一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法
【专利摘要】本发明涉及植物遗传育种【技术领域】，具体公开一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法。所述方法包括亲本选配、远缘杂交组合、杂种群体构建、2n雄配子的鉴定、高效发生2n雄配子资源筛选等步骤。本发明利用远缘杂交手段，获得高效发生2n雄配子的兰花资源，为在没有多倍体的条件下，利用有性杂交方法高效创建有性多倍体，有效促进兰花多倍体育种，培育突破性的兰花新品种奠定基础。
【专利说明】一种创建兰花高效发生2η雄配子资源的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物遗传育种【技术领域】，具体地涉及一种创建兰花高效发生2η雄配子资源的方法。
【背景技术】
[0002]兰花{Cymbidiim )是世界名花，集观赏、经济和文化价值于一身，深受世界各国人们的青睐。我国是兰花资源最丰富的国家，已知有49种，占世界总数的三分之二以上(刘仲健等，2006)，国外利用这些资源，在英国皇家学会已登录兰花集体杂种近15000个，并培育出大量的商业化品种，但国内培育出的兰花新品种和登录的杂种均较少，而具有商业化前景的品种数就更稀少。种质资源是育种的物质基础，创造关键性的种质资源是培育具有突破性品种的关键，因此研究种质资源的创新方法对更好利用我国兰花资源，培育具有突破性的兰花新品种具有十分重要的意义。
[0003]多倍体育种是兰花育种的重要手段，目前商业化的大花蕙兰品种多为多倍体(朱根发等，2006)，而创建多倍体资源是开展兰花多倍体育种的关键。兰花多倍体资源的创建可以通过物理、化学和生物学的方法，与传统的物理和化学法创造多倍体的方法相比，利用生物学(2n配子途径)创建多倍体具有独特的优越性，它不仅可直接获得三倍体，四倍体资源，而且可以传递亲本更高的杂合性以及能够克服杂种不育。目前国内外学者，利用2n雄配子途径已经成功获得百合；(Barba-Gonzalez et al, 2006; Barba-Gonzalez et al,2005)、月季(Crespel et al，2006)、秋海棠(Dewitte et al, 2010)和彩色马蹄莲(吴红芝等，2011)等具有重要的观赏价值的多倍体资源。
[0004]2n雄配子可自然发生也可以人工诱导，人工诱导2n雄配子的主要方法有物理方法和化学方法。物理方法包括温度激变、气体诱变和电离辐射等。化学方法包括秋水仙素、安磺灵(Oryzalin)及氟乐灵(Trifluralin )以及咖啡碱等。目前在兰花育种中，人工诱导2n雄配子的研究报道较少，范彬等(2012)利用秋水仙素诱导春剑2n雄配子，其最高诱导率为2.65%、P WongprichAC (活性炭)han et al (2013)利用N20成功诱导蝴蝶兰2n雄配子。无论是物理方法或是化学方法诱导2n雄配子，均存在2n雄配子竞争力下降，诱导率偏低和效率不稳定等问题，这导致2n雄配子无法有效的运用于育种实践。
[0005]因此，创建自然高效发生2n雄配子的兰花资源成为开展兰花多倍体育种的关键。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中物理方法和化学方法诱导2n雄配子，均存在2n雄配子竞争力下降，诱导率偏低和效率不稳定的缺陷，提供一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法。本发明与传统物理、化学方法相比，2n雄配子发生稳定、活力高、可长期重复使 用。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法，其特征在于，包括如下步骤:51.远缘杂交组合配置:选择适宜亲本，配置杂交组合，在适宜的条件下栽培母本植株，获得果实；52.杂种群体构建:对果实进行消毒，取其种子进行无菌培养获得中间繁殖体，对中间繁殖体进行植株再生，获得试管苗，试管苗移栽后，栽培至植株开花；
53.2n雄配子的鉴定:待植株开花后，取不同株系植株新鲜成熟花粉，采用直接压片法制片后，在光学显微镜下观察2n花粉，统计2n花粉的发生频率；
54.高效发生2n雄配子资源筛选:对发生率大于1%的植株进行分株繁殖，并进行两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的株系为兰花高效发生2n雄配子资源。
[0008]根据本发明的方法，其中，步骤S1所述远缘杂交组合配制技术包括以下步骤:
亲本的选配原则:远缘杂交常存在杂交不亲和性的问题，亲本的亲缘关系不能太远，应该注意选配亲和性相对较高的品种，亲本的花粉活力要高；其次避免选择第一次开花的兰株做亲本；最后选择种子易于萌发的品种做亲本，以保证可以获得杂种后代。
