药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法
【专利摘要】本发明公开了药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法：选用菊叶薯蓣无菌苗叶片接种在MS大量+2×MS微量+MS有机+2×MS铁盐+6-BA1.0～5.0mg/L+NAA0.2～0.8mg/L+IBA0.2～0.8mg/L+GA30.1～0.8mg/L+3％蔗糖+0.75％琼脂固体培养基上，获得根叶俱全的不定芽，然后转接在MS+6-BA0.1～1.0mg/L+NAA0.2～0.8mg/L+IBA0.2～0.8mg/L+GA30.1～0.8mg/L+矮壮素0.5～1.0mg/L+3％蔗糖+0.75％琼脂固体培养基上增殖和生根；最后移栽和大田块茎繁育。该方法效果好，是一种在最短的时间内获得大量试管苗的快速繁殖方法。
【专利说明】药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药用菊叶薯蓣的组培【技术领域】，具体涉及一种药用菊叶薯蓣组培苗批一步成苗批量化生产的方法。
【背景技术】
[0002]薯蓣是一种多年生藤本植物，主要分布于亚洲(中国、印度、緬甸)和美洲(墨西哥、美国、巴西)的热带、亚热带地区，尤以中国和墨西哥居多。据记载，全球薯蓣科植物约650种,我国62种，墨西哥菊叶薯菌(D1scorea composite Hemsl.)是产量和阜素含量最闻的一个品种。
[0003]薯蓣属植物(D1scorea)具有重要的药用价值，其根茎皂甙元是目前世界上合成避孕药、镇疼消炎药、麻醉药、肾上腺皮质激素、性激素以及蛋白同化激素等300多种甾体类药物的起始原料，被医药界称之为“药用黄金”;在医药工业中占有重要地位。而且薯蓣块茎中的淀粉是生产工业酒精的原料，也是一种较好的生物能源。
[0004]组培快繁是近些年来在种苗繁殖过程中应用得最为广泛的一门新兴实用技术，目前，世界上已有几千种植物通过组织培养获得成功，但能大量应用于生产并能产生经济效益的仅有几十种，如香蕉、甘蔗、兰花、非洲菊、马铃薯等。其主要原因有两个方面:一是取决于市场需求及批量；二是生产的技术和成本。菊叶薯蓣的组培繁殖同其他种苗的组培繁殖一样，提高炼苗成活率、建立高效稳定的组培繁殖方法、降低生产成本就成了能否进行产业化生产的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高效低耗量的菊叶薯蓣组织培养方法，该方法配方效果佳，培养周期短，易操作，培养程序简单，培养效率高，稳定性好、生产成本低，是一种在最短的时间内获得大量试管苗的快速繁殖方法。而且本发明方法不污染环境，非常适合工业化生产，已达到产业化水平。
[0006]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0007]药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，依次包括以下步骤:
[0008](I)外植体的选择与接种:选用菊叶薯蓣幼嫩器官经组织培养获得的2?3cm高且生长健壮、长势均匀、品质良好的无菌试管苗为材料；然后将菊叶薯蓣无菌试管苗的叶片接种在 MS 大量 +2 XMS 微量 +MS 有机 +2 XMS 铁盐 +6-BA1.0 ?5.0mg/L+NAA0.2 ?0.8mg/L+IBA0.2?0.8mg/L+GA30.1?0.8mg/L+3%蔗糖+0.75%琼脂固体培养基上，获得根叶俱全的试管苗；
[0009](2)增殖生根:将步骤(I)获得的不定芽转接在MS+6-BA0.1?1.0mg/L+NAA0.2?
