用于减少反刍动物甲烷生成的饲料组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于减少反刍动物中甲烷产生的方法，所述方法包括对所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物。
【专利说明】用于减少反刍动物甲烷生成的饲料组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及用于减少反刍动物甲烷生成的新组合物。
[0002] 发明背景
[0003] 甲烷、二氧化碳和氧化亚氮是具有温室效应的主要气体。
[0004] 甲烷（CH4)是温室气体，其大气浓度在最近的世纪内显著地增加，并且是二氧化 碳之后地球变暖的最大潜在贡献者。对流层效应甲烷水平的增加与人口的全球扩张紧密相 关。因此，认为约70%的甲烷发出与人类活动相关。废物的陆地填充和农业实践生成甲烷 并且将其释放在大气中，其量因世界人口数量的增长而增加。
[0005] 反刍动物（包括牛（cattle)、水牛（buffalo)、绵羊和山羊）具有大前胃，其中发 生产生甲烷的发酵。瘤胃消化道由4个胃的隔室构成：瘤胃、网胃、皱胃和重瓣胃。它们中 最大且最重要的是瘤胃。瘤胃作为发酵隔室起作用。它包含庞大的微生物群体，包括产生 甲烷的古细菌，它们分解植物材料。所述微生物通常称作产甲烷菌。古细菌群体利用氢和 二氧化碳，即厌氧微生物发酵产物，生成用于生长的能量，从而产生作为终产物的甲烷。最 终，甲烷通过打嗝从瘤胃中放出。
[0006] 牛和绵羊产生甲烷代表了降低生产力的碳损耗途径。如果通过甲烷合成损耗的能 量可以通过其它生化途径被改道而通常至丙酸合成，则瘤胃发酵可以变得更为有效且可以 在动物体重增长或产奶改善方面反映出来。它对生产者而言是成本有效的且提供减少甲烷 放出至大气中的有效工具。实际上，因为甲烷在大气中的寿命是12年（而二氧化碳和氧化 亚氮的寿命分别是100年和120年），所以减少甲烷放出可以对环境具有越来越快速的影 响。
[0007] 过去使用反刍动物的研究已经证实甲烷产生受膳食影响。通过增加结构/非结构 (纤维质/淀粉）性碳水化合物之比，甲烷放出增加。此外，将脂质源添加到膳食中减少了 肠甲烷放出。尽管与甲烷减少平行，但是高脂肪补充比例减少了瘤胃微生物发酵、饲料摄入 和纤维可消化性。大量化学饲料添加剂例如抗生素（即离子载体）或杀虫剂被导入反刍动 物营养物以促进生长，改善饲料利用率和减少甲烷产生。然而，对于动物产品中存在化学残 留物和细菌对抗生素的耐药性的发生的担忧已经刺激了寻找更为安全的天然替代品，它们 可以用于有机的畜牧场。
[0008] 已经证实包含精油、单宁类、皂苷类、类黄酮和许多其它植物次级代谢产物的植物 或植物提取物改善瘤胃代谢祀向特异性类型的瘤胃微生物群体。Patraa A.K.和Saxenab J(2010)、Phytochemistry，71 (11-12) : 1198-222描述了植物次级代谢产物在抑制瘤胃中甲 烷生成中的应用。对比文件W02005000035涉及增强瘤胃发酵、特别是减少甲烷生成的方 法，由施用从新鲜紫花苜蓿中得到的可溶性紫花苜蓿提取物组成。
[0009] 因此，对于包含天然来源的化合物且有效地减少甲烷产生和安全地用于畜牧场的 可替代反刍动物饲料组合物存在需求。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的作者目前已经发现，通过给反刍动物施用包含天然化合物的饲料组合 物，显著地减少了甲烷放出。
[0012] 因此，在一个方面中，本发明涉及减少反刍动物中甲烷产生的方法，所述方法包括 通过口服给所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物，所述黄烷酮糖苷选自新橙皮 苷、异柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合物。
[0013] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合 物。在一个更具体的实施方案中，所述混合物还包含柚皮苷。在一个优选的实施方案中，所 述混合物是天然植物提取物。在一个更优选的实施方案中，所述植物是柑橘属植物提取物。
[0014] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物还包含载体。在一个优选的实施 方案中，所述载体是海泡石。
