一种干花豆组培苗的培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种干花豆组培苗的培育方法，包括以下步骤：1)取干花豆种子经消毒处理后接种于无菌芽苗培养基中，光照培养，得到萌发的干花豆幼苗；2)选取生长健壮的干花豆幼苗，分切成带腋芽单节茎段；3)将分切得到的带腋芽单节茎段接种于诱导培养基中，光照培养，直至长出淡黄色或乳白色幼苗组织；4)将所得幼苗组织切成块状，接种于生芽培养基中，光照培养，得到干花豆丛生苗；5)将所得干花豆丛生苗分株，移植于生根培养基中，光照培养，得到干花豆生根苗。本发明采用合理的培养基，使培育得到的组培苗生根率高；整个方法简单易操作，可实现大批量生产，培育得到的干花豆组培苗无菌无毒，经炼苗移栽后的成活率高。
【专利说明】一种干花s_组培苗的培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物的组织培养技术，具体涉及一种干花豆组培苗的培育方法。
【背景技术】
[0002]干花豆(FordiacaulifloraHemsl)为豆科蝶形花亚科干花豆属植物，又名野京豆、水罗伞、土甘草、虾须草、玉郎伞等。干花豆的花期在5~9月，果期在6~11月，其荚果呈棍棒状，扁平，长7~10cm，宽2~2.5cm,革质，顶端截形，具尖喙，基部渐狭，被平伏柔毛，后渐秃净，有种子I~2粒；种子呈圆形，扁平，宽约1cm，棕褐色，光滑，种阜膜质，包于珠柄。干花豆性辛、平，味甘、微酸，无毒，具有散淤消肿、止痛宁神、润肺化痰等功效。在广西壮、瑶族中用于风湿骨痛、跌打损伤、骨折、小儿痴呆、小儿疳积、肌痿症、体虚及产妇身体复元等症。现代药理学研究表明，干花豆具有抗炎、抗氧化、抗衰老、提高记忆力等作用。
[0003]目前，干花豆的采集主要以野生为主，随着人们的采伐，近些年来干花豆的野外生长面积逐步缩小，在很大程度上限制了干花豆作为药用植物的利用。现有干花豆的人工栽培方式主要是采用来自于野生植株驯化所产生的种子进行播种，首先，这种方式存在种子不易萌发、幼苗易受病虫害等问题；其次，这种方式难以大批量生产，无法满足现代规模化种植的需求。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种干花豆组培苗的培育方法。该方法简单易操作，可实现大批量生产，培育得到的干花豆组培苗无菌无毒，移栽后成活率高。
[0005]本发明所述的干花豆组培苗的培育方法，包括以下步骤:
[0006]I)取干花豆种子经消毒处理后接种于无菌芽苗培养基中，光照培养，得到萌发的干花豆幼苗；其中，在培养过程中，每5~7天更换一次无菌芽苗培养基；所述的无菌芽苗培养基配方为:1/2MS+GA3L O~2.0mg/L+蔗糖25~35g/L+NAAl~3mg/L+琼脂4~8g/L ；
[0007]2)选取生长健壮的干花豆幼苗，分切成带腋芽单节茎段；
[0008]3)将分切得到的带腋芽单节茎段接种于诱导培养基中，光照培养，直至长出淡黄色或乳白色幼苗组织；所述的诱导培养基配方为:MS500~800mg/L+2，4-D2.0~4.0mg/L+椰子汁 200 ~500mg/L+ 活性炭 500 ~1000mg/L+ 琼脂 500 ~600mg/L, ρΗ5.8 ~6.2 ;
[0009]4)将所得幼苗组织切成块状，接种于生芽培养基中，光照培养，得到干花豆丛生苗；所述的生芽培养基配方为:l/2MS+6-BA2~10mg/L ；
[0010]5)将所得干花豆丛生苗分株，移植于生根培养基中，光照培养，得到干花豆生根苗；所述的生根培养基配方为:1/4MS+IBA4~8mg/L+NAAl~2mg/L ；
