一种高叶绿素多蘖大麦的复合选育方法
【专利摘要】本发明提供高叶绿素含量和/或多茎蘖数大麦的复合选育方法、制备麦绿素产品的方法和提高大麦叶绿素含量和/或茎蘖数。本发明的方法包括取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10℃处理10-30天；收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和培养所述纯合加倍单倍体；从而筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，已将所述大麦制备成所需的麦绿素产品。本发明通过杂交技术将多个优异性状聚合，利用小孢子培养技术对目标性状进行快速纯合稳定，在人工可控环境下进行多指标筛选，最终获得高叶绿素含量多茎蘖的大麦种质材料。该材料通过田间种植或水培方式可作为麦绿素等营养保健产品生产的优良种质材料。
【专利说明】一种高叶绿素多蘖大麦的复合选育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业【技术领域】，具体涉及一种高叶绿素含量和多茎蘖大麦材料的筛选培育方法。【背景技术】
[0002]麦类作物的幼苗是一种传统中草药，我国早在《本草纲目》和《伤寒纪要》中的记载了麦苗的药用价值。1969年，日本学者荻原义秀博士发表了《禾本科植物绿叶成分及作为稳定的药品、食品研究》一文，并致力于商品化开发。1991年，他利用“超低温快速喷雾干燥法”的技术，将大麦嫩苗榨汁浓缩成粉末，称为“麦绿素”(Barely Green)，并向国际市场推广。目前市场上的麦绿素产品是以大麦或小麦等麦类作物分蘖盛期的嫩叶(麦高20-30cm)为主要原料，辅以糊精等配料加工而成的。麦绿素富含蛋白质、叶绿素、大量的活性酶(如SOD酶、过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶等)、0_胡萝卜素、多种维生素，以及多种微量元素(郭建华，2008)。
[0003]现代生物试验和临床研究证实，麦绿素具有以下9个方面生理功能:(1)促进损伤DNA的恢复作用；(2)消炎镇痛；(3)增强免疫力及防癌、抗癌、抗辐射作用；(4)抑制艾滋病病毒作用；(5)降血压；(6)抗溃疡；(7)清除体内多余自由基，抗衰老及防治心脑血管疾病；(8)防治糖尿病；(9)加速伤口愈合，促进造血，消除口臭(乔文静，2009)。美国FDA已批准大麦嫩叶汁作为食品增补剂。在日本，大麦嫩叶汁制品已获得日本健康协会认定的健康食品的标志(牛广财，2011)。目前国外已研制开发出麦叶系列产品，如小麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品等等，日本还推出了在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品。
[0004]麦绿素产品具有良好的营养保健功能，有着广阔的市场前景，麦绿素的主要生产基地在美国、加拿大、澳洲等，由于它的纯天然性和保健作用，迎合了人们“回归自然”的追求，因而风靡北美、欧洲、澳大利亚、东南亚，每年销售额已达23~27亿美元(黄相国，2003)。大麦功能产品的生产将会增加大麦种植产业的附加值，使农民增收，据报道，每亩可生产鲜叶500kg，产值可达1000元以上，农民收入比种植常规大麦和其它冬季作物高出一倍以上(武红霞，2002)。
[0005]但目前生产麦绿素的专用大麦品种缺乏，严重限制了麦绿素产品的开发与利用。目前功能大麦的选育在我国还未引起足够重视，传统的育种目标并不能满足功能大麦选育的要求。传统的育种目标主要是考虑品种的农艺性状如籽粒产量与品质、抗病性等，而以生产麦绿素专用的大麦品种原料取自营养生长期，因此，需要重新考虑其选育目标。对麦绿素专用大麦品种选育，要求苗期生长快，拔节时茎叶产量高，叶绿素等营养含量高。
[0006]叶片是植物进行光合作用的重要器官，而叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其作用就是进行光能捕获，其含量的高低不仅会影响叶色，而且会直接影响光合作用的效率，有研究表明在一定范围内叶绿素的含量是与光合效率成正相关的。绿色植物都是依靠光合作用进行生物合成，完成其形态建成和生物量积累。绿色植物的叶绿素生物合成是一个由一系列酶参与合成的复杂过程，其中参与合成的酶和基因在高等植物中已比较清楚，但控制叶绿素含量的遗传模式还不清楚。目前对叶绿素含量的筛选都是集中在大田筛选，采用叶绿素仪或叶绿素荧光仪进行实地测定。这种筛选方式存在一些问题，已有研究表明叶绿素的含量受到环境因素的影响明显，不同生长周期的含量也会变化，大田环境复杂，种植条件受到各种因素影响和制约，叶绿素含量表现并不一致，另外叶绿素很大程度上受到隐性基因控制，筛选需要在高代进行，这将需要更长的时间获得纯合后代。