[0009]杂交技术:选择健壮无病的植株作父母本，用镊子取出母本当天开花花朵中的花粉块，然后将父本的花粉块放入母本的蕊腔中，用铅笔在纸牌上写明杂交组合的名称，杂交时间，挂在母本植株上，并将其置于温暖通风的地方，防止寒潮。
[0010]步骤S2所述杂种群体构建技术包括以下步骤:
S21.果荚的消毒与种子萌发:将刚采收的果实用自来水冲洗2~3 min，晾干后在超净工作台上用75%的酒精浸泡30s，转入0.1%的升汞中消毒15min，无菌水冲洗3~5次后备用。用解剖刀切去果荚两端约0.5 cm，然后将果实纵向切开，将种子均匀撒播于适宜的种子萌发培养基上，并在适宜的温度条件进行暗培养。
[0011]S22中间繁殖体的增殖与植株再生:将萌发形成的中间繁殖体切块，接种到适宜的增殖培养基进行繁殖，经继代培养后转接到适宜的分化培养基中进行分化。分化出的芽和苗转入适宜的生根壮苗培养基中，进行生根壮苗。
[0012]S23.试管苗移栽:当小苗长至5~8 cm并具有2条以上根时即可进行炼苗。炼苗时，将培养瓶盖子旋松，放在温室下10~20 d或在室外无直射光的地方放置3~5 d后，取出试管苗移栽。
[0013]步骤S21所述种子萌发培养基为1/2 MS培养基+ 0.2~0.5 mg/L 6BA + 0.2~0.5 m g/L NAA +30 g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 +100ml/L Cff (椰子汁)+ 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0014]S22 所述增殖培养基为 1/2 MS+ 0.5 ~1.0 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0015]S22 所述分化培养基为 1/2MS+ 1.5 ~2.0 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA+30g/L鹿糖+7.5g/L卡拉粉。
[0016]S22 所述生根壮苗培养基为 1/2MS+ (λ 1 ~0.2 mg/L 6BA +0.5 ~L 0 mg/L NAA+20g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0017]根据本发明的方法，其中，步骤S3所述2n雄配子的鉴定技术包括以下步骤:
S31制片:取出新鲜花粉块，放在干净的载玻片上，为防止花粉干燥，滴入少量无菌水，
用镊子使花粉均匀分散在载玻片上。
[0018]S32.染色:待载玻片上材料水分晚干后，在材料上方均勾抹上一层改良石炭fe品红染液，快速经过火焰2~3次。染色时间大约3-5分钟。
[0019]S33.压片:用带橡皮的铅笔垂直轻敲盖玻片，赶出气泡。
[0020]S34.观察:用01ympus-1X71倒置显微镜观察2η花粉发生频率，在40 X物镜下，移动载玻片，随机选择10个视野进行拍照，最后统计这10个视野中的二分体和三分体发生的频率。观察时，以100个小孢子母细胞为1次重复，重复3次。
[0021]S35.统计:2η雄配子发生的频率按照如下公式统计:
2η 雄配子的频率(％)= (2D+Tr) / (2D+3Tr +4Te) X 100 ；其中D代表二分体；Tr代表三分体；Te代~表四分体。
[0022]根据本发明的方法，其中，步骤S4所述分株繁殖技术包括以下步骤:分株繁殖技术:兰花分株繁殖在休眠期进行，最好在新芽已经形成但尚未出土前。兰花株属于丛生型，不同品种分株方法稍有差别，分株时用一只手按住植株茎部的盆土，另一只手将盆翻倒出来，轻轻摇动基质和盆壁分离，然后将兰丛取出，轻轻将基质破碎，使之和兰根分离，然后从间隙较大处，用已经消毒的利刀将兰丛按2~3株一蔸切开洗净，去掉老根、烂根、枯叶，放置1天左右，待兰根返白时即可以上盆。兰花分株后根系活力相对较弱，应注意保温、保湿管理，以提高植株成活力。
[0023]本发明的有益效果是:本发明通过远缘杂交的方法，可获得稳定高效发生2n雄配子的兰花资源，较物理或是化学的方法，2n雄配子发生稳定，可长期重复使用，形成的2n雄配子活力高。这对促进兰花多倍体育种和产业的发展，提高我国兰花产业的核心竞争力具有十分重要的意义。
[0024]说明书附图
图1.墨兰2n雄配子的鉴定结果；其中a~d后期II a.一分体；b.二分体；c.三分体；
d.正常四分体；e~h成熟花粉时期e.—分体f.二分体；g.三分体；h.正常四分体花粉。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0026]实施例1金嘴X兔耳兰杂种高效2n雄配子资源的创建