0.8mg/L+IBA0.2 ?0.8mg/L+GA30.1 ?0.8mg/L+ 矮壮素 0.5 ?1.0mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂的琼脂固体培养基上进行增殖和生根；
[0010](3)试管苗移栽:试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的幼苗分成单株，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡10?15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活；
[0011](4)大田块茎繁育:将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗3?5d后，移栽至大田进行块茎繁育。
[0012]步骤⑴使用的培养基优选:MS大量+2 X MS微量+MS有机+MS铁盐+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+3%蔗糖 +0.75% 琼脂。或者优选:MS 大量 +2 XMS微量 +MS 有机 +MS 铁盐 +6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.3mg/L+3 % 蔗糖+0.75% 琼脂。
[0013]步骤(I)中将无菌试管苗外植体叶片按I?2cmXl?2cm分成小块。每瓶一般接种6-10块。
[0014]步骤(2)使用的培养基优选:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壮素 1.0mg/L+3 % 蔗糖 +0.75 % 琼脂。或者优选:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壮素 1.0mg/L+3 %蔗糖 +0.75% 琼脂。
[0015]步骤(I)叶片诱导出的不定芽增殖生根时，新芽茎段或顶芽去掉新叶，再分成I节I芽转入增殖生根培养基中增殖生根。去掉的新叶又按照步骤(I)的方法接种。增殖生根时每隔25?30d继代一次。
[0016]步骤(I)和(2)的培养温度为24°C ±2，1000?20001x弱光环境中，每天10?12小时光照培养。
[0017]本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0018]1、利用无菌试管苗为外植体，稳定性好、操作简便，取材容易，不需经过体外消毒，恢复期短；
[0019]2、无菌叶片在诱导培养基上能同步诱导不定芽和根；茎段在增殖生根培养基上能同步诱导侧芽和不定根；
[0020]3、根据前人的研究，菊叶薯蓣的组织培养主要采用外植体-愈伤组织(诱导培养)-分化幼苗(分化培养)-生根(生根培养)等多个培养程序完成，至少需要10d左右。本发明将初代与继代、增殖与生根，多个培养程序简化为一步完成，叶片仅需50?60天形成完整植株，带芽茎段仅需25?30天形成完整植株。4?5个月内可获得大量完整植株，进行大规模工厂化育种。
[0021]3、大规模工厂化生产时，本发明根据生产需要设计培养方法，首先用叶片诱导大量不定芽，抑制根的形成，提高增殖倍数，加快基础苗的繁殖；批量化生产阶段同步诱导侧芽和不定根，增殖与生根简化为一步完成，即“一步成苗”方法，形成完整植株只需30天左右，节约了 25?30天的生根时间。
[0022]4、常规技术生产100万株菊叶薯蓣组培苗，根据每瓶继代苗形成10株用于生根的组培苗，需生产20万瓶组培苗，其中包括10万瓶继代苗，10万瓶生根苗。本发明技术生产100万株菊叶薯蓣组培苗，仅需生产10万瓶增殖生根苗。本发明不仅减少了无菌操作步骤，而且节约了培养室空间，简化了健康种苗生产程序，降低了生产成本，提高了生产效率。
[0023]5、前人研究证明，菊叶薯蓣的人工驯化引种和离体培养快速繁殖的研究取得了较大的进展，但无菌短枝难生根、试管苗的移栽成活率很低，这两大核心问题成为菊叶薯蓣组培快繁技术扩大化生产的瓶颈。本发明不仅创造出一步成苗方法，而且移栽成活率高(达90%以上)。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为菊叶薯蓣初代培养无菌叶片同步诱导不定芽和根生长情况；
[0025]图2为菊叶薯蓣继代培养同步诱导侧芽和不定根生长情况；
[0026]图3为移栽成活的菊叶薯蓣试管苗生长情况；
[0027]图4为移栽成活的菊叶薯蓣试管苗生长情况；
[0028]图5为栽培当年(8个月左右)盾叶薯蓣试管苗的单株种茎生长情况。
【具体实施方式】
[0029]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0030]在本发明所述的配方范围内效果均不错，只是以下两个实施例为进一步优选的情况。
[0031]实施例1、组织培养快速繁殖菊叶薯蓣
[0032]一、培养基配制和灭菌
[0033]初代培养基:MS大量 +2 X MS 微量 +MS 有机 +MS 铁盐 +6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+3% 蔗糖 +0.75% 琼脂；
[0034]增殖生根培养基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壮素
1.0mg/L+3 %蔗糖+0.75%琼脂。以上培养基121 °C下，灭菌20分钟。
[0035]二、初代培养
[0036]取菊叶薯菌(D1scorea composite Hemsl.)无菌试管苗叶片，按I?2cmX I?2cm分成小块，将叶片转入装有初代培养基上培养皿中，每个培养皿外植体个数为6?10个，在下述培养条件下进行培养:24°C左右，每天10小时光照，光照强度为1000?20001x左右；培养8周左右，获267个形成1-3个节的不定芽，诱导率达到85%以上，同步诱导不定芽和根生长情况如图1所示。
[0037]三、继代培养
[0038]取上述267个株系中的267个株系进行继代繁殖，具体方法如下:将步骤二获得的不定芽继代培养时，新芽茎段或顶芽去掉新叶，再分成I节I芽转入增殖生根培养基中，每隔25?30d继代一次。每次继代中，每个茎段或顶芽长出2-6cm高的丛生芽，同时从茎段基部长出1-5条根的完整植株。同步诱导侧芽和不定根生长情况如图2所示；培养条件同步骤二。新芽叶片继续按I?2cmX I?2cm的规格分成小块，接种在初代培养基中进行诱导培养。培养8周后，75%叶片的长成l-5cm高的不定芽，同时从茎段基部长出1_5条根的完整植株。
[0039]四、试管苗移栽:
