用果糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、豆浆中的至少一种，更优选为20-40g/L的葡萄糖，最优选为20g/L的葡萄糖。优先利用碳源浓度太大不仅会抑制菌体生长，而且也会降低菌体对豆柏的利用率。
[0021]逐级进行放大发酵时，取前一次发酵获得的发酵菌液接入新的液体发酵培养基中，接种量优选为I?30%。更优选为10?15%，最优选为10%。放大发酵在相应规格的发酵罐中进行，发酵罐条件控制在:温度为25?60°C，通气量为0.1?10L/min，pH为5?10，发酵时间12?96h ;优选为控制在:温度为35?40°C，通气量为I?10L/min，pH为
6.5?8.5，发酵时间24?48h ;更优选为温度控制在35°C，发酵时间为48h，每次放大发酵完成时，应保证发酵菌液中含菌量为IO6?101(lCFU/mL，优选为IO8?101(lCFU/mL。最后一次放大发酵完成后，获得所述液体发酵菌液。
[0022]发酵罐的出料口安装有流量计和阀门，出料口与所述上料装置密封连接，流量计控制所述液体发酵菌液的接种量为10?15%，且所述液体发酵菌液的含菌量为IO8?1010CFU/mL ;更优选为:含菌量101QCFU/mL，接种量10%。
[0023](3)将含菌量为IO8?101(lCFU/mL的液体发酵菌液接入含水量为30?60%的灭菌豆柏中，置于所述发酵床上进行固体发酵；灭菌豆柏的含水量更优选为40?50%，保证枯草芽孢杆菌生长所需的湿润环境。
[0024]与液体培养基相同，灭菌豆柏中也5?100g/L的优先利用碳源，所述优先利用碳源可选用果糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、豆浆中的至少一种，更优选为20-40g/L的葡萄糖，最优选为20g/L的葡萄糖。葡萄糖为细菌喜爱的单糖，较易利用。
[0025]液体发酵菌液与灭菌豆柏在上料装置内拌匀后，物料从上料装置的出料口输出，铺设在最上层的发酵层间上进行发酵；优选地，每一发酵层间的发酵条件控制在:温度为30?35°C，通气量为I?10L/min。并且，每一发酵层间上料堆厚度为10?30cm，料堆温度高于45?55°C时，相邻发酵层间的链带向相反方向同速运转，进行翻料；发酵期间控制翻料在I?5次，总发酵时间控制在48?72h。
[0026]更优选地，每一发酵层间的发酵条件控制在:温度为35°C，通气量为I?10L/min，每一发酵层间上料堆厚度为14?18cm，料堆温度高于45°C时进行翻料，总发酵时间控制在72h。
[0027]通过运转方向不同的链带将物料从上一发酵层间被转移到下一发酵层间上，以此类推，当上一发酵层间的物料被转移时，又可继续上料进行新一轮的发酵，保证发酵过程连续、自动进行。当完成发酵后，最下层的发酵层间上的物料被转移到下料装置，经烘干后，即获得本发明所述豆柏饲料添加剂。
[0028]本发明还提供了所述豆柏饲料添加剂在制备猪饲料中的应用，包括在猪基础日粮中添加2?4%的豆柏饲料添加剂，获得所述猪饲料。豆柏饲料添加剂的添加量更优选为3%。所述猪基础日粮的组成为:玉米70.15%、豆柏22.0%、鱼粉5.0%、磷酸氢钙1%、石粉0.55%、食盐0.3%、仔猪预混料1%。
[0029]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:[0030]本发明采用枯草芽孢杆菌CGMCC N0.7690进行单菌种液固联合发酵，通过严格控制液体放大发酵中各种条件(如温度、pH、通气量等)从而纯化菌种、去除杂菌，并为固体发酵提供足够的菌体；固体发酵在自动控温、自动上下料、自动翻料、自动通气的发酵床上进行，实现对发酵过程中各参数的精确掌控；最终获得的豆柏饲料添加剂中，抗营养因子被大量降解，其中，胰蛋白酶抑制因子的降解率达93.6%，大豆球蛋白的降解率达88.63%，P -伴大豆球蛋白的降解率达89.06%;并且通过该发明获得的豆柏饲料添加剂，蛋白质含量明显提高，其蛋白含量多达54.22%。小肽含量显著增加，其酸溶蛋白含量高达14.74%，蛋白质营养品质得到改善。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明豆柏饲料添加剂生产方法中所用发酵床的结构示意图；
[0032]其中，1:第一发酵层间，2:第二发酵层间，3:第三发酵层间，4:第四发酵层间，5:履带输送器，6:三级发酵罐，61:流量计，62:阀门，7:混料器，71:螺旋输送机，8:二级发酵罐，81:抽真空泵。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]本【具体实施方式】一种豆柏饲料添加剂的生产方法，包括:
[0035](I)将枯草芽孢杆菌CGMCC N0.7690经斜面活化后，刮取少量接入营养肉汤基础培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.0，121°C高压灭菌20min ;冷却备用)中，置于37°C下，200r/min震荡培养24h，制备3L种子液；血球计数板计数含菌量，确保含菌量达10lclCFU/mL ；
[0036](2)将3L种子液接入含30L液体发酵培养基(蛋白胨20g/L，牛肉膏6g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖20g/L，发酵罐内高温高压灭菌)的发酵罐中进行一级扩大发酵,控制罐内温度37°C，通气量5?8L/min，pH6.5?7.5，发酵24h后血球计数板计数含菌量，确保含菌量达 10lclCFU/mL ；
[0037](3)取步骤(2)获得的发酵菌液30L，接入含300L液体发酵培养基的的发酵罐中进行二级扩大发酵，控制罐内温度37°C，通气量I?10L/min，pH6.5?7.5，发酵24h后血球计数板计数含菌量，确保含菌量达101(lCFU/mL ；
[0038](4)取步骤(3)获得的发酵菌液300L，接入含3000L液体发酵培养基的的发酵罐中进行三级扩大发酵，控制罐内温度37°C，通气量5?8L/min，pH6.5?7.5，发酵24h后血球计数板计数含菌量，确保含菌量达101(lCFU/mL ；
[0039](5)利用步骤(4)获得的液体发酵菌液进行固体发酵，固体发酵在图1所示的发酵床上进行；
[0040]由图1可见，步骤(4)的液体发酵菌液位于三级发酵罐6内，三级发酵罐6的出料口安装有阀门62和流量计61。步骤(3)的发酵菌液位于二级发酵罐8内，利用抽真空泵81驱使发酵菌液经无菌管道进入三级发酵罐6中。
[0041]发酵床包括与发酵罐6的出料口密封连接的混料器7，进行固体发酵时，打开阀门62，将液体发酵菌液以3?5L/min的流速流入混料器7，流量计61控制液体发酵菌液的流速；在混料器7内，液体发酵菌液、灭菌豆柏及无菌葡萄糖水溶液(使物料中葡萄糖终浓度为20g/L)以IL:10kg:0.1L的比例混合，再用螺旋输送机71将物料从出料口输出。
[0042]位于螺旋输送机71出料口的第一发酵层间I逆时针转动，物料即均匀铺设在第一发酵层间I上，物料厚度为14?18cm ;铺设完成后停止转动进行发酵，温度控制在35°C，通气量为I?10L/min ;当料堆温度高于45°C时，第一发酵层间I逆时针转动，同时第二发酵层间2以相同速率顺时针转动，将物料均匀转移到第二发酵层间2上，继续发酵；如此反复，直至固体发酵完成(发酵72h);固体发酵完成后，物料被转移至履带输送器5上，经150?200 V烘干粉碎后，获得豆柏饲料添加剂。
[0043]实施例2
[0044]利用与实施例1相同的方法、设备进行发酵，但固体发酵中不添加葡萄糖，由此获得豆柏饲料添加剂。
[0045]实施例3
[0046]利用与实施例1相同的方法、设备进行发酵，液体发酵培养基中葡糖糖的添加量为40g/L，固体发酵时各组分混合完成后得到的物料中葡糖糖的浓度为20g/L，由此获得豆柏饲料添加剂。
[0047]实施例4
[0048]利用与实施例1相同的方法、设备进行发酵，控制发酵床温度为45°C，当料堆温度高于55°C时，第一发酵层间I逆时针转动，同时第二发酵层间2以相同速率顺时针转动，将物料均匀转移到第二发酵层间2上，继续发酵，由此获得豆柏饲料添加剂。
[0049]实施例5
[0050]本【具体实施方式】一种豆柏饲料添加剂的生产方法，包括:
[0051](I)将枯草芽孢杆菌CGMCC N0.7690经斜面活化后，刮取少量接入营养肉汤基础培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.0，121°C高压灭菌20min ;冷却备用)中，置于37°C下，200r/min震荡培养24h，制备IOL种子液；血球计数板计数含菌量，确保含菌量达10lclCFU/mL ；
[0052](2)利用步骤(I)获得的种子液进行固体发酵，固体发酵的方法与实施例1相同；由此获得豆柏饲料添加剂。
[0053]实施例6
[0054]本【具体实施方式】一种豆柏饲料添加剂的生产方法，包括:
[0055](I)将枯草芽孢杆菌CGMCC N0.7690经斜面活化后，刮取少量接入营养肉汤基础培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.0，121°C高压灭菌20min ;冷却备用)中，置于30°C下，200r/min震荡培养48h，制备3L种子液；血球计数板计数含菌量，确保含菌量达108CFU/mL ；
