一种海洋细菌可湿性粉剂的制备方法及其用途

一种海洋细菌可湿性粉剂的制备方法及其用途
【专利摘要】本发明是一种海洋细菌可湿性粉剂的制备方法，其步骤是选用海洋细菌GM-1菌株制备菌株种子液，然后介入到装有发酵培养基的发酵罐中对GM-1菌株进行发酵，制备GM-1菌株发酵液；按饱和吸附量向海洋细菌GM-1的发酵液中加入载体硅藻土，使载体吸附菌体，菌体形成芽孢后，离心，沉淀烘干，即得GM-1菌株菌粉；向菌粉中加入助剂，气流粉碎机粉碎过300目筛，即得成品海洋细菌可湿性粉剂。本发明方法采用现有的海洋细菌制成可湿性粉剂，其可操作性强。制得的可湿性粉剂的性质和稳定性好，活菌数含量可以达到4.90×1010cfu/g，可湿性粉剂对水稻纹枯病有较高的防治效果。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗菌剂的制备方法，特别是一种海洋细菌活菌可湿性粉剂的制备 方法，本发明还涉及该海洋细菌活菌可湿性粉剂的用途。 一种海洋细菌可湿性粉剂的制备方法及其用途

【背景技术】
[0002] 水稻纹枯病是我国水稻三大主要病害之一，一般发病田 块能导致减产159Γ 20%，严重的可达60% ~ 70%，甚至绝收，严重威胁水稻的高产稳产。目 前尚缺乏免疫和高抗品种，纹枯病的防治主要依靠井R霉素，长期使用单一农药容易产生 抗药性，甚至已出现了抗药性，生物防治已经成为水稻纹枯病防治研究的重点，国内外很多 学者开展水稻纹枯病的生物防治研究，筛选出多个对纹枯病菌有较好防治效果的微生物菌 株，有的已经用于生产。
[0003] 由淮海工学院海洋学院实验室从连云港海域海泥中筛选出的海洋细菌GM-1菌株 是解淀粉芽孢杆菌，具有较强的抑菌作用，对9种植物病 原菌均有很强的抑菌作用，而且在光照和紫外线照射下，GM-1菌株的稳定性良好，在pH值 6?8的条件下，GM-1菌株的抗菌作用稳定，且对蛋白酶不敏感。GM-1菌株在以下公开出版 物上均有记截：《油菜菌核病菌拮抗海洋细菌GM-1菌株的种类鉴定及抑菌作用研究》（《植 物保护》2013, 39 (2) 50 - 60)、《海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1培养基及摇瓶发酵条件优化》 (作物杂志，2013. 3)、《海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1菌株发酵液抗菌谱及稳定性测定》(农药第 51卷第10期，2012年10月）。
[0004] GM-1菌株具有广谱性和较强的稳定性，表现出良好的开发应用前景。但现在技术 中还没有对其具体的应用进行研发，而该研发对对于减少化学农药的使用，避免井R霉素 抗药性的产生具有重要意义。


【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗菌效果好的、制 备方法简单的海洋细菌可湿性粉剂的制备方法。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述海洋细菌可湿性粉剂的制备方 法制得的海洋细菌可湿性粉剂的用途。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋 细菌可湿性粉剂的制备方法，其特点是，其步骤如下： (1) 海洋细菌GM-1菌株种子液的制备：将活化的海洋细菌GM-1菌株斜面菌种用2ml 无菌水清洗下，配制成浓度为l〇9cfu/ml的菌悬液，接入到装有50miro培养基的250ml三 角瓶中，28°C、180r/min摇床培养24h，即得种子液，调整浓度为为10 9个细胞/mL作为种子 液； (2) 发酵：用50L发酵罐对海洋细菌GM-1菌株进行发酵，制备海洋细菌GM-1菌株发酵 液；发酵条件：装液量30L，接种量7%，种子液菌龄24h、浓度10 9cfu/ml，温度28°C，搅拌速 度200r/min，通气量3L/min，发酵时间36h ;生物量达2. 40 X 101(lcfu/mL ;得GM-1菌株发酵 液； (3)成品粉剂制备：按饱和吸附量向发酵好的GM-1菌株发酵液中加入载体硅藻土，每 间隔lh搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后GM-1菌体形成芽孢后，离心，沉淀置于60°C 电热恒温鼓风干燥箱中烘干，即制得海洋细菌GM-1菌粉；最后将菌粉与稳定剂硬脂酸钙、 分散剂聚乙烯醇、湿润剂十二烷基苯磺酸钠按重量比75 :15 :6 :4进行混合，气流粉碎机粉 碎，过300目筛，制备得到海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂。