[0040]试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的幼苗分成单株，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活，成活率达到90%以上，生长情况如图3所示。栽培当年(8个月左右)，获10g/株以上的优质种茎。试管苗田间生长情况如图4和图5所示。
[0041]五、大田块茎繁育:
[0042]将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗3?5d后，移栽至大田进行块茎繁育。
[0043]本发明所提供的菊叶薯蓣组织培养繁殖方法，无菌叶片为外植体，取材容易，数量大，遗传稳定性高，不需经过体外消毒，恢复期短等优势。在初代培养过程中，能同步诱导不定芽和根，繁殖系数大。继代培养阶段，无菌叶片采用同步诱导不定芽和根的方法，茎段或顶芽采用同步诱导侧芽和不定根的方法，不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低。常规技术生产100万株菊叶薯蓣组培苗，根据每瓶继代苗形成10株用于生根的组培苗，需生产20万瓶组培苗，其中包括10万瓶继代苗，10万瓶生根苗。本发明技术生产100万株菊叶薯蓣组培苗，仅需生产10万瓶继代生根苗。本发明不仅减少了无菌操作步骤，而且节约了培养室空间，降低了生产成本，提高了生产效率。而且菊叶薯蓣的无菌短枝难生根、试管苗的移栽成活率很低，这两大核心问题成为菊叶薯蓣组培快繁技术扩大化生产的瓶颈。本发明不仅创造出一步成苗方法，而且移栽成活率高(达90%以上)。
[0044]实施例2、组织培养快速繁殖菊叶薯蓣
[0045]一、培养基配制和灭菌
[0046]初代培养基:MS大量 +2 X MS 微量 +MS 有机 +MS 铁盐 +6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.3Hig/!+3 % 蔗糖 +0.75 % 琼脂。
[0047]继代培养基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壮素1.0mg/L+3 %鹿糖 +0.75% 琼脂。
[0048]以上培养基121 °C下，灭菌20分钟。
[0049]采用上述培养基配方，其它基本操作方法同实施例1 一致，效果与实施例1相当。
【权利要求】
1.药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，依次包括以下步骤: (1)外植体的选择与接种:选用菊叶薯蓣幼嫩器官经组织培养获得的2?3cm高且生长健壮、长势均匀、品质良好的无菌试管苗为材料；然后将菊叶薯蓣无菌试管苗的叶片接种在 MS 大量 +2 X MS 微量 +MS 有机 +2 X MS 铁盐 +6-BA1.0 ?5.0mg/L+NAA0.2 ?0.8mg/L+IBA0.2?0.8mg/L+GA30.1?0.8mg/L+3%蔗糖+0.75%琼脂固体培养基上，获得根叶俱全的试管苗； (2)增殖生根:将步骤(I)获得的不定芽转接在MS+6-BA0.1?1.0mg/L+NAA0.2?0.8mg/L+IBA0.2 ?0.8mg/L+GA30.1 ?0.8mg/L+ 矮壮素 0.5 ?1.0mg/L+3%蔗糖 +0.75%琼脂的琼脂固体培养基上进行增殖和生根； (3)试管苗移栽:试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的幼苗分成单株，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌灵或代森锰锌浸泡10?15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20?30°C，湿度80?90%的条件下生长，25?30d长出新叶时，既已成活； (4)大田块茎繁育:将移栽成活的幼苗，在自然条件炼苗3?5d后，移栽至大田进行块茎繁育。
2.根据权利要求1所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤⑴使用的培养基:MS大量+2XMS微量+MS有机+MS铁盐+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+3% 蔗糖 +0.75% 琼脂。
3.根据权利要求1所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤⑴使用的培养基:MS大量+2XMS微量+MS有机+MS铁盐+6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.3mg/L+3% 蔗糖 +0.75% 琼脂。
4.根据权利要求1或2或3所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤(I)中将无菌试管苗外植体叶片按I?2cmX I?2cm分成小块。
5.根据权利要求1所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤(2)使用的培养基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壮素 1.0mg/L+3%鹿糖 +0.75%琼脂。
6.根据权利要求1所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤(2)使用的培养基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壮素 1.0mg/L+3%鹿糖 +0.75%琼脂。
7.根据权利要求1或5或6所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤(I)叶片诱导出的不定芽增殖生根时，新芽茎段或顶芽去掉新叶，再分成I节I芽转入增殖生根培养基中增殖生根。
8.根据权利要求7所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，去掉的新叶又按照步骤(I)的方法接种。
9.根据权利要求7所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，增殖生根时每隔25?30d继代一次。
10.根据权利要求1或2或3或5或6所述的药用菊叶薯蓣组培一步成苗批量化生产的方法，其特征在于，步骤⑴和⑵的培养温度为24°C ±2，1000?20001x弱光环境中，每天10?12小时光照培养。
【文档编号】A01H4/00GK104221862SQ201410456600
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】黄丽芳, 史端甫, 贺龙泽 申请人:长沙县龙泽农业科技有限公司