一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋亡相关的miRNA及其在奶山羊育种中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，提供了一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋亡相关的miRNA及其在奶山羊育种中的应用，该小RNA分子miR-143可以通过延缓细胞周期进程抑制乳腺上皮细胞的增殖，发明人利用该特性发现通过基因工程技术抑制miR-143或其前体表达，可间接抑制乳腺上皮细胞凋亡，以达到延缓乳腺退化、延长泌乳期、提高乳用家畜泌乳量，具有极高的应用价值。
【专利说明】一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋亡相关的miRNA及其在奶山 羊育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，提供了一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋亡相关的 miRNA及其在奶山羊育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 奶山羊乳腺发育、泌乳和退化过程具有一定规律性，其涉及乳腺细胞生长发育、增 殖与凋亡，以及死亡。现在利用分子手段调控乳腺细胞凋亡过程、延缓乳腺退化过程，以延 长奶山羊的泌乳期、提高泌乳量、改善奶山羊泌乳遗传性能，为崂山奶山羊的分子改良提供 新的思路和有益的线索，是现今技术发展的主要方向。
[0003] miRNA是一类长度约22nt (nucleotide)，存在于生物体内的、单链的、非蛋白质编 码的、进化上高度保守的一种调控型的小RNA分子，其通过调控靶基因表达广泛参与了神 经发育，细胞分化、增殖及凋亡，脂肪代谢（Xu et al，2003)，乳腺发育等生理过程，并作为 抑癌基因或癌基因而发挥重要的功能。
[0004] miRNA在动物中的研宄首先发现于线虫中，被称为异时开关基因的Lin-4,该基因 虽然不编码蛋白但能使线虫发育事件延迟发生。后来Reinhart等研宄人员又发现了第二 个同样的异时开关基因 Let-7,其能调控线虫发育时期的转变。后来研宄人员又发现Let-7 家族的很多miRNA，像miR-148、miR-84和miR-241也参与了线虫发育时期转变的调控。
[0005] 随着测序技术的不断发展，特别是随着近几年来第二代测序技术的发展，研宄人 员可以大批量地鉴定和发现一些新的miRNA，使miRNA的发展日新月益，鉴定出来的新 miRNA成指数上升，miRNA以其独特的调控方式和表达特性迅速成为生物学领域研宄的热 点。
[0006] 乳腺发育、泌乳和退化过程中，激素、生长因子和一些蛋白质发挥着关键性作 用。microRNA被发现后，它在器官发育过程中所发挥的作用也逐渐引起了研宄者的关注。 2010年，来自哥廷根、法兰克福和汉诺威的科学家们发现激素和蛋白并非是乳腺发育的完 全决定因素，一些小的核糖核酸分子在此过程中亦发挥了关键性作用，实验所用的小鼠拥 有乳腺发育所必需的所有激素、生长因子和蛋白质，但由于缺乏miR-122和miR-132而导 致小鼠乳腺导管完全无法发育，研宄人员第一次在动物模型中证实了小核糖核酸分子，即 microRNAs，在器官发育中发挥重要的功能。
[0007] 而miR-143作为一种全新的小RNA分子，现有报道中记载其可以实现对于癌细胞 的增殖抑制，进而可以用来抑制肿瘤的生长，但是由于癌细胞与正常细胞的差异，这一作用 是否能够应用于正常细胞中还未可知，至今未见关于miR-143在乳腺细胞凋亡中的作用及 其育种应用的任何报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋 亡相关的miRNA及其在奶山羊育种中的应用，该小RNA分子miR-143可以通过延缓细胞周 期进程抑制乳腺上皮细胞的增殖，发明人利用该特性发现通过基因工程技术抑制miR-143 或其前体的表达，可间接抑制乳腺上皮细胞凋亡，以达到延缓乳腺退化、延长泌乳期、提高 乳用家畜泌乳量，具有极高的应用价值。