[0011]上述各步骤中，所述光照培养的培养条件为:温度:昼/夜27±2/17±2°C;光照周期:昼/夜16~20h/8~4h ;光照强度1500~20001x。
[0012]上述所述的培育方法中，[0013]步骤I)中，优选是选取色泽鲜亮、充实、饱满的干花豆种子，该所述的干花豆种子可以是野生植株的种子，也可以是经野生植株驯化所得植株所产生的种子，优选是采用人工授粉发育成熟的干花豆种子，具体地，可以选取生长健壮的5年生以上的干花豆母株，在开花时进行人工授粉，在10~12月份，选取人工授粉发育至基本成熟但是还未开裂的干花豆荚果种子。采用人工授粉发育成熟的干花豆种子可以进一步提高种子授粉率，从而有利于后续干花豆幼苗的萌发率。该步骤中，所述的无菌芽苗培养基配方优选为:1/2MS+GA31.5mg/L+蔗糖30g/L+NAA2mg/L+琼脂5g/L。该步骤中，通常是对干花豆种子进行常规的消毒处理，具体的消毒处理可按下述方法进行:取干花豆种子流水冲洗20~30min，在超净工作台上用70~75% (体积)的乙醇浸泡30s，无菌水清洗3~5次，在0.1~
0.3% (质量)的升汞中浸泡8~IOmin后，取出，用蒸馏水冲洗3次。 申请人:发现，在该步骤中的光照培养过程中，通过每5~7天更换一次无菌芽苗培养基的操作不仅可以使干花豆幼苗更快、更好地萌发，而且萌发得到长势更为健壮的干花豆幼苗。
[0014]步骤2)中，选取生长健壮的干花豆幼苗，按现有常规方法将其分切成带腋芽单节茎段，具体按以下方法进行:选取生长健壮的干花豆幼苗，切取带叶片茎段置于烧杯中，用纱布封口后流水冲洗2~3h，用70~75% (体积)的乙醇浸泡20~30s，然后用0.1~
0.3% (质量)的升汞溶液灭菌5~8min，取出，用无菌水冲洗5次，得到外植体；然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，在无菌条件下用剪刀将外植体的所有叶片剪下(保留少许叶柄)，再用小刀切割干花豆茎段，使每个茎段含两个对生的腋芽(长约为I~1.5cm)，SP得到带腋芽单节茎段。 [0015]步骤3)中，所述的诱导培养基配方优选为:MS600~800mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁300~400mg/L+活性炭700~900mg/L+琼脂500~600mg/L, ρΗ5.8~6.2，更优选为 MS600mg/L+2, 4-D3.0mg/L+ 椰子汁 300mg/L+ 活性炭 700mg/L+ 琼脂 550mg/L，pH6.0。
[0016]步骤4)中，所述的生芽培养基配方优选为:l/2MS+6-BA4~8mg/L，更优选为l/2MS+6-BA6mg/L0
[0017]步骤5)中，所述的生根培养基配方优选为:1/4MS+IBA5~6mg/L+NAAl~1.5mg/L，更优选为 l/4MS+IBA6mg/L+NAAl.5mg/L。
[0018]上述培育方法中所述光照培养的培养条件优选为:温度:昼/夜27±2/17±2°C ；光照周期--昼/夜18h/6h ;光照强度1500~20001x。光照强度优选为1800~20001x。
[0019]在上述限定的光照培养条件下，干花豆种子在无菌芽苗培养基中光照培养得到萌发的干花豆幼苗所需的时间约为20~25天；带腋芽单节茎段在诱导培养基中光照培养直至长出淡黄色或乳白色幼苗组织所需的时间约为10~15天；幼苗组织在生芽培养基中光照培养得到干花豆丛生苗所需的时间约为20~30天；干花豆丛生苗在生根培养基中光照培养得到干花豆生根苗所需的时间约为8~20天，判定得到干花豆生根苗的基准与现有技术中其它植株进行生根培养时得到生根苗的要求相同，具体可以是当丛生苗长出I~2cm的完整根系时即认定得到干花豆生根苗了。