S1.远缘杂交组合配置:金嘴墨兰花期，选择健壮无病的植株作母本，取兔耳兰花粉块为其授粉，用铅笔在塑料纸牌上标明杂交组合名称、杂交时间，挂在母本植株上。在适宜的条件下栽培母本植株，获得果实。
[0027]S2.杂种群体构建
S21.果荚的消毒与种子萌发:将刚采收的果实用解剖刀去掉果柄，蘸取适量洗洁精清洗后用自来水冲洗2~3 min,晾干后在超净工作台上用75%的酒精浸泡30s，转入0.1%的升汞中消毒15min，无菌水冲洗5~8次后备用。用解剖刀切去果荚两端约0.5 cm，然后将果实纵向切开，将种子均匀撒播于1/2 MS培养基+ 0.2~0.5 mg/L 6BA + 0.2~0.5 mg/L NAA +30 g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉+100ml/L Cff (椰子汁)+ 0.5 g/L AC (活性炭))培养基中，并与26 ± 1 °C黑暗环境下进行培养。
[0028]S22.中间繁殖体的增殖与植株再生:将萌发形成的中间繁殖体切块接种到1/2MS+ 0.5 ~1.0 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA +30g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L AC (活性炭)的增殖培养基上进行增殖，经多代培养后再接种到1/2MS+ 1.5~2.0 mg/L6BA + 0.2~0.5 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L卡拉粉的分化培养基中进行分化，分化出的芽和苗转入如下生根壮苗培养基中:1/2MS+ 0.1~0.2 mg/L 6BA +0.5~1.0 mg/L NAA+20g/L 蔗糖 +7.5g/L + 0.5 g/L AC (活性炭)。
[0029]以上实验均在温度26±1°C，光照强度17Mfflol.m-2 -s^1每天12h光照下进行培养。
[0030]S23.试管苗移栽:当小苗长至5~8 cm并具有2条以上根时即可进行炼苗。炼苗时，将培养瓶盖子旋松，放在温室下10~20 d或在室外无直射光的地方放置3~5 d后，取出试管苗移栽。
[0031]S3.2n雄配子的鉴定技术包括制片、染色、压片、观察和统计:
S31.制片:取出新鲜花粉块，放在干净的载玻片上，为防止花粉干燥，滴入少量无菌水，用镊子使花粉均匀分散在载玻片上。
[0032]S32.染色:待载玻片上材料水分晚干后，在材料上方均勾抹上一层改良石炭fe品红染液，快速经过火焰2~3次。染色时间大约3~5分钟。
[0033]S33.压片:用带橡皮的铅笔垂直轻敲盖玻片，赶出气泡。
[0034]S34.观察:用01ympus-1X71倒置显微镜观察2n花粉发生频率，在40 X物镜下，移动载玻片，随机选择10个视野进行拍照，最后统计这10个视野中的二分体和三分体发生的频率。观察时，以100个小孢子母细胞为1次重复，重复3次。观察结果见图1。
[0035] S35.统计:2η雄配子发生的频率按照如下公式统计:
2η 雄配子的频率(％)= (2D+Tr) / (2D+3Tr +4Te) X 100 ；
其中D代表二分体；Tr代表三分体；Te代表四分体。
[0036]S4.高效发生2n雄配子资源筛选:对发生率大于1%的植株进行分株繁殖，并进行两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的株系为兰花高效发生2n雄配子资源。所述分株繁殖技术包括如下步骤:兰花分株繁殖在休眠期进行，最好在新芽已经形成但尚未出土前。兰花株属于丛生型，不同品种分株方法稍有差别，分株时用一只手按住植株茎部的盆土，另一只手将盆翻倒出来，轻轻摇动基质和盆壁分离，然后将兰丛取出，轻轻将基质破碎，使之和兰根分离，然后从间隙较大处，用已经消毒的利刀将兰丛按2~3株一蔸切开洗净，去掉老根、烂根、枯叶，放置1天左右，待兰根返白时即可以上盆。兰花分株后根系活力相对较弱，应注意保温、保湿管理，以提高植株成活力。
[0037]结果与分析:
通过压片法观察了金嘴，兔耳兰及其杂种株系2n雄配子的发生(见表1和表2)。结果表明，金嘴和兔耳兰2n雄配子发生频率分别为0.45%和0.56%，而在其杂种后代中有3份株系的2n雄配子发生频率大于2%，8份株系的发生频率介于1~2%之间。将2n雄配子的发生频率大于1%的株系筛选出来，在不同的年份中进行重复验证(表3)。结果表明，多数高频率发生2n雄配子株系，在不同年份的2n雄配子发生频率虽有波动，但变化幅度小，且在1%以上，明显高于双亲的2n雄配子发生频率。这证明利用远缘杂交创建高效发生2n雄配子资源是可行的。
