本发明涉及植物培养繁殖技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰培养繁殖方法。
背景技术：
蝴蝶兰是当前国际花坛的名花，属于兰科蝴蝶兰属植物，原产地主要是亚热带、热带，天然分布在大洋洲、亚洲。蝴蝶兰具有观赏期长、色泽丰富、花色秀丽以及体态优美轻盈等特点，也被人们称为“洋兰皇后”，在兰科植物中是一种最普及、最广泛的栽培种类，具有很高的商业价值，是国际四大观赏热带兰的一种。蝴蝶兰是单茎性气生兰，侧枝发育非常少，因此很难常规进行分株繁殖，而且很少形成种子，种子发育也比较困难，基本上在自然条件下萌发的难度比较大，因此蝴蝶兰高效繁殖的主要手段就是组织培养。国外一些发达国家采用工厂化育苗技术以及组织培养快繁技术，不仅可以创造巨大的经济效益，同时也培育了很多优良品种，然而我国关于蝴蝶兰组织培养的快繁技术研究仍然处于初级阶段，在很大程度上阻碍了蝴蝶兰的规模化生产。同时越来越多的蝴蝶兰应用于切花之中，这就急需要一种快速培养繁殖的方法，从而推动蝴蝶兰商业性发展。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种培养繁殖快、成苗率高的蝴蝶兰培养繁殖方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种蝴蝶兰培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的蝴蝶兰，挑选植株中外形呈笋状、花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体；
(2)材料消毒：将外植体放置在洗洁精水中浸泡10min进行预处理，然后用自来水冲洗30min，冲洗后用无菌滤纸吸干外植体上的水珠，然后用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2～3遍，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液浸泡外植体，浸泡时间为10min，浸泡后用无菌水冲洗3～4遍，剥去苞片，用质量分数为0.1％的氯化汞溶液浸泡外植体，浸泡时间为8min，浸泡后用无菌水冲洗3～4遍；
(3)诱导培养：切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行预培养，培养时间为22～25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，培养温度均为23～25℃，光培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；所述诱导培养基为：1/2MS+1～3mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L TDZ+0.1～0.3mg/L NAA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉胶；预培养后，再将培养材料整体移入新的诱导培养基中继续培养，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
(4)增殖继代培养：将诱导培养后的外植体放入增殖培养基中继续培养，所述增殖培养基为：1/2MS+2.5～3.5mg/L 6-BA+0.2～0.4mg/L NAA+0.1～0.3mg/L TDZ+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉胶+8～12％椰汁，培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
(5)壮苗培养：增殖继代培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：1/2MS+2.5～3.5mg/L6-BA+0.4～0.6mg/L NAA+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉胶+8～12％香蕉汁，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；培养时间结束后，再向壮苗培养基中加入0.3％活性炭，培养温度27～29℃，光照时间为15h/d，光照强度为2500～3000lx；
(6)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
如上所述的一种蝴蝶兰培养繁殖方法，进一步说明为，所述诱导培养基为：1/2MS+2mg/L 6-BA+1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3+25g/L白砂糖+7g/L卡拉胶。
如上所述的一种蝴蝶兰培养繁殖方法，进一步说明为，所述增殖培养基为：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+0.2mg/L TDZ+25g/L白砂糖+7g/L卡拉胶+10％椰汁。
如上所述的一种蝴蝶兰培养繁殖方法，进一步说明为，所述壮苗培养基为：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L白砂糖+7g/L卡拉胶+10％香蕉汁。
本发明的有益效果是：通过本发明能对蝴蝶兰进行快速培养繁殖，并且培养后的蝴蝶兰苗株发病率低，成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养蝴蝶兰提供了技术支持，同时满足了蝴蝶兰切花市场的需要。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做进一步的阐述。
本发明提供的一种蝴蝶兰培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的蝴蝶兰，挑选植株中外形呈笋状、花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体；
我们将花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗选为样本1，将花苞和分叉完全未露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗作为样本2，将花苞和分叉完全露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗作为样本3，分别取样本上不同部位的花梗芽做外植体，放置在普通诱导培养基上进行诱导培养试验；
