一种苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法与流程

本发明涉及农业
技术领域：
，更具体地，涉及一种苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法。
背景技术：
：花生黑腐病(Cylindrocladiumblackrotofpeanut，简称CBR)是一种严重影响花生生产的重要病害。花生黑腐病菌侵染花生地下组织果针、茎基部、根系和果荚等，侵染部位感病后变黑腐烂，发病严重时，植株所有叶片表现出萎焉甚至枯萎症状，最后整个植株枯萎死亡。迄今为止，国外报道发生花生黑腐病的国家有美国、巴西、日本、韩国、朝鲜、印度、伊朗、喀麦隆、澳大利亚等。2009年，我国广东首次发现花生黑腐病，随后，福建、江西均报道发生此病害。抗病品种培育是花生黑腐病防治研究的重点之一。田间自然诱发鉴定和温室人工接种鉴定是目前花生品种抗性鉴定的两种有效方法。田间自然诱发是将试验设立在田间发病区，并在利于病害流行的自然条件下进行。该方法的优点是能够真实地反映品种对病害的田间抗性表现。然而，田间影响花生黑腐病发生的因素有很多，如土壤中微菌核数量、土壤肥沃程度、气候条件等，因此该方法的结果稳定性不高，试验重复性较差；温室人工接种抗性鉴定，是在温湿度、光照皆可控的温室中通过人工接种进行抗性鉴定，由于条件可控，此方法能克服田间自然诱发抗性鉴定结果重复性差的缺点。花生黑腐病抗性鉴定人工接种方法主要有分生孢子悬浮液灌根法、微菌核或麦粒菌种拌土接种法。2008年，Dong运用微菌核拌土接种法进行花生黑腐病抗性鉴定，研究了微菌核大小、每克土壤的微菌核数量这两个因素对抗性鉴定的影响，结果表明，在浓度为5个/g和10个/g，250mm≦微菌核<425mm时，抗病品种Georgia-02C的根茎腐烂严重，并未表现出抗病性。2011年，邓巧文比较了分生孢子灌根、微菌核拌土和麦粒菌种拌土三种接种方法的效果，结果发现麦粒菌种拌土接种法简单、方便、效果好，接种35天后即可得出实验结果。对于花生黑腐病的防治，目前较好的办法是选育抗病品种。由于此病害在我国近几年才发现，病害相关基础研究比较薄弱，对现有花生品种及种质资源的抗性评价尚无系统研究。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法。本发明的第二个目的是提供上述方法在花生育种中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法，是采用0.5～5％的花生黑腐病菌菌丝悬浮液浸泡花生幼芽，浸泡一段时间后保湿2d再进行水培培养。研究发现花生黑腐病菌菌丝悬浮液浸泡后保湿对于花生黑腐病菌的浸染十分重要，因此，在对种子抗性进行鉴定时，需要在浸泡花生幼芽后，进行一段时间的保湿，再进行水培培养，可大大提高苗期花生抗性品种的鉴定效率和准确率。我国花生类型划分为普通型、珍珠豆型、多粒型、龙生型和中间型五类，而国外分为西班牙型、弗吉尼亚型、瓦伦西亚型。国外学者的研究表明，西班牙型(相当于我国珍珠豆型)花生对花生黑腐病抗性最强，弗吉尼亚型(相当于我国普通型)花生抗性其次，而瓦伦西亚型(相当于我国多粒型)花生最感病(Belletal.,1973；Hammonsetal.,1979)。本研究的结果表明，高抗花生黑腐病的品种或材料严重缺乏，在128份材料中表现高抗的材料只有1个，即属于普通型的T09，表现中等抗性的材料多为珍珠豆型，而表现高感的品种既有多粒型的桂花35号，也有珍珠豆型的P562，因此花生品种对黑腐病的抗性与其所属类型并无直接相关性。本发明所述水培培养是常规的培养技术，优选地，是在25℃光照培养室内培养，每隔3天换1次水，10d后即可拔出植株，根据植株的发病情况进行鉴定。本发明在花生幼苗中加入黑腐病菌菌丝悬浮液后，浸泡时间对于花生黑腐病菌的浸染效果没有显著差异，一般浸泡10～30min为宜。优选地，所述花生幼芽是通过将花生种子浸湿，并于30℃暗黑培养2d获得的胚根1～2cm长的幼芽。更优选地，上述方法中，所述花生黑腐病菌菌丝悬浮液的浓度为0.5～1％；最优选地，所述花生黑腐病菌菌丝悬浮液的浓度为0.5％。本发明还提供所述苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法在花生育种研究的抗性鉴定中的应用；优选地，是利用所述苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法对花生育种材料作批量筛选中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种苗期鉴定花生黑腐病抗性品种的方法，是采用0.5～5％的花生黑腐病菌菌丝悬浮液浸泡花生幼芽，浸泡一段时间后保湿2d再进行水培培养，即采用室内接种鉴定的方法，苗期即可鉴定花生品种的抗性。该方法简便、高效，所得结果稳定性好、重复性高，可为花生黑腐病抗病育种及品种的田间应用提供理论依据。附图说明图1为花生黑腐病0～5级根腐症状。图2为T09的抗病性表现；其中a～c为接种处理；d为对照；e为对照与接种比较；f为对照根系；g为接种处理根系。