[0007]除了筛选高叶绿素含量，其地上部生物产量也是一个重要指标。分蘖茎叶是苗期地上部分的生物产量构成部分，要提高其生物产量，需要选择分蘖多、茎叶生长旺盛的材料。大麦育种的筛选大多集中在生长成熟期，对苗期的地上部生物产量和叶绿素含量的筛选还未见报道。
[0008]本发明将提供一种克服目前大田筛选的一些问题，实施有效、快速选育高叶绿素含量多茎蘖的大麦的方法，包括:通过杂交技术将多个优异性状聚合，利用小孢子培养技术对目标性状进行快速纯合稳定，在人工可控环境下进行多指标筛选，最终获得高叶绿素含量多茎蘖的大麦种质材料。该材料通过田间种植或水培方式可作为麦绿素等营养保健产品生产的优良种质材料。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于高效、快速提供高叶绿素含量、多茎蘖数的大麦，且所述大麦的所述性状能稳定遗传。本发明通过以下方法实现该目的，所述方法具有具有稳定性和可重复性。
[0010]本发明一方面提供高叶绿素含量和/或多茎蘖数的大麦的方法包括:
[0011](I)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理2-3周；
[0012](2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；
[0013](3)水培所述纯合加倍单倍体；
[0014]和筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦。
[0015]本发明另一方面提供一种制备麦绿素产品的方法，所述方法包括:
[0016](I)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理2-3周；
[0017](2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和
[0018](3)水培所述纯合加倍单倍体，筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦；和
[0019](4)将所述大麦制备成麦绿素产品。
[0020]本发明再一方面提供一种提高大麦叶绿素含量和/或茎蘖数的方法，所述方法包括:
[0021](I)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10°C处理10-30天；
[0022](2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；
[0023](3)水培所述纯合加倍单倍体，获得再生植株；
[0024]其中，所述再生植株为叶绿素含量提高和/或茎蘖数增多的植株。
[0025]应理解，所述“叶绿素含量提高”与“茎蘖数增多”是相对于起始大麦材料而言，即相对于步骤(1)的所述大麦小孢子未经本发明方法处理而获得的大麦的叶绿素含量和茎蘖数而言。[0026]在一个具体实施例中，本发明上述方法在步骤(1)之前还包括:
[0027](a)选取一批叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖较多的大麦材料，水培后测定2叶I心期的叶绿素含量，至分蘖期后开始统计分蘖数、植株高度和/或茎基部周长，根据这些统计指标筛选出叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种；和
[0028](b)培养所述品种，获得步骤(1)所述的小孢子；和
[0029](C)如果大麦材料只具有叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速中的一个目标性状，则在花粉成熟后进行相互授粉杂交，获得杂交代种子，繁育该代种子，获得Fl代植株，从该Fl代植株获得步骤(1)所述的小孢子。
[0030]在一个具体实施例中，本发明上述方法中，小孢子获自叶绿素含量高和茎蘖数多的大麦。
[0031]在一个具体实施例中，本发明上述方法中，所述步骤(2)包括:
[0032](2a)消毒所述穗子，然后清洗；
[0033](2b)从所述穗子分离小孢子；
[0034](2c)于室温、黑暗处理小孢子36-60小时；
[0035](2d)用诱导培养基悬浮小孢子，并将悬浮液接种于诱导培养基中，诱导愈伤；和
[0036](2e)将诱导所得愈伤组织转入分化培养基，培养获得再生苗，即所述纯合加倍单倍体。
[0037]在一个具体实施例中，本发明上述方法中，分离小孢子时，在试管中加入穗子和含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2_(N_吗啡啉)乙磺酸的提取液，用高速分散器超速旋切，过滤，离心滤液，从而获得小孢子。