表1为不同样本对花梗芽的诱导影响
由表1可以看出，不同样本上的花梗芽诱导率存在明显差异，样本1的花梗芽生产力强，其枯死率都很低，且成活率和诱导率最高，最适合做外植体诱导材料；样本2诱导转化难，枯死率都很高，且成活率和诱导率都很低，不适合做外植体诱导材料；样本3中随着花梗侧芽和花朵的生长，培养基中的营养逐渐转移到花梗上部的分叉和花朵上，花梗上的花梗芽生长势弱，枯死率高，且成活率和诱导率低，也不适合做诱导材料；
从表1中还可以看出，同一样本中花梗上不同节位的花梗芽诱导也不相同，基部成熟节位的花梗芽大多比较瘦弱，生长力弱，枯死率较高，诱导率较低；上部幼嫩节位的花梗芽虽然相比基部的花梗芽成活率高，但幼嫩花梗抽生的新芽大都细长，芽体瘦弱，尾部常发生枯死；中部节位的花梗芽，生长力强，枯死率较低，诱导率高，是最好的诱导材料；故挑选植株中外形呈笋状、花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗，切取花梗中部节位上的花梗芽作为外植体，能有效提高生产率。
(2)材料消毒：将外植体放置在洗洁精水中浸泡10min进行预处理，然后用自来水冲洗30min，冲洗后用无菌滤纸吸干外植体上的水珠，然后用体积分数为75％的酒精棉球擦拭外植体表面，用灭菌水清洗2～3遍，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液浸泡外植体，浸泡时间为10min，浸泡后用无菌水冲洗3～4遍，剥去苞片，用质量分数为0.1％的氯化汞溶液浸泡外植体，浸泡时间为8min，浸泡后用无菌水冲洗3～4遍；采用氯化汞溶液分两次消毒，并且两次消毒的氯化汞溶液浓度不同，这样可以能较好起到灭菌作用的同时而又对其活性影响较小；
表2为不同质量分数的氯化汞溶液及操作次数对花梗芽的诱导影响
由表2可以看出采用氯化汞溶液分两次消毒，其污染率低，且消毒后花梗芽的成活率高，初次采用质量分数为0.2％的氯化汞溶液浸泡外植体，能有效杀灭大部分细菌，使外植体得到有效保护，无菌水冲洗后，剥去苞片，在用质量分数为0.1％的氯化汞溶液浸泡外植体，保护外植体活性的同时，进一步进行杀菌。
(3)诱导培养：切除消毒后外植体的两端切口，将外植体接种在诱导培养基中进行预培养，培养时间为22～25d，前10天为暗培养，剩余时间为光培养，通过一段时间的暗培养，能一定程度上有效抑制褐化现象，培养温度均为23～25℃，光培养时，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；所述诱导培养基为：1/2MS+1～3mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L TDZ+0.1～0.3mg/L NAA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉胶，通过加入VC和GA3，能有效遏制培养材料的褐化；预培养后，再将培养材料整体移入新的诱导培养基中继续培养，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
表3为诱导培养基成分及用量
作为优选，所述诱导培养基为：1/2MS+2mg/L 6-BA+1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3+25g/L白砂糖+7g/L卡拉胶，即为表3中诱导培养基1的成分及用量；
表4为外植体褐化程度和暗处理之间的试验关系，将外植体接种在表3中诱导培养基1上进行培养
由表4可知，随着时间的推移，经过不同处理都会有一定的褐化现象，但是经过暗培养后，褐化率能降低，由此可知，暗培养能在一定程度上抑制褐化现象的发生。
(4)增殖继代培养：将诱导培养后的外植体放入增殖培养基中继续培养，所述增殖培养基为：1/2MS+2.5～3.5mg/L 6-BA+0.2～0.4mg/L NAA+0.1～0.3mg/L TDZ+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉胶+8～12％椰汁，培养条件：培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；
表5为增殖培养基成分及用量
作为优选，所述增殖培养基为：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+0.2mg/L TDZ+25g/L白砂糖+7g/L卡拉胶+10％椰汁，即为表5中增殖培养基1的成分及用量，采用1/2MS培养基，适当降低了大量元素浓度，更有利于提高蝴蝶兰花梗芽的诱导增殖率。
(5)壮苗培养：增殖继代培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：1/2MS+2.5～3.5mg/L6-BA+0.4～0.6mg/L NAA+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉胶+8～12％香蕉汁，培养时间为15～20d，培养温度23～25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000～2500lx；培养时间结束后，再向壮苗培养基中加入0.3％活性炭，培养温度27～29℃，光照时间为15h/d，光照强度为2500～3000lx；
表6为壮苗培养基成分及用量
作为优选，所述壮苗培养基为：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L白砂糖+7g/L卡拉胶+10％香蕉汁，即为表6中壮苗培养基1的成分及用量。
(6)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。通过本发明能对蝴蝶兰进行快速培养繁殖，并且培养后的蝴蝶兰苗株发病率低，成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养蝴蝶兰提供了技术支持，同时满足了蝴蝶兰切花市场的需要。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。