一种菜豆直接再生体系的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种菜豆直接再生体系的建立方法，主要包括菜豆无菌苗的获得方法、直接再生培养基配方、生根培养基配方、组培苗移栽方法等，针对现有技术中菜豆组织培养体系技术方案不完整、不明确，甚至方法本身重复再现性差的缺陷，本发明通过筛选各种功能培养基中不同激素种类及其配比，最终建立高频、高效的菜豆直接再生体系，为菜豆组培快繁及转基因育种的应用奠定基础。
【专利说明】一种菜豆直接再生体系的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及以菜豆子叶节为外植体，获得高频、高效的菜豆直接再生体系的方法。
【背景技术】
[0002] 菜豆L.]又称芸豆，四季豆，玉豆、扁豆等，属豆科菜豆属菜 豆种植物。菜豆起源于中南美洲的热带地区，主要分布于墨西哥南部和中美洲，15世纪经美 洲引入我国。通过不断的演化和变异，出现了以嫩荚供食用的软荚菜豆，因此中国被认为是 菜豆的次级起源中心，在中国已有500多年的栽培历史。菜豆在我国各省市均有栽培，面积 十分广泛。据联合国粮农组织统计（FA0,2012年)，中国粒用菜豆总栽培面积为1456. 5万 亩，食荚菜豆栽培面积为939万亩。栽培面积仅次于巴西和印度，位居世界第三。
[0003] 菜豆是严格闭花授粉作物，繁种过程中种性退化严重。加上人工杂交成功率低，知 识产权无法保护，因此菜豆品种更新极为缓慢。种性退化对产量和商品性影响很大，菜农急 需新品种更新。随着分子生物学和植物基因工程的发展，人们开始借助生物技术手段建立 高频、高效的菜豆再生体系并对其进行遗传转化，可大幅度缩短育种周期，提高育种效率。
【发明内容】
[0004] 本发明公开的一种菜豆直接再生体系的建立方法，针对现有技术中菜豆组织培养 体系技术方案不完整、不明确，甚至方法本身重复再现性差的缺陷，本发明提供了一种以菜 豆子叶节为外植体建立高频、高效再生体系的方法。
[0005] 本发明目的是在基础培养基的基础上，通过筛选培养基中不同激素种类及其用量 的配比（筛选的培养基包括再生培养基和生根培养基，再生培养基激素包括6-BA，用量在 I.Omg/L-6.Omg/L;IAA，0.Img/L-1.Omg/L。生根培养基激素是IBA，用量为 0mg/L-1.Omg/ U最终建立高频、高效的菜豆直接再生体系的方法，为菜豆组培快繁及转基因育种的应用 奠定基础。
[0006] 为实现上述目的，本发明公开了一种菜豆直接再生体系的建立方法，其特征在于 按如下的步骤进行： (1) 菜豆无菌苗的获得方法： 挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为10%_30%的次氯酸钠溶液 缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时l〇_2〇min，并 每隔l-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子 用无菌水清洗4-5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发 培养基内，种子插入一半即可，种子萌发环境为温度20°C-25°C，光周期为16h/8h光照/黑 暗； (2) 直接再生培养基培养基配方及操作方法： 将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶 端生长点及胚根，留下子叶节上下各I. 5-3. 5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平 均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度 0. 3-0. 5mm;将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密 封并置于培养室中培养，培养环境为温度20°C-25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养 基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是=MSB5+ 6-BAI. 0-6. 0mg/L+IAA0? 1-1. 0mg/L+ 活性炭 10-50mg/L; (3)再生芽的生根培养基配方及操作方法：将长到4-5cm的不定芽延基部从外植体上 切下，插入1/2MSB5+IBA0. 1-1.0mg/L+活性炭5-30mg/L生根培养基内，密封好后置于培 养室内培养，培养环境为温度20-25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-10天顺利生根； (4) 组培苗的移栽方法：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3-5天，然后移栽到装 有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28°C， 相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去； (5) 成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
[0007] 本发明所述的菜豆直接再生体系的建立方法，其中的菜豆品种指的是双丰3号。
[0008] 本发明更进一步公开了菜豆直接再生体系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根 率、植株成苗率方面的应用。实验结果表明：菜豆直接再生体系的建立方法易于诱导再生 芽， 再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高。直接再生周期短，直接再生易于操 作，重现性好。
[0009] 本发明建立的菜豆直接再生体系其中的关键在于： (1)明确了菜豆种子消毒的最佳方法，此方法易操作，效果最好。
[0010] (2)摸索出菜豆子叶节直接再生的最佳培养基配方及操作方法，再生频率高，重复 性好。
[0011] (3)筛选出再生植株生根的最佳培养基配方及操作方法，使生根速度快，质量好， 有利于再生苗的移栽。
[0012] 本方法更加详细的描述如下： 主要包括菜豆无菌苗的获得方法、直接再生培养基配方及操作方法、生根培养基配方 及操作方法、组培苗的移栽方法等，具体步骤如下： 1、菜豆无菌苗的获得方法 挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内。将浓度为10%-30%的次氯酸钠溶液 缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中。整个消毒过程用时l〇_2〇min，并 每隔l-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底。消毒后的菜豆种子 用无菌水清洗4-5次。整个消毒过程在超净工作台内完成。将清洗后的菜豆种子插入萌发 培养基内，种子插入一半左右即可。种子萌发环境为温度20°C_25°C，光周期为16h/8h光 照/黑暗。