[0020]与现有技术相比，本发明采用合理的培养基，使培育得到的组培苗生根率高，克服了传统方法存在的种子不易萌发、幼苗易受病虫害等不足；整个方法简单易操作，可实现大批量生产，培育得到的干花豆组培苗无菌无毒，经炼苗移栽后的成活率高。【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为实施例1中所得的干花豆丛生苗照片。
【具体实施方式】
[0022]下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0023]实施例1
[0024]I)在4月份，选取发育成熟的、色泽鲜亮、充实、饱满的干花豆种子流水冲洗20min，在超净工作台上用70% (体积)的乙醇浸泡20s，无菌水清洗3次，在浓度为0.3%(质量)的升汞中浸泡8min后，取出，用蒸馏水冲洗3次后接种到无菌芽苗培养基上，每个50ml三角瓶中5~8粒种子，光照培养23d后，得到萌发的干花豆幼苗；其中，所述无菌芽苗培养基配方为:1/2MS+GA31.5mg/L+蔗糖30g/L+NAA2mg/L+琼脂5g/L，pH为5.8 ;光照培养条件为:光照强度15001x，光照时间18h/d，温度为26~28°C;黑暗处理6h/d，温度为16~18°C，每6天更换一次培养基；
[0025]2)选取无病、生长健壮的干花豆幼苗，切取带叶片茎段置于烧杯中，用纱布封口后流水冲洗2h，用70% (体积)的乙醇浸泡20s，然后用0.1% (质量)升汞溶液灭菌5min后，立即用无菌水冲洗5次，得到外植体；用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，在无菌条件下用剪刀将外植体的所有叶片剪下，保留少许叶柄，再用小刀切割干花豆茎段，使每个茎段含两个对生的腋芽，长1cm，即得到分切好的带腋芽单节茎段；
[0026]3)将分切好的带腋芽单节茎段迅速接种于诱导培养基中，光照培养10d，得到淡黄色或乳白色幼苗组织； 其中，所述的诱导培养基配方为:MS500mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁200mg/L+活性炭500mg/L+琼脂500mg/L ;光照培养条件为:光照强度15001x，光照时间18h/d，温度为26~28°C ;黑暗处理6h/d，温度为16~18°C ；
[0027]4)将所得的淡黄色或乳白色幼苗组织切成黄豆大小块状，接种于生芽培养基中，光照培养28d，得到干花豆丛生苗，如图1所示；所述的生芽培养基配方为:l/2MS+6-BA2mg/L ；
[0028]5)将所得干花豆丛生苗分株，移植于生根培养基中，光照培养20d，得到干花豆生根苗；所述的生根培养基配方为:l/4MS+IBA4mg/L+NAAlmg/L ;光照培养条件为:光照强度20001x，光照时间16h/d，温度为26~28°C ;黑暗处理8h/d，温度为16~18°C ；
[0029]6)将所得干花豆生根苗按常规方法进行炼苗，即得到干花豆组培苗。
[0030]实施例2
[0031]I)选取生长健壮的5年生以上的干花豆母株，在开花时进行人工授粉，在10~12月份，采收人工授粉发育至基本成熟但是还未开裂的干花豆荚果种子，按常规方法保存，备用；
[0032]2)在来年的4月份，选取色泽鲜亮、充实、饱满的干花豆种子流水冲洗20min，在超净工作台上用70% (体积)的乙醇浸泡20s，无菌水清洗3次，在浓度为0.1% (质量)的升汞中浸泡IOmin后，取出，用蒸馏水冲洗3次后接种到无菌芽苗培养基上，每个50ml三角瓶中10粒种子，光照培养25d后，得到萌发的干花豆幼苗；其中，所述无菌芽苗培养基配方为:1/2MS+GA32.0mg/L+ 蔗糖 35g/L+NAAlmg/L+ 琼脂 8g/L，pH 为 6.2 ;光照培养条件为:光照强度18001x，光照时间18h/d，温度为26~28°C;黑暗处理6h/d，温度为16~18°C，每7天更换一次培养基；