[0008] 本发明中所述的海洋细菌GM-1菌株在《油菜菌核病菌拮抗海洋细菌GM-1菌株的 种类鉴定及抑菌作用研究》（《植物保护》2013,39 (2)50 - 60)中已经公开，该菌株是为公 知公用的材料，如公众需要，淮海工学院海洋学院实验室可以对外提供。
[0009] 本发明所述的制备方法所制得的可湿性粉剂对植物病原真菌的毒力测定方法，其 步骤如下：将制备得到的GM-1菌株可湿性粉剂加入到装有70mL PDA培养基的250ml的 三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培 养皿中，为3个重复；打取直径为5mm的供试水稻纹枯病菌，核 盘菌(5W<9roii/?io 黄瓜枯萎病菌〇工_75/7(〇--)，菠菜早疫病菌 4种植物病原真菌菌苔，放入不同的含药平板中央，28°C下培养5d ; 以不加粉剂为对照，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度的GM-1菌株可湿性粉剂粉 剂对不同病原真菌的抑制率，查询抑制率几率值，以粉剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机 率值为纵坐标，建立GM-1可湿性粉剂对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计算的EC 5(I和 ec90。
[0010] 本发明所述的制备方法制得的海洋细菌可湿性粉剂作为防治水稻纹枯病的用途。
[0011] 与现有技术相比，本发明制备方法采用现有的海洋细菌制成可湿性粉剂，其可操 作性强，制得的可湿性粉剂的性质和稳定性好，粉剂中活菌数量达到4. 90X 101° cfu/g，可 以作为防治水稻纹枯病的农药。

【具体实施方式】
[0012] 以下进一步对本发明的技术方案进行描述，以使本领域技术人员进一步的理解本 发明，而不构成对本发明权利的限制。
[0013] 实施例1，一种海洋细菌可湿性粉剂的制备方法，其步骤如下： (1) 海洋细菌GM-1菌株种子液的制备：将活化的海洋细菌GM-1菌株斜面菌种用2ml 无菌水清洗下，配制成浓度为l〇9cfu/ml的菌悬液，接入到装有50miro培养基的250ml三 角瓶中，28°C、180r/min摇床培养24h，即得种子液，调整浓度为为10 9个细胞/mL作为种子 液； (2) 发酵：用50L发酵罐对海洋细菌GM-1菌株进行发酵，制备海洋细菌GM-1菌株发酵 液；发酵条件：装液量30L，接种量7%，种子液菌龄24h、浓度10 9cfu/ml，温度28°C，搅拌速 度200r/min，通气量3L/min，发酵时间36h ;生物量达2. 40 X 101(lcfu/mL ;得GM-1菌株发酵 液； (3) 成品粉剂制备：按饱和吸附量向发酵好的GM-1菌株发酵液中加入载体硅藻土，每 间隔lh搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后GM-1菌体形成芽孢后，离心，沉淀置于60°C 电热恒温鼓风干燥箱中烘干，即制得海洋细菌GM-1菌粉；最后将菌粉与稳定剂硬脂酸钙、 分散剂聚乙烯醇、湿润剂十二烷基苯磺酸钠按重量比75 :15 :6 :4进行混合，气流粉碎机粉 碎，过300目筛，制备得到海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂。