[0015] 在一个具体的实施方案中，所述组合物是混合物，其包含25 - 55% wt.的柚皮苷、 10% - 20% wt.的新橙皮苷、1 % - 5% wt.的枸橘苷和足量至100% wt.的载体。在一个 优选的实施方案中，所述组合物包含40 - 50% wt.的柚皮苷、11 一 15% wt.的新橙皮苷、 3 - 5%的枸橘苷和足量至100% wt.的载体。
[0016] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述反刍动物是小牛（calf)、母牛（cow)、水 牛、绵羊、鹿或山羊。在一个优选的实施方案中，所述反刍动物是小牛。
[0017] 在一个具体的实施方案中，将本发明的组合物以50 - lOOOmg/Kg DM浓度的固体 形式加入到饲料中。在一个优选的实施方案中，以200 - 500mg/Kg DM的浓度加入所述组 合物。
[0018] 附图简述
[0019] 图1表示生物气和甲烷产生的分布图。平均值使用应用未补充定量（对照品）或 补充不同类型的类黄酮得到的"体外"模拟系统中的剂量。
[0020] 发明详述
[0021] 如上所述，本发明的作者已经发现，通过给反刍动物施用包含类黄酮、特别是黄烷 酮糖苷类的饲料组合物，显著地减少了甲烷放出。
[0022] 因此，在一个方面中，本发明涉及用于减少反刍动物中甲烷产生的方法，所述方法 包括通过口服给所述反刍动物施用包含黄烷酮糖苷的饲料组合物，所述黄烷酮糖苷选自新 橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合物。
[0023] 本文所用的术语"反刍动物"是指任意反刍亚目（Ruminantia)的偶蹄哺乳动物。 所述哺乳动物咀嚼反刍食物并且具有4个隔室的胃，其中之一是瘤胃。该类型包括鹿、羚 羊、水牛、牛、绵羊、胳马它和山羊。
[0024] 本文所用的术语"类黄酮"是指一类在花瓣上产生黄色或红色/蓝色色素沉着的 水溶性植物色素。术语"黄烷酮类"是指一种类型的类黄酮。黄烷酮类一般地被7位上的 二糖糖基化，得到"黄烷酮糖苷类"。
[0025] 正如下列实施例中所示，发明人已经令人意外地发现，通过给反刍动物施用本发 明的饲料组合物显著地减少了甲烷放出。
[0026] 可以使用本领域众所周知的方法测定反刍动物的甲烷产量。例如，六氟化硫（SF6) 示踪法是一种技术，其能够使用围绕在母牛颈部的连续对呼气采样的抽成真空的金属气体 采样罐测定来自母牛个体的甲烷。其它方法包括开路呼吸室，它们是密封的，和气候控制 室，其中居留单个母牛，从而允许分析该动物产生的所有气体。
[0027] 还可以通过红外光谱法、气相色谱法、质谱法和可调谐的激光二极管技术、基于饲 料特征的发酵平衡的附件技术（例如呼吸测热法）预测方程、同位素示踪物技术等测定放 出的甲烷。
[0028] 此外，可以在"体外"测定甲烷产量。在这种情况中，从动物中采集瘤胃流体并且 在厌氧条件下使用温育培养基温育。
[0029] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合 物。在一个更具体的实施方案中，所述混合物包含新橙皮苷、枸橘苷和柚皮苷。在本发明 另一个具体的实施方案中，所述混合物是天然植物提取物的形式。在一个优选的实施方案 中，所述植物提取物是柑橘属植物提取物且更优选苦橙（bitter orange)植物提取物，所述 提取物包含不同的类黄酮，特别是黄烷酮类糖苷类。在一个优选的实施方案中，所述植物提 取物包含新橙皮苷、枸橘苷和柚皮苷的混合物。正如下列实施例中所示，所述植物提取物是 天然植物提取物，其包含约20% wt.的柚皮苷和40% wt.的苦橙提取物（25 - 27 %柚皮 苷；11 一 13%新橙皮苷和3 - 5%枸橘苷）。在具体情况中，所述天然植物提取物是商购的 (Bioflavex?)。
[0030] 因此，根据本发明，本发明组合物的黄烷酮类可以得自植物，更具体地，得自柑橘 属植物。
[0031] 本发明组合物中的所有成分是天然来源的且易于得到的产物。此外，如果该组合 物是混合物形式，所述混合物易于操作且可以根据本领域专业人员公知的工业化配制方法 制备。
[0032] 本文所用的术语"柑橘（citrus) "是指柑橘属植物。所述柑橘属植物的实例包括 文旦（Citrus maxima)(柚）、枸橡（Citrus medica)(枸橡）、桔（Citrus reticulate)(橘 子）、酸橙（Citrus aurantium)(苦橙）、波斯青朽1 (Citrus latifolia)(波斯青朽1)、朽1檬 (Citrus Iimon)(朽1 樣）、葡萄柚（Citrus paradisi)(葡萄柚）、甜澄（Citrus sinensis) (甜橙）、积（Citrus trifoliata)(积）等。