[0038]表1 2012年金嘴X兔耳兰杂种2n雄配子的发生
【权利要求】
1.一种创建兰花高效发生2η雄配子资源的方法，其特征在于，包括如下步骤:51.远缘杂交组合配置:选择适宜亲本，配置杂交组合，在适宜的条件下栽培母本植株，获得果实；52.杂种群体构建:对果实进行消毒，取其种子进行无菌培养获得中间繁殖体，对中间繁殖体进行植株再生，获得试管苗，试管苗移栽后，栽培至植株开花；53.2η雄配子的鉴定:待植株开花后，取不同株系植株新鲜成熟花粉，采用直接压片法制片后，在光学显微镜下观察2η花粉，统计2η花粉的发生频率；54.高效发生2η雄配子资源筛选:对发生率大于1%的植株进行分株繁殖，并进行两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的株系为兰花高效发生2η雄配子资源。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1所述适宜亲本的选配原则为首先选配亲和性相对较高的品种，亲本的花粉活力要高；其次避免选择第一次开花的兰株做亲本；最后选择种子易于萌发的品种做亲本，以保证可以获得杂种后代。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S1所述杂交组合的杂交方法为:用镊子取出母本当天开花花朵中的花粉块，将父本的花粉块放入母本的蕊腔中，用铅笔在纸牌上写明杂交组合的名称，杂交时间，挂在母本植株上，并将其置于温暖通风的地方，防止寒潮。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2所述杂种群体构建包括如下步骤:541.果荚的消毒与种子萌发:将刚采收的果实经消毒处理后，用解剖刀切去果荚两端0.5 cm，然后将果实纵向切开取出种子，将种子均匀撒播于种子萌发培养基上，在适宜的温度条件进行暗培养获得中间繁殖体；542.中间繁殖体的增殖与植株再生:`将种子萌发形成的中间繁殖体切块，接种到增殖培养基进行繁殖，经继代培养后转接到分化培养基中进行分化，分化出的芽和苗转入生根壮苗培养基中，进行生根壮苗；`543.试管苗移栽:当小苗长至5~8cm并具有2条以上根时即可进行炼苗；炼苗时，将培养瓶盖子旋松，放在温室下10~20 d或在室外无直射光的地方放置3~5 d后，取出试管苗移栽。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，S41所述消毒处理为将刚采收的果实用自来水冲洗2~3 min,晾干后用75%的酒精浸泡30s，然后将果实转入0.1%的升汞中消毒15min,无菌水冲洗3~5次后备用。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，S41所述种子萌发培养基为1/2MS培养基+ 0.2 ~0.5 mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 m g/L NAA +30 g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 +100ml/L椰子汁+ 0.5 g/L活性炭。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，S42所述增殖培养基为1/2MS+ 0.5~1.0mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA +30g/L 鹿糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L 活性炭。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，S42所述分化培养基为1/2MS+1.5~2.0mg/L 6BA + 0.2 ~0.5 mg/L NAA +30g/L 鹿糖 +7.5g/L 卡拉粉。
9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，S42所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.1~`0.2 mg/L 6BA +0.5 ~1.0 mg/L NAA +20g/L 蔗糖 +7.5g/L 卡拉粉 + 0.5 g/L 活性炭。
【文档编号】A01H1/02GK103704126SQ201310668763
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】张志胜, 朱娇, 曾瑞珍, 谢利, 周玉亮, 郭和蓉 申请人:华南农业大学