[0014] 实施例2,海洋细菌活菌粉剂的制备方法筛选及应用实验： 1材料与方法 1. 1菌种 海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1菌株由本实验室分离自连 云港海域。
[0015] 水稻纹枯病菌 ，核盘菌）（5W<9roii/?io 應） 黄瓜枯萎病菌菠菜早疫病菌 C^ieraaria 5·〇7<3/7Υ<3) 1. 2助剂 (1) 载体：膨润土、阜土、高岭土、碳酸氢I丐、活性白土、娃藻土、凹凸棒土； (2) 稳定剂：荧光素钠、硬脂酸锌、腐植酸、黄原胶、海藻酸钠、硬脂酸钙； (3) 湿润剂：脂肪醇聚氧乙烯醚25、蔗糖脂肪酸酯、吐温80、乙氧基化烷基硫酸钠、十二 烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠； (4) 分散剂：聚乙烯醇、羧甲基纤维素纳； (5) 展着剂：柱层层析硅胶、薄层层析硅胶。
[0016] 1. 3培养基 (1)海洋细菌GM-1菌株的活化及培养用培养基（PDA):200g 土豆，20g琼脂粉，20g实验 葡萄糖，lOOOmL水，自然pH。
[0017] (2)海洋细菌GM-1菌株的发酵培养基（PD):200g 土豆，20g实验葡萄糖，水lOOOmL 水，自然pH。
[0018] 1. 3海洋细菌GM-1菌株种子液的制备 将活化的海洋细菌GM-1菌株斜面菌种用2ml无菌水清洗下，配制成浓度为109cfu/ml 的菌悬液，接入到装有50miro培养基的250ml三角瓶中，28°C、180r/min摇床培养24h，即 得种子液，调整浓度为为1〇 9个细胞/mL作为种子液。
[0019] 1. 4不同助剂与海洋细菌GM-1菌株生物相容性测定 250ml的三角瓶中加入50ml的含4%助剂的培养基，接种海洋细菌GM-1菌株的种子 液2ml，28°C，160r/m的摇床中培养24h，采用平板菌落计数法测定发酵液中的活菌数，以 不添加助剂的为对照，比较不同助剂对GM-1菌株生长的影响，筛选与海洋细菌GM-1菌株生 物相容性好的助剂。
[0020] 1. 5载体对海洋细菌GM-1菌株吸附量的测定 选取生物相容性好的载体各2g分别放入到100ml的烧杯中，缓慢向填充剂中滴加海洋 细菌GM-1菌株的发酵液，用玻璃棒搅拌至填充剂粉末开始聚成团状而不分散时停止添加， 记录滴加到填充剂中的海洋细菌GM-1发酵液的量，测定不同载体对海洋细菌GM-1的饱和 吸附量。每种载体做3个重复。
[0021] 1.6载体配比的筛选 将海洋细菌GM-1的新鲜干粉与载体分别按1:5, 1:20, 1:40的比例混合，分别在5d， 10d，15d时取每种试样0. lg溶于9ml的无菌水中制成菌悬液，梯度稀释，用平板菌落计数法 测定加入不同配比载体的菌悬液中海洋细菌GM-1的菌落数。
[0022] 1.7不同助剂对制剂性质的影响 将不同的助剂按不同比例与海洋细菌GM-1菌株菌粉充分混合均匀，过300目筛，制得 不同的制剂。分别准确称量每种制剂各2g，将其缓慢匀速加入到盛有50ml水的100ml量筒 中，记下其完全溶入水中的时间，即湿润时间；用玻璃棒轻轻搅拌，静置50s，观察其悬浮效 果，测定其悬浮率。
[0023] 1.8稳定剂配比的筛选 将与海洋细菌GM-1生物相容性较好的稳定剂与海洋细菌GM-1菌株的菌粉分别按1: 5、 1:10、1:20的质量比混合，经粉碎机粉碎混匀，过300目筛，置于室温（25 °C )条件下贮存， 分别在5(1、10(1、15(1，取不同配比的样品，采用平板菌落计数法测定不质量同配比的制剂中 海洋细菌GM-1的活菌数，以不加稳定剂为对照，每个配比重复3次。
[0024] 1.9湿润剂与分散剂配比及用量的筛选 根据试验所用湿润剂、分散剂对制剂性质影响的测定结果，分别选出最佳的湿润剂、 分散剂。再将最佳的湿润剂、分散剂按不同的比例（9 : 1、8 : 2、7 : 3、6 : 4、5 : 5、 4 : 6、3 : 7、2 : 8、1 : 9)混合，经粉碎机粉碎混匀，过300目筛，测定其湿润时间和悬浮 率，确定最佳的湿润剂和分散剂质量配比。再将最佳质量配比的湿润剂和分散剂按2%、4%、 6%......16%、18%的不同用量添加到菌粉中，测定其湿润时间和悬浮率，综合分析确 定湿润剂和分散剂的用量。
