一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养及条件的优化等步骤，本发明方法所制备的荚果蕨悬浮细胞长势好，增殖系数高，生长周期短，次生代谢物含量高，为荚果蕨药用成分工业化开发提供基础。
【专利说明】一种荚果蕨悬淳细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荚果蕨悬浮细胞培养的快繁方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 荚果藏，ifeiiewccia ￠. ^ Tbt/aro,球子藏科，株高可达 1 米。根 状茎直立，连同叶柄基部密被针形叶鳞片。叶杯状丛生，二型叶，不育叶两短变小，2回羽状 裂，新生叶直立向上生长，展开后则成鸟巢状。可育叶从叶丛中间长出，叶柄较长，粗而硬， 为不育叶的1/2,羽片荚果状。产黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、河南、湖北西部、陕 西、甘肃、四川、新疆、西藏。也广布于日本、朝鲜、俄罗斯、北美洲及欧洲。生山谷林下或河 岸湿地，海拔80-3000米。原产我国，多生于海拔900-3200米之间的高山林下。喜凉爽湿 润及半荫的环境，也能忍受一定光照。冬季温度不低于l〇°C。对土壤要求不严，但以疏松肥 沃的微酸性土壤为宜。目前荚果蕨的利用采取野生采集，关于其悬浮细胞的研究更无报道。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种荚果蕨悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方 法所制备得到的荚果蕨悬浮细胞长势好，增殖系数高，生长周期短，次生代谢物含量高，为 荚果蕨药用成分的工业化开发提供基础。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的： 取荚果蕨幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0. 1% 氯化汞处理8min，无菌水冲洗5-7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+头孢噻腭钠500 mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加 7. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1501x，温度25°C，诱导的愈伤组织，选择生长良好，健壮的愈伤组 织，称取〇· 3g加入6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+20-10(^g/mL黑曲霉液体培养基中震荡 培养，震荡速度120r/min，每50ml细胞悬浮液装入100ml三角瓶中培养，温度28°C，光照 ΙΟΟΟΙχ，培养一定时间后，定期取出样品，过滤出培养物，经蒸馏水冲洗，用滤纸吸干细胞表 面水分，测定鲜重。
[0005] 采用本发明制备的荚果蕨悬浮细胞长势好，成活率高，生长周期短，次生代谢物含 量高。
[0006] 下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。
【具体实施方式】 [0007] 实施例1 取荚果蕨幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0. 1% 氯化汞处理8min，无菌水冲洗5-7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+头孢噻腭钠500 mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加 7. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1501x，温度25°C，诱导的愈伤组织，选择生长良好，健壮的愈伤 组织，称取〇· 3g加入6, 7-V+ KTO. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+2(^g/mL黑曲霉液体培养基中震荡 培养，震荡速度120r/min，每50ml细胞悬浮液装入100ml三角瓶中培养，温度28°C，光照 ΙΟΟΟΙχ，培养一定时间后，定期取出样品，过滤出培养物，经蒸馏水冲洗，用滤纸吸干细胞表 面水分，成活率为93%。
[0008] 实施例2 取荚果蕨幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0. 1% 氯化汞处理8min，无菌水冲洗5-7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+头孢噻腭钠500mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7. 5g/ L琼脂，30g/L蔗糖，1501x，温度25°C，诱导的愈伤组织，选择生长良好，健壮的愈伤组织，称 取0· 3g加入6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+5(^g/mL黑曲霉液体培养基中震荡培养，震荡 速度120r/min，每50ml细胞悬浮液装入100ml三角瓶中培养，温度28°C，光照ΙΟΟΟΙχ，培养 一定时间后，定期取出样品，过滤出培养物，经蒸馏水冲洗，用滤纸吸干细胞表面水分，成活 率为92%。
[0009] 实施例3 取荚果蕨幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡15min，流水冲洗15min，超净工作台上0. 1% 氯化汞处理8min，无菌水冲洗5-7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接入 H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+头孢噻腭钠500 mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加 7. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1501x，温度25°C，诱导的愈伤组织，选择生长良好，健壮的愈伤 组织，称取〇· 3g加入6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+10(^g/mL黑曲霉液体培养基中震荡 培养，震荡速度120r/min，每50ml细胞悬浮液装入100ml三角瓶中培养，温度28°C，光照 ΙΟΟΟΙχ，培养一定时间后，定期取出样品，过滤出培养物，经蒸馏水冲洗，用滤纸吸干细胞表 面水分，成活率为91%。
【权利要求】
1. 一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱 导、悬浮细胞的培养，其主要步骤如下： (1) 取荚果蕨幼嫩的叶片，在超净工作台上对其进行消毒处理； (2) 取步骤（1)消毒处理过的叶片接入H+NAAO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L+头孢噻腭钠500 mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7. 5g/L琼脂，30g/L蔗糖，1501x，温度25°C ; (3) 取步骤（3)诱导的愈伤组织，选择生长良好，健壮的愈伤组织，称取0.3g加入 6, 7-V+ ΚΤ0. 5mg/L+2, 4-Dlmg/L+20-10(^g/mL黑曲霉液体培养基中震荡培养，培养一定时 间后，定期取出样品，过滤出培养物，经蒸馏水冲洗，用滤纸吸干细胞表面水分。
2. 按照权利要求1所述的一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于：步 骤（1)中所述荚果蕨无菌叶片的获得为，取荚果蕨幼嫩叶片，在肥皂水中浸泡15min，流水 冲洗15min，超净工作台上0. 1%氯化萊处理8min，无菌水冲洗5-7遍，吸水纸吸去表面水 分。
3. 按照权利要求1所述的一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于：步 骤（2)诱导培养基中附加了头孢噻腭钠500mg/L，可以消除生长过程中内生菌的出现。
4. 按照权利要求1所述的一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于：步 骤（3)悬浮细胞培养中附加了黑曲霉，对细胞生长量和次生代谢物质的含量均有显著的影 响。
5. 按照权利要求1所述的一种荚果蕨悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于：步 骤（3 )悬浮细胞培养采用水平震荡培养，震荡速度120r/min，每50ml细胞悬浮液装入100ml 三角瓶中培养，温度28°C，光照ΙΟΟΟΙχ。
【文档编号】A01H4/00GK104186342SQ201410463169
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司