[0033] 用于从植物中分离类黄酮的方法是本领域众所周知的。在具体的情况中，可以由 本领域技术人员通过提取、过滤、浓缩、沉淀、净化和最终干燥这样的常规方法从磨碎的柑 橘类果实（尤其是酸橙）中得到苦橙提取物。提取过程可以在二元醇/水系统中进行，其 中所述醇选自甲醇、乙醇、丙醇等。优选使用甲醇。作为可替代的非限制性实例，用300ml 甲醇提取50g干燥的苦橙。离心该混悬液以分离残余物，并且真空浓缩母液至最终体积为 50ml。在5天过程中在室温下静置得到的液体，过滤以分离不溶物，再次通过硅藻土床过 滤，并且喷雾干燥。
[0034] 在一个具体的实施方案中，所述黄烷酮可以得自柑橘类植物的果实。例如，柚皮苷 是得自一些柠檬的果实例如葡萄柚和苦橙（酸橙）果皮的糖基化的黄烷酮。它还在果实的 果肉和植物的叶、花和种子中被发现。本发明用于分离类黄酮的示例性、非限制性方法是， 例如描述在对比文件US2421063A和US2421062A中的那些方法，其中描述了从植物材料中 回收柚皮苷的方法，此外，可以根据对比文件US2442110A、US2348215A和US2400693A中所 述的方法得到橙皮苷。同样，可以柑橘对比文件US3375242A中所述的方法得到新橙皮苷。 US3375242A描述了用于生产新橙皮苷的方法，其中使柚皮苷与异香草醛反应，产生新橙皮 苷查耳酮。然后使该查耳酮环化，得到新橙皮苷。
[0035] 另夕卜，易于得到本发明组合物的黄烷酮类，因为它们是商购的。例如，正 如本发明附带的实施例中所示，异柚皮苷、neoeritrocin和枸橘苷购自IND0FINE Chemical Company, Inc(USA)。此外，如上所述，本发明所述的天然植物提取物是商购的 (Bioflavex?)。
[0036] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述组合物是混合物，其包含25 - 55% wt?的柚皮苷、10%-20% wt.的新橙皮苷、wt?的枸橘苷和足量至100% wt?的 载体。在一个更具体的实施方案中，所述组合物包含40 - 50% wt.的柚皮苷、11 一 15% wt.的新橙皮苷、3 - 5%的枸橘苷和足量至100% wt.的载体。
[0037] 根据本发明的另一个优选的实施方案，所述组合物包含载体。在一个具体的实施 方案中，所述载体是海泡石。海泡石是沉淀来源的天然存在的粘土矿物。它是不可溶胀的、 轻质的、多孔性的粘土，其具有大的比表面积。在化学上，海泡石是含水硅酸镁，其颗粒各自 具有针状形态。这种粘土的高表面积和多孔性说明了它对于液体的显著的吸收力。这些特 性使得它成为广泛应用的有价值的材料，例如宠物垃圾、动物饲料添加剂、载体、吸收剂、助 悬和触变添加剂和增稠剂。
[0038] 根据本发明的方法，当给动物饲喂本发明包含天然来源的类黄酮的组合物时，减 少了反刍动物中的甲烷放出/产生。饲喂效率在饲养业中具有经济关联。已知抑制反刍 动物中甲烷生成的化合物导致瘤胃发酵转移至产生更期望的脂肪酸分布，从而增加丙酸而 不是乙酸的比例，由此瘤胃富有活力的发酵变得更有效（参见美国专利号US3, 745, 221 ; US3, 615, 649 ;和US3, 862, 333)。因此，本发明的另一个目的在于提供用于抑制反刍动物中 甲烷生成的方法，其对增加饲料利用效率的瘤胃微生物发酵产生有益效果。正如下列实施 例中所示，本发明的组合物降低了产生的甲烷水平并且转变成有利于丙酸的挥发性脂肪酸 产生。
[0039] 用于测定挥发性脂肪酸的方法是本领域众所周知的。典型地，使用色谱方法，例如 HPLC或带有火焰离子化检测的气相色谱法。
[0040] 饲喂方式不限于任意具体的方式且可以在化合物饲料上添加顶肥得到本发明的 饲料组合物，或在将本发明的饲料组合物与化合物饲料混合后饲喂。此外，对于饲喂的量没 有限制，只要有效地减少甲烷生成，同时营养平衡不受不良影响。
[0041] 因此，在本发明的一个优选的实施方案中，将所述组合物以固体形式添加到饲料 中。在一个具体的实施方案中，以50 - lOOOmg/Kg DM(干物质）的浓度添加所述组合物。 在一个更具体的实施方案中，以200 - 500mg/Kg DM浓度的固体形式添加所述组合物。 [0042] 本发明的组合物可以包含其它饲料成分，例如维生素、酶、无机盐、谷物粉、包含蛋 白质的成分、包含碳水化合物的成分、小麦粗粉和/或麦麸。