[0038]在一个具体实施例中，本发明上述方法中，诱导培养基以N6培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麦芽糖70-120g/L ;分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KT
1.0-2.0mg/L、萘乙酸 0.03-0.08mg/L 和麦芽糖 15_50g/L，用 3_8g/L 琼脂粉固化。
[0039]在一个具体实施例中，本发明上述方法中，步骤(3 )之后还包括:
[0040]将小孢子培养获得的再生植株放入大麦标准营养液中培养，进行再次筛选，选出叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，并收集其种子。
[0041]在一个具体实施例中，所述再次筛选是在人工可控环境下采用水培方式进行筛选。
[0042]在一个具体实施例中，所述人工可控环境包括:在人工气候室内采用日光灯管照明，光照强度约1500-25001x，优选约1800-20001x ;保持室温白天约18-22°C，优选约20°C，晚上约16-20°C，优选18°C，白天、夜晚的温度波动约1_2°C。
[0043]在一个具体实施例中，所述麦绿素产品选自:大麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品，以及在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品。
[0044]在一个具体实施例中，本发明上述方法中，所获得的小孢子用预处理液于室温、黑暗预处理36-60小时，其中，所述预处理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸。
[0045]优选地，本发明获得的大麦植株叶绿素含量和茎蘖数都提高。[0046]本发明提供方法具有以下特征:
[0047]1.麦绿素产品原料取材一般是在6-7叶期，因此6-8周的水培即可完成培养过程，达到预定生长时期，期间可方便进行测定与取材。根据本文所述统计指标分别筛选出性状优异的品种。本发明采用的是人工可控的统一培养条件，在人工气候室完成，不受季节控制，筛选具有稳定性和可重复性。2叶1心期的是非常敏感的筛选时期，品种间的差异比较明显，不明显的品种在后期的连续测定中也可以进行比较。同时选择分蘖数目作为一个评价地上部生物量的指标。
[0048]2.筛选目标围绕大麦苗期叶绿素含量和地上部分生物产量两个目标进行，不考察材料后生育期籽粒产量等性状。
[0049]3.对初步筛选的含有较好目标性状大麦材料，采用小孢子培养技术获得纯合加倍单倍体(DH)株系，种质所有性状完全纯合，隐性性状可以当代表现。
[0050]4.对单一优异目标性状的大麦材料采用杂交技术聚合目标性状。
[0051]5.根据目标性状选用不同指标进行大量筛选，筛选涉及初选材料、纯合DH植株、杂交聚合性状分离后代。
[0052]6.现有的大田筛选技术通常耗时2-3年，甚至更长时间，才有可能筛选得到具有上述目标性状的可用来制备麦绿素产品的大麦材料，但筛选缺乏稳定性和可重复性。本发明由于对小孢子的特殊处理而可大大缩短该筛选时间，通常在一年内即可实现。
【具体实施方式】
[0053]本发明上述的方法包括:
[0054](I)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理10-30天；
[0055](2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和
[0056](3)水培所述纯合加倍单倍体。
[0057]所述“低温”通常指2-10°C，例如3_5°C。低温处理指在低温下放置新鲜采摘的所述小穗。低温处理的时间通常是10-30天，例如可以是14-21天不等。
[0058]小孢子通常取自叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的亲本材料种子种植得到的大麦。
[0059]本文中，“叶绿素含量高”指就所筛选的批次而言，叶绿素含量相对较高的植株，例如，指在所筛选批次中叶绿素含量排在前20%的株系，优选前10%，更优选前5%。当然可选自叶绿素含量最闻或相对最闻的几株。
[0060]本文中，“分蘖数多”指就所筛选的批次而言，分蘖数多相对较多的植株，例如，指在所筛选批次中分蘖数排在前20 %的株系，优选前10 %，更优选前5 %。
[0061]本文中，“生长迅速”就所筛选的批次而言，生长速度相对较快的植株，例如，指在所筛选批次中生长速度排在前20 %的株系，优选前10 %，更优选前5 %。
