一种乌龙头快速繁殖的方法与流程

本发明属于植物生物技术领域，具体为一种乌龙头快速繁殖的方法。

背景技术：

乌龙头又称“刺龙牙”、“木龙头”、“树头菜”等，为五加科楤木属的多年生落叶灌木或小乔木，是山林地区所产的药、菜两用的名贵野菜。乌龙头的鲜嫩芽含有丰富的营养成分，富含人体所需的多种氨基酸和大量的钙、磷、铁、锌、镁、钠等矿质元素。乌龙头的干燥根皮、茎皮及叶均可入药，具很高的药用价值，主要的有效成分是皂苷。具有补气、活血、止痛、祛风、利湿、利尿、消肿之功效。长期食用可调节神经、强身健体、延年益寿。随着人们生活水平的不断提高，绿色食品越来越受到人们的关注，被誉为“山野菜之王”的乌龙头自然越来越受到人们的青睐，市场需求量与日俱增。随着人们肆无忌惮的采集和破坏，野生资源已经日渐枯竭。

为保护乌龙头野生资源、满足市场需求，解决乌龙头的快速繁殖势在必行。所以，具有繁殖速度快、周期短、可以规模化生产等优点的植物组织培养技术是乌龙头快速繁殖的一条有效且重要的途径。楤木植物组织培养过程中可通过茎段的休眠腋芽诱导成不定芽，再诱导不定芽进行生根成苗；也可使外植体先诱导出愈伤，再形成胚状体，最后由诱导的胚状体分化成苗。休眠腋芽途径获得的幼苗数量较少，受外植体取材限制，且小苗成活率低。因此探究外植体诱导愈伤，进一步诱导形成胚状体，最后分化为幼苗的关键技术，是实现乌龙头大量繁殖的关键。

技术实现要素：

本发明旨在建立诱导乌龙头外植体成为愈伤、诱导愈伤形成胚状体、诱导胚状体分化成苗、诱导幼苗生根四个环节的整个快繁体系，研究乌龙头组织培育苗技术，着重研究新型植物生长调节剂和抗褐化剂对乌龙头愈伤形成胚状体的影响和胚状体分化成苗的影响，建立起乌龙头幼苗的高效繁殖体系，有效的保护环境资源，并为地方农业经济的发展起到推动作用。

本发明一种乌龙头快速繁殖方法，具体步骤为：

（1）外植体诱导出愈伤：将表面消毒的乌龙头嫩茎与幼叶接种至外植体脱分化培养基上，培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天，愈伤诱导率为100%；所述脱分化的培养基为MS+2,4-D 1.5 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L；pH5.8。

（2）愈伤组织诱导分化成胚状体：将步骤（1）获得的愈伤组织转至诱导愈伤组织分化为胚状体培养基上，培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天，继代三次，每次45天，第三次胚状体增殖系数11.337；所述诱导愈伤组织分化为胚状体培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L；pH5.8。

（3）胚状体诱导分化为幼苗：将步骤（2）获得的胚状体转至胚状体分化成苗培养基上，培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天，培养60天，苗分化倍数3.889；所述胚状体分化成苗培养基为MS+ ZT(玉米素)1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30g/L+活性炭2 g/L；pH5.8。

（4）诱导生根壮苗：将步骤（3）获得的小苗转至生根壮苗培养基上，培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天，培养45天，生根率98.6%,平均根长11.5cm，平均主根数3.2条；所述生根壮苗培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L；pH5.8。

本发明通过组织培养中四个环节（外植体诱导出愈伤、愈伤组织诱导分化成胚状体、胚状体诱导分化为健壮小苗、小苗诱导生根）培养基的设计，在愈伤组织形成生根小苗的3个环节中添加了抗褐化剂成分，在胚状体诱导分化为健壮小苗添加了新的激素成分，从而实现乌龙头的快速繁殖。

本发明方法的优点：本发明方法使用的外植体为乌龙头幼叶与嫩茎，愈伤诱导率高，愈伤品质好，不易褐化；易诱导胚状体分化且胚状体增殖率高，胚状体易分化为幼苗，畸形率较低，幼苗健壮，根系发达。