[0025] 1. 10海洋细菌U-9菌株粉剂的制备工艺及其贮藏稳定性测定 用50L发酵罐对海洋细菌GM-1菌株进行发酵，制备海洋细菌GM-1菌株发酵液。发酵 条件：装液量30L，接种量7% (菌龄24h、浓度109cfu/ml)、温度28°C、搅拌速度200r/min、 通气量3L/min、发酵时间36h。生物量达2. 40X 10lclcfu/mL。
[0026] 按饱和吸附量向发酵好的海洋细菌GM-1菌株发酵液中加入吸附量最佳及稳定性 好的载体，每间隔lh搅拌一次，使硅藻土充分吸附海洋细菌GM-1菌体，使载体充分吸附菌 体，48h后海洋细菌GM-1菌体形成芽孢后，离心，沉淀置于60°C电热恒温鼓风干燥箱中烘 干，即制得海洋细菌GM-1菌粉。
[0027] 将菌粉与稳定剂、湿润剂按筛选出的种类和比例进行混合，气流粉碎机粉碎，过 300目筛，制备得到海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂。
[0028] 制备得到的海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂密封，28°C条件下保存，每隔30d取样 1次，采用平板菌落计数方法，测定可湿性粉剂中的GM-1菌株的菌落数，连续测定6次。
[0029] 1. 11海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂对几种植物病原真菌的毒力测定 将制备得到的不同质量的GM-1菌株可湿性粉剂加入到装有70mL PDA培养基的250ml 的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个 培养皿中，为3个重复。打取直径为5mm的供试、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、核盘菌菠菜 早疫病菌4种植物病原真菌菌苔，放入不同的含药平板中央，28°C下培养5d。以不加粉剂 为对照，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度的GM-1菌株可湿性粉剂粉剂对不同病 原真菌的抑制率，查询抑制率几率值，以粉剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐 标，建立GM-1可湿性粉剂对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计算的EC 5(i和EC9(i。
[0030] 1. 12海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂对水稻纹枯病的防治作用 1. 12. 1盆栽防病试验 盆栽试验土壤稻纹枯病菌接种物的制备与接种：将保藏的稻纹枯病菌接种到PDA培养 基平板上，28°C恒温培养5d，进行活化，取活化5d直径9_的稻纹枯病菌菌苔5个，接种到 灭菌的装有40g麦粒与60ml水的500ml三角瓶中，28°C恒温培养5d。取出扩繁后的稻纹枯 病菌培养物，搅拌均匀后按土壤质量的3%添加到土壤中混匀，装入到营养钵中，每个营养 钵装土 200g。
[0031] 在口径为20cm，高17cm的花盆中装入无菌菜园土至盆高的2/3,病原菌培养物20g 均匀混于土壤中，每盆移栽水稻幼苗10株，常规管理，拔节孕穗期喷施GM-1菌株可湿性粉 剂（750g/hm2)，共处理5盆，重复3次。以不用药为对照。观察记录发病情况，计算防病效 果。水稻纹枯病病级划分标准参照檀根甲等人的划分标准 [17]。
[0032] 田间防治效果试验 试验设在东海县安峰镇，选择水稻纹枯病常发病田，前茬作物为小麦，分别于分蘖盛期 和孕穗期喷施GM-1菌株孢子粉制剂（750g/hm2)，小区面积150m2,以清水为空白对照（CK1)， 以20%井岗霉素可湿性粉剂为药剂对照（CK2)，重复4次。随机排列，喷药后以株为单位每 小区对"Z"字形取样，每点调查相连5株，共25株，记录总株数、病株数和病级数，计算防 治效果和保产率。