[0062]通常，可首先根据目标性状，选取一批叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖较多的大麦材料，水培后测定2叶I心期的叶绿素含量，至分蘖期后开始统计分蘖数、植株高度和/或茎基部周长，根据这些统计指标分别筛选出性状优异的品种，例如筛选出叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种。
[0063]可采用已报道的标准大麦水培营养液(改良Hoagland溶液)进行水培，该营养源配方如下:
[0064]NH4NO3 (0.2mM)、KNO3 (5mM)、Ca NO3.2 (2mM)、MgSO4 (2mM)、KH2PO4 (0.1mM)、Na2Si03(0.5mM)、NaFe (III) - EDTA (0.05mM)、H3BO3 (0.01mM)、MnCl2 (0.005mM)、ZnSO4 (0.005mM)、CuSO4 (0.0005mM)、Na2MoO3 (0.000 ImM)，使用前溶液 pH 值用稀盐酸调节至6.0左右。
[0065]水培可在人工气候室内进行。采用日光灯管照明，光照强度约20001x，保持室温白天20度，晚上18度，温度波动1-2度。
[0066]然后，种植该品种的种子(即亲本材料种子)，用于小孢子培养取材。可在大田中种植，或者，若植株筛选材料不多，也可在筛选后在人工气候室种植。
[0067]对于只有其中一个目标性状优异的材料，在花粉成熟后可进行相互授粉杂交(正反杂交)，获得杂交代种子。大田或人工气候室种植代种子，获得Fl代植株，用于小孢子培养取材。
[0068]可从大田或人工气候室中种植的叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种中选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的小穗进行低温处理10-30天，如前文所述。
[0069]低温处理后，可采用本领域已知的技术获取小孢子。包括消毒、高速离心等。
[0070]本文中，消毒通常用75%酒精浸泡20-60秒,饱和的漂白粉溶液消毒10_20分钟。通常用75%酒精浸泡30秒，饱和的漂白粉溶液消毒15分钟。本领域技术人员周知其它消毒手段。
[0071]消毒后，可用无菌水冲洗数次，例如3-4次。然后，每个试管接5-15个穗子，例如每管10个穗子。倒入10-20ml、优选15ml提取液，用高速分散器超速旋切，过滤(例如，用150目筛网过滤)，离心滤液(例如，以100父8离心5111111，重复3次)，收集小孢子。提取液优选含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的MES (2_(N_吗啡啉)乙磺酸)。在一个具体实施例中，提取液优选6%甘露醇、1.lg/L的CaCl2和0.976g/L的MES。
[0072]可任选地用预处理液于室温(例如25°C)、黑暗预处理36-60小时，通常处理2天。预处理液的组成同提取液。
[0073]然后，可任选地用21% (质量体积百分比)麦芽糖纯化小孢子，再用诱导培养基洗涤I次，然后用诱导培养基将小孢子密度调节至0.5-2.0X 105/ml，优选1.0X 105/ml，取大约Iml小孢子悬浮液接种于培养皿(例如，35X 15mm的培养皿中)，封口后室温(25°C )暗培养，诱导愈伤；然后转入分化培养基获得再生苗。此处获得植株为单细胞培养获得的纯合加倍单倍体(DH)。检测出的单倍体可以用秋水仙碱处理直接加倍变成加倍单倍体。
[0074]诱导培养基以N6培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤(KT) 0.3-0.8mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L、和麦芽糖70_120g/L。在一个【具体实施方式】中，诱导培养基添加有KT 0.4-0.6mg/L和2，4-D0.8-1.2mg/L,和麦芽糖80_100g/L。在一个【具体实施方式】中，诱导培养基添加有KT 0.5mg/L和2，4-D 1.0mg/L，和麦芽糖90g/L。
[0075]常规的N6培养基的成分基本如下表1所示，不同厂商或文献所记载的不同成分的浓度或许有些许差别，但其功能都大致相同:
[0076]表1:N6培养基的配方(单位:mg/L):
[0077]
【权利要求】
1.一种生产高叶绿素含量和/或多茎蘖数的大麦的方法，所述方法包括: (1)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10°C处理10-30天； (2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体； (3)水培所述纯合加倍单倍体；和 (4)筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦。