[0033]3)选取无病、生长健壮的干花豆幼苗，切取带叶片茎段置于烧杯中，用纱布封口后流水冲洗2h，用70% (体积)的乙醇浸泡20s，然后用0.1% (质量)升汞溶液灭菌5min后，立即用无菌水冲洗5次，得到外植体；用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，在无菌条件下用剪刀将外植体的所有叶片剪下，保留少许叶柄，再用小刀切割干花豆茎段，使每个茎段含两个对生的腋芽，长1.5cm,即得到分切好的带腋芽单节茎段；
[0034]4)将分切好的带腋芽单节茎段迅速接种于诱导培养基中，光照培养15d，得到淡黄色或乳白色幼苗组织；其中，所述的诱导培养基配方为:MS800mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁500mg/L+活性炭1000mg/L+琼脂600mg/L ;光照培养条件为:光照强度18001x，光照时间18h/d，温度为26~28°C ;黑暗处理6h/d，温度为16~18°C ；
[0035]5)将所得的淡黄色或乳白色幼苗组织切成黄豆大小块状，接种于生芽培养基中，光照培养20d，得到干花豆丛生苗；所述的生芽培养基配方为:l/2MS+6-BA10mg/L ；
[0036]6)将所得干花豆丛生苗分株，移植于生根培养基中，光照培养15d，得到干花豆生根苗；所述的生根培养基配方为:l/4MS+IBA8mg/L+NAA2mg/L ;光照培养条件为:光照强度20001x，光照时间16h/d，温度为28°C ;黑暗处理8h/d，温度为16°C ；
[0037]7)将所得干花豆生根苗按常规方法进行炼苗，即得到干花豆组培苗。
[0038]实施例3
[0039]I)在4月份，选取发育成熟的、色泽鲜亮、充实、饱满的干花豆种子流水冲洗30min，在超净工作台上用75% (体积)的乙醇浸泡20s，无菌水清洗3次，在浓度为0.1%(质量)的升汞中浸泡IOmin后，取出，用蒸馏水冲洗3次后接种到无菌芽苗培养基上，每个50ml三角瓶中8粒种子，光照培养20d后，得到萌发的干花豆幼苗；其中，所述无菌芽苗培养基配方为:1/2MS+GA31.0mg/L+蔗糖25g/L+NAA3mg/L+琼脂4g/L，pH为6.0 ;光照培养条件为:光照强度18001x，光照时间20h/d，温度为25~27°C;黑暗处理4h/d，温度为17~19°C，每5天更换一次培养基；
[0040]2)选取无病、生长健壮的干花豆幼苗，切取带叶片茎段置于烧杯中，用纱布封口后流水冲洗2h，用70% (体积)的乙醇浸泡20s，然后用0.1% (质量)升汞溶液灭菌6min后，立即用无菌水冲洗5次，得到外植体；用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，在无菌条件下用剪刀将外植体的所有叶片剪下，保留少许叶柄，再用小刀切割干花豆茎段，使每个茎段含两个对生的腋芽，长1cm，即得到分切好的带腋芽单节茎段；
[0041]3)将分切好的带腋芽单节茎段迅速接种于诱导培养基中，光照培养12d，得到淡黄色或乳白色幼苗组织；其中，所述的诱导培养基配方为:MS700mg/L+2，4-D2.0mg/L+椰子汁400mg/L+活性炭800mg/L+琼脂550mg/L ;光照培养条件为:光照强度20001x，光照时间18h/d，温度为27~29°C ;黑暗处理6h/d，温度为16~18°C ；
[0042]4)将所得的淡黄色或乳白色幼苗组织切成黄豆大小块状，接种于生芽培养基中，光照培养20d，得到干花豆丛生苗；所述的生芽培养基配方为:l/2MS+6-BA6mg/L ；