[0009] 发明人首先提供了一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋亡相关的miRNA，该miRNA为 miR-143,其基因序列如SEQ ID NO. 1所示，其前体基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 为了验证该miRNA的相关作用，发明人采用MTT法、荧光Hoechst/PI双染技术和 流式细胞术研宄了 miR-143对乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响，结果表明，miR-143通过延 缓细胞周期进程，可抑制细胞增殖、促进凋亡；具体过程如下：
[0011] 发明人首先将miR-143瞬时转染到体外培养的原代乳腺上皮细胞，采用MTT法对 细胞增殖结果进行检测，结果发现转染后48h和72h时，细胞活力在转染组比色值显著降 低，在48h时两组间差异达到极显著水平（P〈0. 01)，说明miR-143抑制乳腺上皮细胞的增 殖；
[0012] 在此工作的基础上，发明人进一步采用荧光Hoechst/PI荧光双染技术和流式细 胞术验证了 miR-143对乳腺上皮细胞凋亡的影响，并采用qRT-PCR检测了凋亡标志基因表 达：
[0013] 其荧光双染技术表明，在空白组Hoechst33342染色细胞核呈正常状态，对照组 Hoechst33342也呈正常状态，而转染组经Hoechst33342染色后细胞核在荧光显微镜下则 形态不完整，呈出碎裂状凋亡小体，表现出明显的凋亡现象；
[0014] 流式细胞仪分析发现，miR-143通过使细胞周期阻滞在Gl期，延缓了细胞周期的 进行，对照组只检测到正常二倍体细胞DNA峰（Gl峰），转染组的Gl峰前出现一小峰，即所 谓的凋亡峰（Ap峰），说明miR-143促进乳腺上皮细胞的凋亡；
[0015] qRT-PCR检测结果表明，与对照组相比，凋亡基因 BAX在转染组表达量极显著升高 (P〈0. 01)，BCL2在转染组其表达量变低，但差异不显著，进一步说明miR-143促进乳腺上皮 细胞的凋亡。
[0016] 基于上述的发现，发明人进一步通过基因工程技术抑制miR-143在奶山羊体内的 表达，可间接抑制乳腺上皮细胞凋亡，以达到延缓乳腺退化、延长泌乳期、提高乳用家畜泌 乳量，具有极高的应用价值。除此之外还可以采用抑制基因序列如SEQ ID NO. 2所示的前 体序列在奶山羊体内的表达，来实现上述的目的。
[0017] 综上所述，本发明的发明人在充分试验的基础上提供了一种与奶山羊乳腺上皮细 胞凋亡相关的miRNA及其在奶山羊育种中的应用，该小RNA分子miR-143可以通过延缓 细胞周期进程抑制乳腺上皮细胞的增殖，发明人利用该特性发现通过基因工程技术抑制 miR-143或其前体在奶山羊体内的表达，可间接抑制乳腺上皮细胞凋亡，以达到延缓乳腺退 化、延长泌乳期、提高乳用家畜泌乳量，具有极高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为体外培养的原代乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定结果灰度图，
[0019] 图中右下角深色区域是乳腺上皮细胞标志蛋白角蛋白18的免疫荧光鉴定；可见 我们在体外培养获得的确实是乳腺上皮细胞；
[0020] 图2为miR-143对细胞活力影响的MTT法检测结果示意图，
[0021] 图中A为对照组与转染组细胞生长曲线；B为对照组与转染组MTT检测结果；
[0022] 图中A为通过细胞计数得到的对照组与转染组间细胞生长曲线，结果显示转染 miR-143后，细胞计数明显减少，生长受到抑制；图中B为通过MTT法测得对照组与转染组 间细胞吸光值结果，结果显示转染组细胞在培养48h时，吸光值明显降低；两部分结果都说 明miR-143对体外培养的乳腺上皮细胞生长具有一定抑制作用；
[0023] 图3为miR-143对细胞凋亡影响的荧光Hoechst33342/PI双染检测结果灰度示意 图，
[0024] 图中 I 组（I -1，I -2，I -3)为阳性对照；II组（II -1，II -2, II -3)为转染 组；III组（III -1，III -2, III -3)为阴性对照；1 列（I -1，II -1，III -1)为正常细胞；2 列 (I -2，II -2, III -2)为 PI 染色；3 列（I -3，II -3, III -3)为 Hoechst33342 染色；