图3为P562的抗病性表现：其中a～c为接种处理；d为对照；e为对照根系；f为接种处理根系。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1以扶余四粒红花生品种(购自吉林省扶余县三井子镇邢库宝花生购销部)为材料，进行接种条件试验。具体如下：1、菌丝悬浮液制备将4℃保存的花生黑腐病菌接种于PDA培养基平板上，于25℃恒温培养箱中培养5d。用直径为1cm的打孔器切取10块菌丝块，放入装有150mLPD培养液的300mL锥形瓶中，置于25℃、180r/min的恒温摇床中振荡培养5d。用灭菌后的四层纱布过滤菌液，挑出残留琼脂块，刮取纱布上的菌丝，将菌丝置于无菌滤纸上挤压吸干水分，称取5.0g菌丝加入95mL4℃无菌水中，匀浆2min。对匀浆后的菌丝悬浮液进行镜检，确保显微镜视野范围内无1mm以上的菌丝段；菌丝悬浮液现配现用。2、花生种子催芽选取健康饱满、无病虫的花生种子50～60粒，用自来水冲洗干净，放入培养皿中，加水没过花生种子，将培养皿放入30℃恒温箱中暗黑催芽2d；每隔12h换一次水，每次换水用自来水冲洗3次以上。选取萌发正常、胚根1～2cm长的幼芽，备用。3、接种条件的选定采用菌丝悬浮液浸泡幼芽接种的方法进行试验。接种菌丝悬浮液的浓度设5％、3％、1％(质量/体积，即每100mL水中含有的菌丝的克数)共3个浓度梯度，以无菌水为对照；浸泡时间设10min、20min和30min三种处理；接种后处理设直接插入水培棉(直接水培处理)和保湿2d后插入水培棉培养两种处理。每处理3次重复，每个重复5株。将插有接种幼芽的水培棉放入盛满水的托盘中，于25℃光照培养室中培养，每隔3天换1次水，10d后拔出植株，对照分级标准观察每株花生的根部，记录根腐等级及发病株数，计算病情指数，比较不同接种条件的接种效果，选定接种浸泡时间及接种后处理方法。4、分级标准描述如下：0级：没有症状；1级：茎基部轻微变褐；2级：茎基部变黑，主根变黑长度小于50％；3级：茎基部变黑，主根变黑长度大于50％，有少许次生根存在；4级：主根完全变黑并开始腐烂，次生根腐烂掉落；5级：主根完全变黑腐烂，植株萎蔫甚至死亡。花生品种抗性快速鉴定标准以病情指数等级为基础。病情指数＝∑(各级发病株数×各级代表数值)/(调查总数×最高病情级数)×100免疫：病情指数＝0。高抗：0<病情指数≦10。中抗：10<病情指数≦20。中感：20<病情指数≦30。高感：病情指数>30。扶余四粒红花生品种在供试的3个菌丝悬浮液接种浓度、3个浸泡处理时间下，浸泡接种后保湿2d的平均发病率和病情指数均高于浸泡接种后直接水培处理。说明菌丝悬浮液浸泡后保湿对于花生黑腐病菌的侵染十分重要(表1)。接种浓度和浸泡时间病情指数的双因素方差分析结果表明(见表2、表3)，在接种后保湿2d水培的情况下，不同浸泡时间之间的差异不显著，而接种浓度之间的差异显著；在接种后直接水培的情况下，不同浸泡接种时间之间的差异不显著，接种浓度之间的差异也不显著。两种处理方法的浸泡接种时间之间差异均不显著，说明供试的浸泡接种时间对花生品种病情指数无明显影响，因此，品种抗性鉴定以接种后保湿2d水培法较好，浸泡接种时间以10min为宜。表1扶余四粒红在不同接种条件的发病情况注：表中的发病率和病情指数均为3次重复的均值。表2接种后保湿2天水培的病情指数双因素方差分析差异来源SSdfMSFP-valueF0.05时间19.3688929.6844441.9901820.2512326.944272浓度171.3089285.6544417.602240.010416.944272误差19.4644444.866111总计210.14228表3接种后直接水培的病情指数双因素方差分析差异来源SSdfMSFP-valueF0.05时间16.3488928.1744440.1463570.8682736.944272浓度6.29555623.1477780.0563580.9459376.944272误差223.4111455.85278总计246.05568采用菌丝悬浮液浸泡幼芽接种法，设定浸泡接种时间为10min，接种后保湿2d再水培，设置1％、0.5％和0.1％三个接种浓度，比较不同接种浓度的病情指数，选定品种抗性评价试验的接种浓度。结果表明，随着接种浓度的升高，病情指数相应升高，但是均大于30，对品种抗性等级划分影响不大(见表4)。浓度单因素方差分析结果表明，3个接种浓度之间差异显著(F＝12.11>F0.05)(见表5)，说明不同接种浓度对病情指数有较明显影响。为保证接种效果，同时使接种菌量尽量接近自然水平，选择0.5％为品种抗性评价的接种浓度。表4扶余四粒红在不同接种浓度下的发病情况接种浓度(％)发病率(％)病情指数0000.110033.30.510045.3110056注：表中的发病率和病情指数均为3次重复的均值，浸泡时间为10min，接种后处理为保湿2d水培。表5不同接种浓度的病情指数方差分析实施例2以128个花生品种(由仲恺农业工程学院郑奕雄教授提供，具体见表6)为材料，接种菌丝悬浮液浓度为0.5％(质量/体积)，浸泡时间为10min，以无菌水为对照，进行品种抗病性评价。