[0013] 2、直接再生培养基配方及操作方法 将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端 生长点及胚根，留下子叶节上下各1. 5-3. 5_左右的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平 均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度 0. 3-0. 5mm。将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密 封并置于培养室中培养，培养环境为温度20°C-25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗。培养 基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株。
[0014] 3、生根培养基配方及操作方法 当再生芽长到4_5cm时，将再生植株从外植体上切下，插入到生根培养基内培养，培养 环境为温度20°C-25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-15天左右便可顺利生根。
[0015] 4、组培苗的移栽方法 生根后，将瓶盖打开在培养室内炼苗3-10天，移苗至装有基质的营养钵中，将移栽好 的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28 °C，相对湿度60%左右。拱棚内生 长5-10天，逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去。
[0016] 该方法菜豆种子消毒效果达100%，不定芽再生频率为11. 2个/外植体，不定芽生 根率达到95. 3%，生根数量为13. 6根/植株，组培苗移栽成活率达97%。
[0017] 本发明公开的菜豆直接再生体系的建立方法与现有技术相比所具有的积极效果 在于： (1)种子消毒方法更规范，消毒效果更好，且易于操作。
[0018] (2)直接再生更易于得到再生植株，重复性好。
[0019] (3)提高了再生植株生根率，进而提高成苗率。
【具体实施方式】
[0020] 本发明实施例公开了菜豆直接再生体系的建立方法。本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法和应用已经通过 较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述 的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0021] 其中所述的MS培养基以及缩写的MSB5培养基指的是（MS和B5培养基是组培上常 用的培养基，配方及用量都是已知的。另外MSB5、6-BA、IAA、活性炭、双丰3号菜豆品种 均由市售。
[0022] 实施例1 双丰3号菜豆品种直接再生体系的建立，包括以下步骤： (1)种子的消毒：在超净工作台内，将整齐一致的双丰3号种子放入玻璃容器内，倒入 10%次氯酸钠溶液浸泡l〇min，每隔2min搅拌一次。将消毒的种子用灭菌水冲洗4次，倒干 容器内的灭菌水后备用。
[0023] (2)无菌苗的获得：在超净工作台内，用镊子取出消毒后的菜豆种子，将种脐朝下 插入萌发培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20°C，光周期为16h/8h 光照/黑暗。
[0024] (3)再生芽的获得：无菌苗培养5天后，在超净工作台内取出无菌苗，置于灭菌后 的培养皿内，切除植株的生长点及胚根，留下子叶节上下各I. 5_左右的下胚轴，顺着下胚 轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤 口长3mm，深度0. 3mm。将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入1/2MMSB5+ 6-BA1.0mg/L+IAA0.Img/L+活性炭10mg/L芽诱导培养基中，密封好后置于培养室中培 养，培养环境为温度20°C，光周期为16h/8h光照/黑暗。培养基每隔5天更换一次，15天 可获得再生芽。
[0025] (4)再生芽的生根：将长到4-5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB5+ IBA0.lmg/L+活性炭5mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度 20°C，光周期为16h/8h光照/黑暗，7天左右便可顺利生根。
[0026] (5)组培苗的移栽：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3天左右，然后移栽到 装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度28°C，相 对湿度60%左右。拱棚内生长6天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去。
[0027] (6)成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
[0028] 实施例2 双丰3号菜豆品种直接再生体系的建立，包括以下步骤： (1)种子的消毒：菜豆种子消毒相关文献未见报道，试验对比了大豆等一些豆类种子消 毒方法，明确了菜豆种子最佳的消毒方法，具体操作如下：在超净工作台内，将整齐一致的 双丰3号种子放入玻璃容器内，倒入30%次氯酸钠溶液浸泡16min，每隔2min搅拌一次。将 消毒的种子用灭菌水冲洗5次，倒干容器内的灭菌水后备用。
[0029] (2)无菌苗的获得：在超净工作台内，用镊子取出消毒后的菜豆种子，将种脐朝下 插入萌发培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20°C，光周期为16h/8h 光照/黑暗。
[0030] (3)再生芽的获得：采用愈伤组织诱导再生芽率最高仅为90%，再生频率低。采用 直接再生方法再生芽诱导率达100%，再生频率高达11. 2个/外植体。直接再生是将无菌苗 培养6天后，在超净工作台内取出无菌苗，置于灭菌后的培养皿内，切除植株的生长点及胚 根，留下子叶节上下各3. 5_左右的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个 对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长4mm，深度0. 5mm。将处理好的外 植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封好后置于培养室中培养， 培养环境为温度25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗。培养基每隔10天更换一次，20天可 获得再生芽。
[0031] (4)再生芽的生根：前人报道，再生植株生根率为90%，而通过调整培养基配方， 1/2MSB5+IBA1.0mg/L+活性炭30mg/L，生根率可达到95. 3%，效率大大提高。具体方法如 下：将长到5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入生根培养基内，密封好后置于培养室 内培养，培养环境为温度23°C，光周期为16h/8h光照/黑暗，15天左右便可顺利生根。