本发明方法使用四种培养基所用成分均为常规培养基成分，材料易寻找，成本低。

附图说明

图1为外植体在脱分化培养基上诱导出的愈伤组织；

图2为诱导愈伤分化为胚状体培养基上的胚状体；

图3为诱导胚状体成苗培养基上的幼苗；

图4为诱导生根壮苗培养基上的幼苗。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

所用试剂采购厂家分别为：1/2MS粉末：上海宇涵生物科技有限公司；NAA：北京康倍斯科技有限公司；6-BA：北京康倍斯科技有限公司；ZT:南京奥多福尼生物科技有限公司;蔗糖：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；琼脂：北京康倍斯科技有限公司；活性炭：北京康倍斯科技有限公司。

【实施例1】利用乌龙头的幼叶与嫩茎建立起乌龙头幼苗的高效繁殖体系

1、准备四种培养基：

外植体脱分化培养基（A）MS+2, 4-D 1.5 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L；pH 5.8。诱导愈伤组织分化为胚状体培养基（B）MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L；pH5.8。胚状体分化成苗培养基（C）MS+ZT 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L；pH5.8。生根壮苗培养基（D）1/2MS+NAA 0.1 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L；pH5.8。

2、准备外植体：准备生长健康、初春刚发芽展开的两年生的幼叶与嫩茎，备用。

3、外植体诱导愈伤：

外植体脱分化培养基制备（以一升为例）：取900 ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7 g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30 g和 MS 4.74 g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂2，4-D 1.5 mg；定容到1 L，调节pH为5.8。分装到果酱瓶中，装量为30 ml/瓶。

外植体脱分化：嫩茎与幼叶接入愈伤诱导培养基时，将幼叶剪切为0.5cm2左右，将嫩茎剪切为0.5cm左右茎段。分别接入培养基，25天嫩茎完全愈伤化，60天幼叶完全愈伤化。培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天。记录愈伤生长状况，测量愈伤块体积并计算愈伤增殖量，愈伤诱导率100%，每块愈伤组织增殖1 cm左右。（如图1）

4、诱导愈伤组织分化胚状体：

诱导愈伤组织分化为胚状体培养基制备（以一升为例）：取900 ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7 g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30 g和 MS 4.74 g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂6-BA 0.5 mg和NAA 0.4 mg，搅拌均匀后加入2 g活性炭；定容到1 L，调节pH为5.8。分装到果酱瓶中，装量为30 ml/瓶。

愈伤组织分化为胚状体并诱导胚状体增殖：转入诱导愈伤组织分化胚状体培养基时，将愈伤组织切割为0.5 cm3左右小块，均匀接入培养基表面，每瓶接种三块。继代三次，每次继代45天。培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天。记录每次继代后的胚状体诱导状况，并记录第三次继代胚状体测量体积并计算增殖系数，胚状体增殖11.337倍。（如图2）

5、诱导胚状体分化幼苗：

诱导胚状体分化幼苗培养基制备（以一升为例）：取900 ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7 g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30 g和 MS 4.74 g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂ZT 1 mg和NAA 0.05 mg，搅拌均匀后加入2 g活性炭；定容到1 L，调节pH为5.8。分装到果酱瓶中，装量为30 ml/瓶。

胚状体分化为幼苗：转入诱导胚状体分化为幼苗的培养基时，将多个鱼雷期胚状体连同与其相连接的少量愈伤组织或子叶前期胚状体均匀接入培养基表面。培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天。诱导60天，记录统计分化成的健康幼苗数量并计算分化率，苗分化倍数为3.889倍。（如图3）

6、诱导生根壮苗：

诱导胚状体分化幼苗培养基制备（以一升为例）：取900 ml左右蒸馏水加热，当有小气泡出现时，加入7 g琼脂，搅拌均匀，溶解完全后，再加入蔗糖30 g和 1/2MS 2.47 g，搅拌至溶解完全，加入植物生长调节剂NAA 0.1 mg，搅拌均匀后加入2 g活性炭；定容到1 L，调节pH为5.8。分装到果酱瓶中，装量为30 ml/瓶。

幼苗生根壮苗：转入生根壮苗培养基时，将过于幼小的苗和根系纤弱的苗接入培养基。培养条件25℃，光照2000Lx，12小时/天。培养45天，记录生根苗数和苗株的根长、主根数并计算生根率，生根率98.6 %，平均根长11.5 cm，平均主根数3.2条（如图4）。