[0033] 水稻纹枯病分级标准：0级，全株无病；1级，第3片叶以下各叶鞘或叶片发病（自 顶叶算起，下同);2级，第2叶以下各叶鞘或叶片发病；3级顶叶叶鞘或叶片发病；4级，全株 发病，提早枯死。
[0034] 病情指数计算公式： 病情指数（1〇〇%)=【Σ (各级病株数X相对级数值V(调查总叶数X最高级数 值）】X100， 防治效果（100%)=【（CK病情指数一试验后处理病情指数）八CK病情指数）】X 100。
[0035] 2结果与分析 2. 1载体的筛选 2. 1. 1载体与海洋细菌Lf9菌株生物相容性测定 不同载体与海洋细菌GM-1都有较好的生物相容性，添加载体的发酵液平板菌落计数 均大于空白对照组，尤其是添加硅藻土的发酵液活菌含量最高，为6. 80 X 108cfu/g，约是对 照组的7倍，其次是皂土，发酵液含菌量为4. 53 X 101(lCfu/ml。
[0036] 说明硅藻土和皂土与海洋细菌GM-1菌株的生物相容性较好，其中硅藻土的生物 相容性最好。结果见表1。
[0037] 表1添加不同载体的海洋细菌GM-1发酵24h的菌落数

【权利要求】
1. 一种海洋细菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，其步骤如下： (1) 海洋细菌GM-1菌株种子液的制备：将活化的海洋细菌GM-1菌株斜面菌种用2ml无 菌水清洗下，配制成浓度为l〇9cfu/ml的菌悬液，接入到装有50miro培养基的250ml三角 瓶中，28°C、180r/min摇床培养24h，即得种子液，调整浓度为10 9个细胞/mL作为种子液； (2) 发酵：用50L发酵罐对海洋细菌GM-1菌株进行发酵，制备海洋细菌GM-1菌株发酵 液；发酵条件：装液量为30L，接种量7%，种子液菌龄24h、浓度10 9cfu/ml，温度28°C，搅拌 速度200r/min，通气量3L/min，发酵时间36h ;生物量达2. 40 X 101(lcfu/mL ;得GM-1菌株发 酵液； (3) 成品粉剂制备：按饱和吸附量向发酵好的GM-1菌株发酵液中加入载体硅藻土，每 间隔lh搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后GM-1菌体形成芽孢后，离心，沉淀置于60°C 电热恒温鼓风干燥箱中烘干，即制得海洋细菌GM-1菌粉；最后将菌粉与稳定剂硬脂酸钙、 分散剂聚乙烯醇、湿润剂十二烷基苯磺酸钠按重量比75 :15 :6 :4进行混合，气流粉碎机粉 碎，过300目筛，制备得到海洋细菌GM-1菌株可湿性粉剂。
2. 权利要求1所述的制备方法所制得的可湿性粉剂对植物病原真菌的毒力测定方法， 其特征在于，其步骤如下：将制备得到的GM-1菌株可湿性粉剂加入到装有70mL PDA培养 基的250ml的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平 均倒入3个培养皿中，为3个重复；打取直径为5mm的供试水稻纹枯病菌 solanii), iSclerotinio sclerotiorum),^^}^^'^^ iFusarium oxysporum), 菜早疫病菌)4种植物病原真菌菌苔，放入不同的含药平板中央，28 °C 下培养5d ;以不加粉剂为对照，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度的GM-1菌株可 湿性粉剂粉剂对不同病原真菌的抑制率，查询抑制率几率值，以粉剂浓度的对数为横坐标， 抑制率的机率值为纵坐标，建立GM-1可湿性粉剂对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计 算的EC 5Q和EC9。。
3. 权利要求1或2所述的制备方法制得的海洋细菌可湿性粉剂作为防治水稻纹枯病农 药的用途。
【文档编号】A01P3/00GK104145997SQ201410408371
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】暴增海, 马桂珍, 王淑芳, 周向红 申请人:淮海工学院