一种华榛诱导丛生芽快繁方法与流程

本发明涉及一种华榛诱导丛生芽快繁方法，属于生物技术领域。

背景技术：

华榛又名山白果，属桦木科榛属落叶乔木，为中国特有的稀有珍贵树种，是榛属中罕见的大乔木，其材质优良，种子可食，含油量50％，华榛的种子形似栗子，外壳坚硬，果仁肥白而圆，有香气，含油脂量很大，有“坚果之王”的称呼，与扁桃、胡桃、腰果并称为“四大坚果”。

本发明技术采用华榛一年生实生苗带芽茎段和成熟的种胚为材料，两种途径进行诱导定芽及定芽诱导丛生芽，从而建立华榛快繁再生体系。

目前，有关桦木科榛属方面以榛子(平榛与欧榛杂交)植物组培相关报道，主要以当年生植物茎段为外植体，进行组织培养快繁研究，无华榛方面相关报道。宗长玲等在平榛离体培养技术的研究中、刘家宁等在平欧杂交榛的组织培养中，均以DKW为基本培养基，周亚崎等在平欧杂种榛的继代培养条件优化研究中，以改良NRW为基本培养基，进行榛子茎段诱导定芽。

技术实现要素：

本发明提供一种华榛诱导丛生芽快繁方法，包括如下步骤：

茎段快繁体系的建立

外植体选择：分别采集3月、4月、5月华榛播种出苗后7-10d健壮实生小苗，去除根部，保留子叶并摘去其上部2片叶，自来水清洗植株表面灰尘，洗衣粉浸泡8min后自来水冲洗1h，放置超净工作台，用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞消毒15min，无菌水清洗5-6遍，切成2cm带芽茎段，置于无菌滤纸上吸干表面水分备用；

茎段诱导萌发：将带芽茎段接种于启动培养基中，在温度26±1℃、湿度80±5％、光照14h/L、光照强度1800-2000lx下培养，一周后定芽开始萌动，培养三周后节间抽长，每株有2-3片新叶展开，叶色呈翠绿色；

种胚快繁体系的建立

外植体预处理：采集9-10月份华榛成熟种子，将进行实验的华榛成熟种子提前7d处理，钳子去除外果皮，坚硬的内果皮，先进行80℃水中浸泡24h的热处理,再进行0℃冷藏室5d冷藏的冷处理，然后取出种子，放入GA₃5.0mg·L^-1浸泡1h.

外植体采集：将预处理后的华榛种子用洗衣粉浸泡6min，自来水冲洗1h，放置超净工作台上，采用二次消毒法。先用75％酒精浸泡30s，0.1％升汞消毒8min，无菌水清洗5-6遍，再去除内种皮，0.05％升汞消毒3min,无菌水清洗5-6遍，置于无菌滤纸上吸干材料表面水分备用；启动培养：

在超净工作台上将消毒好的华榛种子，将胚乳切去1/2(保留含胚芽部分)，接种于启动培养基上，所述的启动培养基为MS+KT1.0mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA31.0mg·L^-1+琼脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1。在暗培养15d后，再在温度26±1℃、湿度80±5％、光照14h/L、光照强度1800-2000lx下培养，7d后胚乳膨大、胚根长出、子叶展开，10-20d，形成单芽且有2-3片新叶展开，叶色呈翠绿色；

丛生芽诱导：

将茎段和种胚诱导的单芽，切成3cm接至MS+KT1.5mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA₃1.0mg·L^-1+胰蛋白胨0.1g·L^-1+琼脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上，通过10d培养，定芽基部产生愈伤组织，连续培养20d后由胚性愈伤团逐步形成丛生芽，快速建立华榛诱导丛生芽快繁体系。

华榛快繁发明技术的优点

实生苗带芽茎段诱导单芽及单芽诱导丛生芽较多年生植株材料脱分化、再分化能力更强。

将植物种胚先进行7d的预处理，再胚乳切割1/2(保留含胚芽部分)处理后，能够快速打破种子休眠，有利于胚的萌发和胚性愈伤的产生。

两种材料诱导定芽较多年生植株好消毒，诱导快，萌芽率高，利于胚性愈伤团的形成，加快分裂能力，形成不定芽。

附图说明

图1种胚快繁体系中华榛种子胚乳膨大。

图2种胚快繁体系中胚乳膨大、胚根长出、子叶展开。

图3种胚快繁体系中形成完整植株。

图4启动培养阶段茎段定芽诱导长势。

图5胚性愈伤团形成芽丛。

图6丛生芽诱导。

具体实施方式

茎段快繁体系的建立

外植体来源

采集种质资源圃一年生生长健壮、无病虫害华榛7-10d实生苗。

外植体消毒

分别采集3月、4月、5月华榛播种出苗后7-10d健壮实生小苗，去除根部，保留子叶并摘去其上部2片叶，用自来水清洗植株表面灰尘，用洗衣粉浸泡8min，自来水冲洗1h，放置超净工作台，用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞消毒15min，无菌水清洗5-6遍，切成2cm带芽茎段，置于无菌滤纸上吸干表面水分备用。

启动培养基

将处理好的材料接种于启动培养基：MS+KT1.0mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA₃1.0mg·L^-1+琼脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上，培养条件为：温度26±1℃、湿度80±5％、光照14h/L、光照强度1800-2000lx。一周后定芽开始萌动，培养三周后节间抽长，每株有2-3片新叶展开，叶色呈翠绿色，定芽诱导率达到96.4％以上。

种胚快繁体系的建立

外植体

采集三峡种质资源圃华榛成熟饱满的种子。

外植体预处理

采集9-10月份华榛成熟种子，将进行实验的华榛成熟种子提前7d处理，钳子去除外果皮，坚硬的内果皮，先进行80℃水中浸泡24h的热处理,再进行0℃冷藏室5d冷藏的冷处理，然后取出种子，放入GA₃5.0mg·L^-1浸泡1h。

外植体消毒

将预处理后的华榛种子先洗衣粉浸泡6min，自来水冲洗1h，放置超净工作台上，采用二次消毒法。用75％酒精浸泡30s，再用0.1％升汞消毒8min，无菌水清洗5-6遍，再去除内种皮，0.05％升汞消毒3min，无菌水清洗5-6遍，置于无菌滤纸上吸干材料表面水分备用；

启动培养

在超净工作台上将消毒好华榛种子，将胚乳切去1/2(保留含胚芽部分)，接种于启动培养基：MS+GA₃3.0mg·L^-1+琼脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上。先暗培养15d后，再进行培养室正常培养，培养条件为温度26±1℃、湿度80±5％、光照14h/L、光照强度1800-2000lx，7d后胚乳膨大、胚根长出、子叶展开。3周后统计萌芽率为92％。

丛生芽诱导

将茎段和种胚诱导的单芽，切成3cm接至MS+KT1.5mg·L^-1+IBA0.05mg·L^-1+GA₃1.0mg·L^-1+胰蛋白胨0.1g·L^-1+琼脂5.8g·L^-1+蔗糖25g·L^-1+AC0.1g·L^-1上。通过10d培养，定芽基部产生胚性愈伤组织，连续培养20d后由胚性愈伤团逐步形成丛生芽。