[0025] 经PI染色后，在显微镜下可观察到死亡细胞，经Hoechst33342染色后，可观察到 凋亡细胞，并呈现凋亡颗粒；实验结果表明所有实验细胞经PI染色后，仅发现有少量细胞 死亡，而大部分为正常生长细胞，而经H 〇echst33342染色后，在转染组呈现出明显的细胞 凋亡状态，结果说明miR-143对体外培养的乳腺上皮细胞具有明显的促凋亡作用；
[0026] 图4为miR-143对细胞周期影响的流式细胞术检测结果示意图，
[0027] 图中A为阳性对照细胞周期分布；B为转染组细胞周期分布；C为不同组间细胞周 期分布统计结果，显示经miR-143处理后，Gl期变长而S期变短，且两组处理间差异达到显 著水平，结果说明miR-143可使体外培养的细胞生长周期阻滞在Gl期，从而延缓了细胞周 期的进程；
[0028] 图5为miR-143对乳腺上皮细胞凋亡影响的流式细胞术检测结果示意图，
[0029] 图中A为阳性对照组；B为转染组，
[0030] 结果显示在对照组仅检测到正常的二倍体细胞DNA峰（Gl峰），而转染组在Gl峰 前出现一小峰，即所谓的凋亡峰（Ap峰）.结果表明miR-143对体外培养的乳腺上皮细胞具 有促凋亡作用；
[0031] 图6. miR-143过表达后凋亡相关基因 BAX和BCL2表达的qRT-PCR检测结果示意 图，结果显示凋亡基因 BAX在转染组，与阳性对照相比其mRNA表达量显著升高，差异达到极 显著（P〈0. 01)，抗凋亡基因 BCL2在对照组，与转染组相比其mRNA表达量显著升高，差异达 到显著性（P〈〇. 05)，结果表明miR-143对体外培养的乳腺细胞具有凋亡作用。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人 员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明 作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本 领域现有技术；
[0033] 其中细胞培养基的配制：体积比FBS !DMEM-F12为1:9的溶液，含有5mg/L牛胰岛 素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
[0034] 消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和0. 25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消 化条件为室温25°C，成纤维细胞消化时间为2-3分钟；
[0035] 其中所采用的FBS、DMEM-F12、0. 25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液购自gibco公司， 牛胰岛素、氢化可的松和青链霉素双抗购自Sigma公司，表皮生长因子购自Invitrogen公 司；
[0036] 实施例1.原代乳腺上皮细胞培养
[0037] 1.乳腺组织采集与处理
[0038] 用常规手段获取奶山羊乳腺组织，取样时，获取腺泡较丰富且结缔组织和脂肪较 少的乳腺组织块约30g，放入含3%双抗的灭菌PBS中冲洗后，于低温2h内带回实验室。培 养前将乳腺组织在培养皿中用含1 %双抗的PBS洗3-5次，直到组织颜色发白。用手术剪刀 将组织剪碎（成Imm3左右的乳糜小块），再用含1 %双抗的PBS清洗2次，洗到组织块发白 为止。
[0039] 2.组织块接种及培养
[0040] (1)用吸管或眼科镊子将乳糜样组织小块接种于培养瓶中：每个25cm2平皿十块 左右均匀放置，每小块间距0. 5cm左右；
[0041] (2)将培养瓶轻轻翻转使组织块朝下，置于37°C培养箱中培养2_3h左右，使组织 块牢固贴于培养瓶表面；
[0042] (3)加入含1 %双抗的全培养基3-4ml (培养基成分包括：DMEM/F12基础培养基、 10%胎牛血清FBS、胰岛素、氢化可的松和表皮生长因子），轻轻转动培养瓶，使培养液缓缓 浸润组织块；
[0043] (4)将培养瓶放入培养箱中于37°C、5% CO2条件下培养，每3天换液一次；