[0043] 本发明的饲料组合物的形状不限于任意具体形式且可以是任意常规的饲料组合 物形式，例如粉末和颗粒。此外，可以根据用于生产化合物饲料和饲料补充剂的一般使用的 方法生产所述饲料组合物。
[0044] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述反刍动物是小牛、母牛、水牛、绵羊、鹿、 骆驼或山羊。在一个优选的实施方案中，所述反刍动物是小牛。
[0045] 现在参照下列实施例更详细地描述本发明，这些实施例决不以预以限定本发明的 范围。 实施例
[0046] 材料和方法
[0047] 使用基于 Theodorou M K 等人（1994)Animal Feed Science and Technology, 48(3)，p. 185-197 ;Mauricio，R. M?等人（1999)Animal Feed Science and Technology 79, 321-330所述的实验方案，设计按照相同实验方案的两种试验以研究不同 的纯类黄酮对瘤胃的影响。
[0048] 由半自动压力计测定气体产量，预先计算压力水平与产生的气体体积之间的相关 性。
[0049] 将接受主要由浓缩物组成（90:10)的混合定量的瘤胃插套管的小牛用作瘤胃的 流体供体；饲料组成如表1中所示。采集接种物并且通过双层外科手术用纱布过滤，且保 存在恒温罐中。一式三份用预加热的瓶（39°C )施用类黄酮（表2)+600mg浓缩物（表1) 和作为底物的60mg大麦麦杆并且维持在厌氧条件下。类黄酮异柚皮苷、neoeritrocin、枸 橘昔购自IND0FINE Chemical Company, Inc(USA)。将IOml瘤胃流体和40ml温育培养基 力口入至丨J瓶中(McDougall, EI (1948) Studies on ruminant saliva. I. The composition and output of sheep's saliva. Biochem J. 43 (I) 99-109) 〇 一旦瓶充满且施加厌氧条件，贝丨J密 封瓶并且在热水浴中启动温育过程。在2、4、6、8、12、24、36和48小时进行压力读取。一式 三份，分两组或两批温育每种样品。
[0050] 表1?浓缩物的化学组成（％ )
[0051]
【权利要求】
1. 用于减少反刍动物中甲烷产生的方法，包括通过口服给所述反刍动物施用包含黄烷 酮糖苷的饲料组合物，所述黄烷酮糖苷选自新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷和橙皮苷或其混合 物。
2. 权利要求1的方法，其中所述饲料组合物是包含新橙皮苷和枸橘苷的混合物。
3. 权利要求2的方法，其中所述混合物还包含柚皮苷。
4. 权利要求1-3任一项的方法，其中所述混合物是天然植物提取物。
5. 权利要求4的方法，其中所述植物提取物是柑橘属植物提取物。
6. 权利要求1-5任一项的方法，其中所述组合物还包含载体。
7. 权利要求1-6任一项的方法，其中所述组合物是混合物，其包含25-55% wt.的柚皮 苷、105^-20% wt.的新橙皮苷、wt.的枸橘苷和足量至100% wt.的载体。
8. 权利要求7的方法，其中所述组合物包含40-50% wt.的柚皮苷、11-15% wt.的新 橙皮苷、3-5%的枸橘苷和足量至100% wt.的载体。
9. 权利要求6-8任一项的方法，其中所述载体是海泡石。
10. 权利要求1-9任一项的方法，其中所述反刍动物是小牛、母牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼 或山羊。
11. 权利要求10的方法，其中所述反刍动物是小牛。
12. 权利要求1-11任一项的方法，其中将所述组合物以固体形式加入到饲料中，其浓 度为50-1000mg/Kg干物质。
13. 权利要求12的方法，其中将所述组合物以固体形式加入到饲料中，其浓度为 200-500mg/Kg 干物质。
【文档编号】A23K1/16GK104244730SQ201380020455
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月18日 优先权日:2012年4月19日
【发明者】J·巴尔塞尔斯特雷斯, F·J·克雷斯波蒙特罗 申请人:因特奎姆私人控股公司