一种检测山羊stat3基因单核苷酸多态性的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法及应用，以包含STAT3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2或P3为引物，PCR扩增山羊STAT3基因；用限制性内切酶DdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204位、第62058位或第62230位的单核苷酸多态性。3个位点能够作为提高西农萨能奶山羊体高的分子标记，1个位点作为提高海南黑山羊管围的分子标记，1个作为提高海南黑山羊体长指数的标记，这些有利于中国地方山羊生长性状的标记辅助选择（MAS），有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。
【专利说明】—种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法及应用。
【背景技术】
[0002]基因多态性(polymorphism)是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。在生物医学和动物生产实践中，基因多态性的检测及其应用具有重要意义。例如:研究人类某些重要功能基因多态性与疾病的易感性的关联，可阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性，为临床医学、遗传病学、预防医学的发展开拓了新的研究领域；研究动物某些基因多态并分析它们与生长发育、泌乳等生产性能的关系，将有利于标记辅助选择(MAS)技术为基础的分子育种。目前，基因多态性的主要形式是单核核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)。
[0003]SNP是由美国麻省理工学院人类基因组研究中心学者Lander (1996)提出的一类遗传标记系统，是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。 [0004]在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs (Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周边SNPs (Perigenic SNPs, pSNPs)和基因间 SNPs (Intergenic SNPs, iSNPs)等三类。研究表明，位于编码区内的cSNPs比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。近年来，研究人员对基因内含子SNP及其功能的关注度逐渐升高。由于内含子属于非编码序列，曾一度被认为“它的存在没有意义”，但随着功能基因组研究的深入，越来越多的研究发现，内含子并不是基因组的“垃圾”，而是在基因表达调控中具有重要的生物学功能。近年来，若干研究发现，内含子突变能够引起某些基因功能的重大改变，从而在动物生产实践中具有重要应用和推广价值，其中最著名的例子是“猪IGF2基因内含子突变”。胰岛素样生长因子2 (Insulin-like growthfactor2, IGF2)基因是欧洲科学家历时10年鉴定的一个影响家猪数量性状的呈印迹遗传的主效基因，位于该基因第3内含子3072位核苷酸的G/A替换，改变了顺式作用元件与阻抑蛋白的结合，提高了 30%IGF2在肌肉中的表达量，从而增加了肌肉产量，降低了背部脂肪沉积。IGF2基因第3内含子的G3072A突变对生长肥育性状的重要影响，在专门化父系的选育中具有重大应用价值。
[0005]此外，在原核生物基因中，不存在内含子或着含有少量的内含子，而在真核生物基因中内含子的存在是普遍现象，而且内含子的长度远远大于外显子的长度，甚至在人类基因组中非编码序列占到95%~97%。由此可见，随着生物进化程度越高，其内含子所含比例也越高，这也进一步说明内含子是具有生物学功能的。从生物进化角度讲，内含子也必定在生命活动中执行着某种功能。因此，目前关于内含子的研究会越来越多，关于内含子多态性及其应用功能正成为当前研究的热点。
[0006]由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs:即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段;AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。
[0007]在这种情况下，PCR-RFLP就成为检测SNP的理想技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求。
[0008]分子育种，即分子标记辅助育种(MolecularMark-Assist Selection, MAS),该技术是借助DNA分子标记对遗传资源`或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在羊育种中，人们期望通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在实际育种中获得更大的遗传进展。
[0009]为此，借助分子遗传标记辅助选择，即将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，将加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段:第一阶段是家畜各性状之间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。
[0010]信号转导及转录活化因子(signaltransducers and activators oftranscription; STAT)是一类脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白，由750~850个氨基酸组成，分子量为 84 ~113kDa (8.4X IO4 ~11.3 X IO4U)。作为 JAK (Janus Kinase)-STAT 途径中JAKs的重要底物，STATs在细胞因子(cytokine;CK)的信号转导中起着关键性的作用。截止目前，发现STATs由STAT3和其他6种STATs蛋白组成(如:STATl、STAT2、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6)。
[0011]STAT3是在1994年作为白细胞介素_6信号传递中的急性期反应因子(acute-phaseresponse factor;APRF)被纯化的。STAT3广泛表达于不同类型的细胞和组织中，对STAT3缺陷小鼠的研究显示STAT3在早期胚胎发育和骨髓细胞的分化中发挥着不可或缺的重要作用。此外，STAT3还参与了细胞生长、分化、增生、恶性转化及凋亡抑制等生理功能的调控。组织特异性的基因敲除结果表明，STAT3对于上皮细胞的凋亡，哺乳后期乳腺的发育、皮肤重建、角质细胞迁移、巨噬细胞失活与Th细胞反应中的炎性因子下调等都具有重要的调控作用。总之，STAT3在胚胎早期发育、细胞分化、哺乳后期乳腺的发育等方面具有很重要的作用，因此，研究中国地方羊STAT3基因的遗传变异和分子遗传特征具有重要的理论和实践意义。然而，目前对于STAT3基因的研究多集中在小鼠和人类上，并主要对其功能进行了大量研究。对中国地方山羊STAT3基因遗传变异领域的研究匮乏该基因位点的功能研究更是空白。
【发明内容】
[0012]本发明解决的问题在于利用Ddel、RsaI和TaqI Forced-PCR-RFLP方法检测山羊STAT3基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。
[0013]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0014]一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，以包含STAT3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对PI为引物，PCR扩增山羊STAT3基因；用限制性内切酶Dde I消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204位的单核苷酸多态性；
`[0015]以引物对P2为引物，用限制性内切酶RsaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058位的单核苷酸多态性；
[0016]以引物对P3为引物，用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230位的单核苷酸多态性；
[0017]所述的引物对Pl为:
[0018]上游引物:tgtgtgagtgtgtaggtttc agaat ；
[0019]下游引物:agataggtta ttaattaatc aactga ；
[0020]所述的引物对P2为