[0043]5)将所得干花豆丛生苗分株，移植于生根培养基中，光照培养10d，得到干花豆生根苗；所述的生根培养基配方为:l/4MS+IBA6mg/L+NAAl.5mg/L ;光照培养条件为:光照强度18001x，光照时间16h/d，温度为26°C ;黑暗处理8h/d，温度为18°C ；
[0044]6)将所得干花豆生根苗按常规方法进行炼苗，即得到干花豆组培苗。[0045]田间实验:
[0046]2013年， 申请人:按本发明实施例1的方法进行培育，将得到的干花豆组培苗直接移栽于实验田中，之后按常规管理方式进行管理，移栽成活率> 95% (移植组培干花豆种苗成活株数/干花 豆组培苗的总移植株数X 100% )。
【权利要求】
1.一种干花豆组培苗的培育方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)取干花豆种子经消毒处理后接种于无菌芽苗培养基中，光照培养，得到萌发的干花豆幼苗；其中，在培养过程中，每5~7天更换一次无菌芽苗培养基；所述的无菌芽苗培养基配方为:1/2MS+GA31.0 ~2.0mg/L+ 蔗糖 25 ~35g/L+NAAl ~3mg/L+ 琼脂 4 ~8g/L ； 2)选取生长健壮的干花豆幼苗，分切成带腋芽单节茎段； 3)将分切得到的带腋芽单节茎段接种于诱导培养基中，光照培养，直至长出淡黄色或乳白色幼苗组织；所述的诱导培养基配方为:MS500~800mg/L+2，4-D2.0~4.0mg/L+椰子汁 200 ~500mg/L+ 活性炭 500 ~1000mg/L+ 琼脂 500 ~600mg/L, ρΗ5.8 ~6.2 ; 4)将所得幼苗组织切成块状，接种于生芽培养基中，光照培养，得到干花豆丛生苗；所述的生芽培养基配方为:l/2MS+6-BA2~10mg/L ； 5)将所得干花豆丛生苗分株，移植于生根培养基中，光照培养，得到干花豆生根苗；所述的生根培养基配方为:1/4MS+IBA4~8mg/L+NAAl~2mg/L ； 上述各步骤中，所述光照培养的培养条件为--温度:昼/夜27±2/17±2°C ;光照周期:昼/夜16~20h/8~4h ;光照强度1500~20001x。
2.根据权利要求1所述的干花豆组培苗的培育方法，其特征在于:步骤I)中，所述的无菌芽苗培养基配方为:1/2MS+GA31.5mg/L+蔗糖30g/L+NAA2mg/L+琼脂5g/L。
3.根据权利要求1所述的干花豆组培苗的培育方法，其特征在于:步骤3)中，所述的诱导培养基配方为:MS600~800mg/L+2，4-D3.0mg/L+椰子汁300~400mg/L+活性炭700 ~900mg/L+ 琼脂 500 ~600mg/L, ρΗ5.8 ~6.2。
4.根据权利要求1所述的干花豆组培苗的培育方法，其特征在于:步骤4)中，所述的生芽培养基配方为:l/2MS+6-BA4~8mg/L。
5.根据权利要求1所述的干花豆组培苗的培育方法，其特征在于:步骤5)中，所述的生根培养基配方为:1/4MS+IBA5~6mg/L+NAAl~1.5mg/L。
6.根据权利要求1所述的干花豆组培苗的培育方法，其特征在于:所述光照培养的培养条件为:温度:昼/夜27±2/17±2°C ;光照周期:昼/夜18h/6h ;光照强度1500~20001x。
【文档编号】A01H4/00GK104012413SQ201410275408
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】刘金磊 申请人:广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所