[0056](2)将3L种子液接入含30L液体发酵培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖30g/L，发酵罐内高温高压灭菌)的发酵罐中进行一级扩大发酵，控制罐内温度350C，通气量5?10L/min，pH6.5?7.5，发酵48h后血球计数板计数含菌量，确保含菌量达 108CFU/mL ；
[0057](3)取步骤(2)获得的发酵菌液30L，接入含300L液体发酵培养基的的发酵罐中进行二级扩大发酵，控制罐内温度35°C，通气量I?10L/min，pH6.5?7.5，发酵48h后血球计数板计数含菌量，确保含菌量达108CFU/mL ；
[0058](4)取步骤(3)获得的发酵菌液300L，接入含3000L液体发酵培养基的的发酵罐中进行三级扩大发酵，控制罐内温度35°C，通气量I~10L/min，pH6.5~7.5，发酵48h后血球计数板计数含菌量，确保含菌量达108CFU/mL ；
[0059](5)利用图1的发酵床进行固体发酵，其中，步骤(4)的液体发酵菌液与灭菌豆柏、无菌葡萄糖水溶液(使物料中葡萄糖终浓度为30g/L)的混合比例为2L:10kg:0.25L的比例混合，发酵条件控制在:控制在40°C，通气量为0.1~10L/min ;当料堆温度高于50°C时进行翻料，发酵时间为96h ;发酵完成后将物料于150~200°C下烘干粉碎，获得豆柏饲料添加剂。
[0060]分别取实施例1~6获得的豆柏饲料添加剂适量，采用NY/T2218-2012的检测方法检测各样品中粗蛋白、酸溶蛋白的含量，检测结果见表1。
[0061]表1各种豆柏饲料添加剂中粗蛋白和酸溶蛋白含量
【权利要求】
1.一种豆柏饲料添加剂的生产方法，包括: (1)将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtil is) CGMCC N0.7690接入种子培养基中培养，制备种子液； (2)将所述种子液接入液体发酵培养基中，逐级进行2?4次10倍放大发酵，获得液体发酵菌液； (3)将所述液体发酵菌液以I?30%接种量接入含水量为30?60%的灭菌豆柏中，置于发酵床上进行固体发酵； 所述发酵床包括依次连接的上料装置、发酵装置和下料装置；发酵装置包括2?5个从上至下错位分布的链带式发酵层间，每一发酵层间的发酵条件控制在:温度为25?60°C，通气量为0.1?10L/min ;发酵期间控制翻料在I?5次，总发酵时间控制在24?96h，发酵完成后经烘干获得豆柏饲料添加剂。
2.如权利要求1所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，每一发酵层间的发酵条件控制在:温度为30?35°C，通气量为I?10L/min。
3.如权利要求2所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，每一发酵层间上料堆厚度为10?30cm，料堆温度高于45?55°C时，相邻发酵层间的链带向相反方向同速运转，进行翻料；发酵期间控制翻料在I?5次，总发酵时间控制在48?72h。
4.如权利要求1所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，步骤(2)在发酵罐中进行，发酵罐的出料口安装有流量计和阀门，出料口与所述上料装置密封连接，流量计控制所述液体发酵菌液的接种量为10?15%，且所述液体发酵菌液的含菌量为IO8?101(lCFU/mL。
5.如权利要求1所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，以IL计，所述液体发酵培养基含有:蛋白胨10?50g/L，牛肉膏3?15g/L，氯化钠5?25g/L，pH6.5?8.5。
6.如权利要求5所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，所述液体发酵培养基或灭菌豆柏中还含有5?100g/L的优先利用碳源。
7.如权利要求6所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，所述优先利用碳源为果糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、豆浆中的至少一种。
8.如权利要求7所述豆柏饲料添加剂的生产方法，其特征在于，所述优先利用碳源为20?40g/L的葡萄糖。
9.如权利要求1?8任一所述豆柏饲料添加剂的生产方法制得的豆柏饲料添加剂。
10.如权利要求9所述的豆柏饲料添加剂在制备猪饲料中的应用，其特征在于，在猪基础日粮中添加2?4%的豆柏饲料添加剂，获得所述猪饲料。
【文档编号】A23K1/14GK103609864SQ201310632513
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】章亭洲, 曹杰, 朱廷恒, 王彦波, 赵川东, 刘茂峰 申请人:浙江科峰生物技术有限公司