每个品种3次重复，每个重复10株。浸泡接种后将花生幼芽放入垫有双层湿纱布的托盘中，用双层湿纱布覆盖，于25℃恒温保湿2d后再将花生幼芽插入水培绵中，置于25℃光照培养室中培养。10d后拔出植株，对照分级标准观察根部，记录根腐等级及发病株数，计算病情指数，评价供试品种或材料的抗病性。128个供试品种或材料的平均根腐等级、发病率、病情指数统计结果如表6所示。表6的结果表明，128个供试品种或材料中，病情指数大于30的品种有72个，病情指数为20～30的品种有42个，病情指数为10～20品种有13个，病情指数为0～10的品种有1个，病情指数为零的品种为0个。也就是说，128个花生品种对花生黑腐病表现免疫、高抗、中抗、中感、高感的品种分别有0个、1个、13个、42个和72个，分别占供试花生品种的0％、0.8％、10.2％、32.7％和56.3％。其中，T09的病情指数最低，为8.0，发病率为36.7％，在128个供试品种或材料中最抗病(图2)；P562的病情指数最高，为46.0，发病率100％，在128个供试品种或材料中最感病(图3)。表6128个花生品种或材料的病情统计续表6(1)品种或材料发病率(％)病情指数品种或材料发病率(％)病情指数湛秋4810038.6±0.33abS6583.320.0±0.0cd湛油1510038.7±0.46abZ5596.728.6±0.29cZR0210035.2±0.43bH1610029.0±0.49cb兆花油1号10038.5±0.26abZH1610033.3±1.22b大湾种10034.4±0.49bM185012.0±0.30d贺油1510034.6±0.48bM2196.622.6±0.81c龙花1810031.0±0.46bML2383.320.6±0.36cG6910029.7±0.35cbZK0910037.6±0.46bG9910038.0±0.29ab怀集大果10032.0±0.90bG12710029.6±0.23cbAS0987.720.0±0.31dG2679536.0±0.40bBS383.319.3±0.12dG40310033.5±0.55bDR110020.7±0.55cdG42110036.0±0.23bG10610021.3±0.40cG83610038.5±0.20abG7719022.0±0.32cGH0210035.0±0.40bG83310023.3±0.69cGH1010031.0±0.25bGH112710022.7±0.56cGH1210033.8±0.58bGR9510028.7±0.87cGH1510035.0±0.67bGR16610024.0±0.87cGH140910039.0±0.32abH2210030.0±0.32bH1710038.5±0.26abHB110025.3±0.46cH2110040.0±0.28aHB210026.0±0.75cH2310042.1±0.40aHG12673.317.3±0.55dH12610038.0±0.65abKQ2910025.7±0.61c续表6(2)品种或材料发病率(％)病情指数品种或材料发病率(％)病情指数H71610035.0±0.55bM1010027.3±0.75cHC110036.9±0.32bM101210032.0±0.61bJ0210037.7±0.45bP55993.321.3±0.75cJG0810038.0±0.20abQ0710022.0±0.61cL10610040.0±0.28aQ0810029.3±0.25cbLYX10035.3±0.37bQ50993.319.3±0.45dQ5068222.7±1.08cZ4110031.3±0.17bQ64610026.0±0.36cZ9310020.0±0.80dS18810040.0±0.51aZK0383.318.0±0.60dS21710038.0±0.64b彩色珍珠豆10024.7±0.98cT0310036.0±0.55b桂花3510035.3±0.52bT22810038.0±0.80ab花小宝6012.0±0.62dZ7510036.7±0.98b泉花55710027.3±0.64cZ8210035.8±0.75b汕油红9023.3±0.40cM0596.431.4±0.70bQ51087.728.0±0.52cZK33210032.0±0.30b汕油红1号10025.3±0.90cZK0210038.0±0.42b汕油诱2号10025.3±0.33cZK0610037.3±0.60b云花生93.325.3±0.39cZK0710038.4±0.55ab兆流小红73.322.7±1.3cZK0810038.0±0.92abE00210029.4±0.17cZK1110036.3±0.55bGH1489.423.1±1.04c伦三水10039.0±0.32abML0910024.7±0.69cM0610036.5±0.91bQ51187.718.0±0.80d续表6(3)注：表中数据均为3次重复的平均值，右上角标有不同的英文字母表示差异显著(P<0.05)。当前第1页1 2 3