[0032] (5)组培苗的移栽：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗10天左右，然后移栽到 装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度28°C，相 对湿度60%左右。拱棚内生长10天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤 去。
[0033] (6)成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
[0034] 实施例3 (1)菜豆无菌苗的获得： 挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为25%的次氯酸钠溶液缓 缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时14min，并每隔 2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子用无菌水 清洗5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种 子插入一半即可，种子萌发环境为温度25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗； (2) 直接再生培养基的筛选： 将萌发5天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生 长点及胚根，留下子叶节上下各2. 5_的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到 两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3. 5mm，深度0. 4mm;将处理 好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中 培养，培养环境为温度28°C，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养基每隔8天更换一次，15天 后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是=MSB5+ 6-BA5.Img/L+IAA0. 7mg/L+活 性炭35mg/L; (3) 再生芽的生根：将长到4cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB5+IBA 0. 7mg/L+活性炭25mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度 25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗，10天顺利生根； (4) 组培苗的移栽：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗5天，然后移栽到装有基质 的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度28°C，相对湿度 60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去； (5) 成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
[0035] 实施例4 对比试验
【权利要求】
1. 一种菜豆直接再生体系的建立方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 菜豆无菌苗的获得： 挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为10%-30%的次氯酸钠溶液 缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时l〇_2〇min，并 每隔l-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子 用无菌水清洗4-5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发 培养基内，种子插入一半即可，种子萌发环境为温度20°C-25°C，光周期为16h/8h光照/黑 暗； (2) 直接再生培养基配方及操作方法： 将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶 端生长点及胚根，留下子叶节上下各1. 5-3. 5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平 均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度 0. 3-0. 5mm ;将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密 封并置于培养室中培养，培养环境为温度20°C -25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养 基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是：MSB5+ 6-BA 1. 0-6. 0 mg/L+IAA 0? 1-1. 0 mg/L+ 活性炭 10-50mg/L ; (3) 再生芽的生根培养基配方及操作方法：将长到4-5cm的不定芽延基部从外植体上 切下，插入1/2MSB5+ IBA 0. 1-1.0 mg/L+活性炭5-30mg/L生根培养基内，密封好后置于培 养室内培养，培养环境为温度20-25°C，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-10天顺利生根； (4) 组培苗的移栽方法：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3-5天，然后移栽到装 有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28°C， 相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去； (5) 成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
2. 权利要求1所述的菜豆直接再生体系的建立方法，其中的菜豆品种指的是双丰3号。
3. 权利要求所述菜豆直接再生体系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根率、植株成苗 率方面的应用。
【文档编号】A01H4/00GK104472352SQ201410661867
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】古瑜, 韩启厚, 于海龙 申请人:天津科润农业科技股份有限公司