2.一种制备麦绿素产品的方法，所述方法包括: (1)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理2-3周； (2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和 (3)水培所述纯合加倍单倍体，筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦；和 (4)将所述大麦制备成麦绿素产品。
3.一种提高大麦叶绿素含量和/或茎蘖数的方法，所述方法包括: (1)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10°C处理10-30天； (2)收获小孢子，培养小 孢子，再生获得纯合加倍单倍体； (3)水培所述纯合加倍单倍体，获得再生植株； 其中，所述再生植株为叶绿素含量提高和/或茎蘖数增多的植株。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(1)之前还包括: (a)选取一批叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖较多的大麦材料，水培后测定2叶I心期的叶绿素含量，至分蘖期后开始统计分蘖数、植株高度和/或茎基部周长，根据这些统计指标筛选出叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种；和 (b)培养所述品种，获得步骤(1)所述的小孢子；和 (c)如果大麦材料只具有叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速中的一个目标性状，则在花粉成熟后进行相互授粉杂交，获得杂交代种子，繁育该代种子，获得Fl代植株，从该Fl代植株获得步骤(1)所述的小孢子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括: (2a)消毒所述穗子，然后清洗； (2b)从所述穗子分离小孢子； (2c)于室温、黑暗处理小孢子36-60小时； (2d)用诱导培养基悬浮小孢子，并将悬浮液接种于诱导培养基中，诱导愈伤；和 (2e)将诱导所得愈伤组织转入分化培养基，培养获得再生苗，即所述纯合加倍单倍体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2b)中，分离小孢子时，在试管中加入穗子和提取液，用高速分散器超速旋切，过滤，离心滤液，从而获得小孢子，其中，所述提取液含有含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和0.8-1.2g/L的2_(N_吗啡啉)乙磺酸。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于， 诱导培养基以N6培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麦芽糖70-120g/L ； 分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KTl.0-2.0mg/L、萘乙酸 0.03-0.08mg/L 和麦芽糖 15_50g/L，用 3_8g/L 琼脂粉固化。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后还包括:将小孢子培养获得的再生植株放入大麦标准营养液中培养，进行再次筛选，选出叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，并收集其种子。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述麦绿素产品选自:大麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品，以及在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所获得的小孢子用预处理液于室温、黑暗预处理36-60小时，其中，所述预处理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl2和.0.8-1.2g/L的2 -(N-吗啡啉)乙磺酸。
【文档编号】A01H4/00GK103636505SQ201310713460
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】刘成洪, 黄剑华, 王亦菲, 陈志伟, 陆瑞菊, 杜志钊, 何婷, 高润红, 徐红卫, 郭桂梅 申请人:上海市农业科学院