[0021]上游引物:aaatccagcc tgagggagaa ttcct ；
[0022]下游引物:gagtctcttt gaaagtccac tttgta ；
[0023]所述的引物对P3为:
[0024]上游引物:tgggaaagatacttgctg ；
[0025]下游引物:gacctgaatc acaggaggaa aagatc。[0026]所述的PCR扩增反应程序为:
[0027]94.(TC，预变性 5min ；94.0°C，变性 30s ；50.8°C复性 30s ；72.(TC延伸 60s，35个循环之后72.(TC延伸10min，4.(TC保存扩增产物。
[0028]所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度3%琼脂糖凝胶电泳。
[0029]根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204nt的单核苷酸多态性为:CC基因型表现为264bp和26bp两条条带；CT基因型表现为290bp、264bp和26bp三条条带；TT基因型表现为290bp —条条带；
[0030]根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058nt的单核苷酸多态性为:GG基因型表现为222bp、97bp和25bp三条条带；AG基因型表现为222bp、122bp、97bp和25bp四条条带；AA基因型表现为222bp和122bp两条条带；
[0031]根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230nt的单核苷酸多态性为:CC基因型表现为233bp、126bp和27bp三条条带；CT基因型表现为260bp、233bp、126bp和27bp四条条带；TT基因型表现为260bp和126bp两条条带。
[0032]山羊STAT3基因的45204位的CC基因型、62058位的AA基因型、62230位的TT基因型作为西农萨能奶山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。
[0033]所述的DNA标记是作为提高西农萨能奶山羊的体高的分子标记。
[0034]山羊STAT3基因的45204位的CC和CT基因型、62058位的AA和GG基因型，作为海南黑山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。
[0035]所述的45204位的CC和CT基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的管围的分子
己 O
[0036]所述的62058位的AA和GG基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的体长指数的分子标记。
[0037]与现有技术比较，本发明具有以下有益的技术效果:
[0038]本发明根据STAT3基因的序列设计引物，分别以2种山羊品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后获得山羊的STAT3基因的部分序列。
[0039]针对STAT3基因第45204,62058及62230位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过特定引物经PCR扩增含特定限制性内切酶位点的片段再酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其单核苷酸的多态性。
[0040]本发明对2个山羊品种的SNPs基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNPs位点与山羊部分生长性状(如体高、管围和体长指数)进行关联分析，结果表明，3个SNP位点能够作为提高西农萨能奶山羊体高的分子标记，I个位点可以作为提高海南黑山羊管围的分子标记，I个可以作为提高海南黑山羊体长指数的标记，这些有利于中国地方山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)，有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为山羊STAT3基因扩增包含第45204位多态位点的PCR产物电泳结果；
[0042]图2为山羊STAT3基因第45204位SNP的测序图。带框的字母g表示该位点发生突变:AC_000176:g.45204C>T。
[0043]图3为山羊STAT3基因包含第45204位的多态位点的290bp PCR产物的DdeI酶切电泳结果；
[0044]图4为山羊STAT3基因扩增包含第62058位多态位点的PCR产物电泳结果；
[0045]图5为山羊STAT3基因第62058位SNP的测序图。带框的字母
【权利要求】
1.一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含STAT3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对PI为引物，PCR扩增山羊STAT3基因；用限制性内切酶DdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204位的单核苷酸多态性； 以引物对P2为引物，用限制性内切酶RsaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058位的单核苷酸多态性； 以引物对P3为引物，用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230位的单核苷酸多态性； 所述的引物对Pl为: 上游引物:tgtgtgagtg tgtaggtttc agaat ； 下游引物:agataggtta ttaattaatc aactga ； 所述的引物对P2为 上游引物:aaatccagcc tgagggagaa ttcct ； 下游引物:gagtctcttt gaaagtccac tttgta ； 所述的引物对P3为: 上游引物:tgggaaagat `acttgctg ； 下游引物:gacctgaatc acaggaggaa aagatc。
2.如权利要求1所述的检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为:
94.(TC，预变性 5min ；94.0°C，变性 30s ；50.8°C复性 30s ；72.(TC延伸 60s，35 个循环之后72.(TC延伸10min，4.(TC保存扩增产物。
3.如权利要求1所述的检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度3%琼脂糖凝胶电泳。
4.如权利要求1所述的检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204nt的单核苷酸多态性为:CC基因型表现为264bp和26bp两条条带；CT基因型表现为290bp、264bp和26bp三条条带；TT基因型表现为290bp —条条带； 根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058nt的单核苷酸多态性为:GG基因型表现为222bp、97bp和25bp三条条带；AG基因型表现为222bp、122bp、97bp和25bp四条条带；AA基因型表现为222bp和122bp两条条带； 根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230nt的单核苷酸多态性为:CC基因型表现为233bp、126bp和27bp三条条带；CT基因型表现为260bp、233bp、126bp和27bp四条条带；TT基因型表现为260bp和126bp两条条带。
5.山羊STAT3基因的45204位的CC基因型、62058位的AA基因型、62230位的TT基因型，作为西农萨能奶山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的DNA标记是作为提高西农萨能奶山羊的体闻的分子标记。
7.山羊STAT3基因的45204位的CC和CT基因型、62058位的AA和GG基因型，作为海南黑山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的45204位的CC和CT基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的管围的分子标记。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的62058位的AA和GG基因型DNA标记是作为提高海南 黑山羊的体长指数的分子标记。
【文档编号】C12Q1/68GK103866032SQ201410130751
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】潘传英, 贾文超, 蓝贤勇, 陈宏 , 雷初朝, 徐铁山 申请人:西北农林科技大学