[0044] (5) 10天后在显微镜下观察细胞爬出情况，待细胞长出后，每2天换液一次。
[0045] 3.细胞纯化：
[0046] 在培养的乳腺上皮细胞中混有成纤维细胞，利用两种细胞消化和贴壁所需时间长 短不同来进行纯化，待细胞生长良好后，用0. 25%的胰酶对细胞进行消化传代，最终获得较 纯的乳腺上皮细胞，具体操作如下：
[0047] (1)将培养瓶取出吸掉旧培养液，用卜2mLPBS润洗细胞，加入ImLO. 25%的胰酶消 化；
[0048] (2)放在显微镜下观察，成纤维细胞会比上皮细胞先从瓶壁上脱落，因此待有细胞 脱落时弃掉消化液连同脱落的细胞，重新加入ImLO. 25%的胰酶继续消化，至细胞全部脱落 时，加入全培养液终止消化；
[0049] (3)重复纯化3-4代，可消除成纤维细胞从而获得较纯的乳腺上皮细胞；
[0050] 发明人对其进行体外培养的原代乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定，结果如图1所示， 其中右下角深色区域是乳腺上皮细胞标志蛋白角蛋白18的免疫荧光鉴定；可见我们在在 体外培养获得的确实是乳腺上皮细胞。
[0051] 实施例2.细胞瞬时转染
[0052] 转染试验分为3组：转染组、阴性对照和阳性对照
[0053] 首先将miR-143按常规方法连接到pcDNA3. 1载体上获得转染质粒用于转染组；
[0054] 将pcDNA3. 1空载体作为阳性对照组的转染质粒；
[0055] 阴性对照为不采用任何转染质粒；
[0056] 转染步骤按 Lipofectamine? LTX and PLUS? Reagents (invitrogen)转染试剂盒 说明书进行；
[0057] (1)对于培养贴壁良好处于指数生长期的细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，均匀 等量的接种于24孔培养板；
[0058] (2)培养24h后，细胞融合度达70-80 %时进行细胞转染；
[0059] (3)将每组质粒及内参载体质粒pGL4. 74(转染质粒与内参质粒按质量比30:1)按 每孔质粒终浓度〇· 8 μ g稀释至100 μ I Opti-MEM I中，质粒DNA( μ g)与Lipofectamine? PLUS ( μ 1)体积按1:1的量加入Lipof ectamine? PLUS后吹打混匀，5min后加入适量 Lipofectamine? LTX转染试剂轻轻吹打混匀，室温继续孵育30min ;
[0060] (4)加100 μ L混合液至待转染的每一细胞培养孔中，将含双抗的培养液（体积比 FBS !DMEM-F12为1:9的溶液，含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长 因子和10万IU/L青链霉素双抗；）换成不含抗生素的上述培养液，每孔加400 μ L，每组设 置4个复孔；
[0061] (5)将培养板放入37 °C 5% CO2培养箱中继续培养，在转染后6h换掉转染液，继续 用正常培养液培养，转染后24-48h检测荧光强度。
[0062] 实施例3. MTT法检测miR-143对细胞增殖影响
[0063] (1)细胞接种：用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成单细胞悬液，经过反复 摸索，最终以每孔3 X IO4个细胞密度接种于96孔板，每孔培养液体积200 μ 1 ;
[0064] (2)细胞培养：将96孔培养板放入37 °C 5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养；
[0065] (3)细胞转染：培养24h后，细胞生长到70-80%汇合度时，对每块96孔培养板同 时进行转染，每板均分为3组（miR-143转染组，对照组（阳性），空白组（阴性）），每组设 6个复孔，转染时用不含抗生素的培养基，转染后12h换成正常培养基；
[0066] (4)细胞呈色：分别在转染的0h、48h、72h检测荧光值，每孔加入终浓度为5mg/ mlMTT溶液20 μ 1，继续孵育4h后终止培养。用注射器小心吸弃孔内全部上清液，同时每孔 加入150 μ 1二甲基亚砜（DMSO)，轻微振荡lOmin，使结晶物充分溶解；
[0067] (5)比色：混匀后用酶标仪在波长490nm处测定各孔吸光值，对获得的数据进行统 计分析；通过比较过表达组与对照组的吸光值确定活细胞数（结果如图2所示）。
[0068] 实施例4.荧光Hoechst33342/PI双染检测miR-143对细胞凋亡影响
[0069] (1)固定培养的细胞消化后悬浮生长的细胞，lOOOrpm/min离心收集细胞，将 IO5-IO6个细胞悬浮于ImL培养基中，再加入IOyL Hoechst 33342染液，混匀，37°C孵育 5 ?15min ;
[0070] (2)细胞于4°C，500?1000rpm/min离心5min弃去上清液；
[0071] (3)加入I. OiriLBuffei* A工作液（用双蒸水将lOXBuffei* A稀释10倍）悬浮细 胞，加入5 μ L PI染液，室温避光放置5?15min后混匀；
[0072] 对空白组，转染组和对照组均进行上述操作；
[0073] (4)荧光显微镜观察：Heochst 33342用氪激光激发的紫外光，将产生荧光 (I -3, II -3, III-3)，而凋亡细胞将表现为更为明亮（II -3) ;PI用氩离子激光激发荧光， 死亡细胞产生荧光（I -2, II -2，III-2);结果如图3所示。
[0074] 实施例5.流式细胞术检测miR-143对细胞凋亡影响
[0075] 1.细胞样品的制备：
[0076] (1)用胰酶消化细胞，收集到5mL离心管中；
[0077] (2) 1000rpm/min 离心 5min，弃掉上清液；
[0078] (3)加入预冷的PBS ImL并悬浮细胞，然后离心，弃掉并留少许上清液重要悬浮细 胞；
[0079] 2.细胞固定：
[0080] 加入ImL冰浴预冷70%乙醇，轻轻吹打细胞以混匀，4°C过渡；
[0081] 3. PI 染色：
[0082] (1)将固定好的细胞1000rpm/min离心5min，弃掉上清液；
[0083] (2)加入冰浴预冷的PBS洗2次；
[0084] (3)在离心管中加入PI染料并轻轻混匀，37°C避光温浴30min ;
[0085] 4.流式检测与分析：
[0086] 用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采 用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析，结果如图4和5所示。
[0087] 实施例6. qRT-PCR检测凋亡相关标志基因表达
[0088] (1)总 RNA 提取及反转录：使用 TIANGEN 公司的 RNAsimple Total RNA Kit 总 RNA 提取试剂盒（Cat. #DP419)提取细胞组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行；将提取的 RNA 米用 TaKaRa 公司的 RrimeScript? RT reagent Kit (Cat. #RR037A)反转录合成 cDNA 第 一链，-20 °C保存备用。
[0089] (2)引物设计说明：根据羊抗凋亡基因 BCL2(NCBI登录号：JN036559. 1)和牛凋亡 基因 BAX(NCBI登录号：NM_173894. 1)序列设计引物，引物信息见如下表：
[0090]
【权利要求】
1. 一种与奶山羊乳腺上皮细胞凋亡相关的miRNA，其特征在于：该miRNA为miR-143， 其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于：其前体基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 权利要求1所述的miRNA在奶山羊育种中的应用，其特征在于，抑制基因序列如SEQ ID NO. 1所示序列在奶山羊体内的表达。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，抑制基因序列如SEQ ID NO. 2所示的前体 序列在奶山羊体内的表达。
【文档编号】A01K67/027GK104498497SQ201410757938
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】王建民, 纪志宾, 王桂芝 申请人:山东农业大学