基因敲除动物作为皮肤屏障功能障碍动物模型的应用的制作方法

本发明一种新型动物模型，特别涉及基因高阶动物作为皮肤屏障功能障碍动物模型的应用。

背景技术：

皮肤是机体最直接与外界接触的器官，也是人体最大的器官，覆盖于整个体表，起到了重要的屏障作用。作为机体重要的物理/机械屏障，一方面，它在一定程度上可以阻止外界不利因素(物理、化学、生物等)进入人体，保护着体内各种器官和组织免受外界物质侵袭；另一方面，可以避免人体表皮及真皮内水分及脂类等物质的丢失，从而保持机体内环境的相对稳定。

研究表明，特异性皮炎(atopic dermatitis，AD)、鱼鳞病、银屑病、接触性皮炎、玫瑰痤疮、湿疹等多种皮肤病的发生都与皮肤屏障功能的稳定有关。因此，皮肤屏障功能一直以来都是皮肤科临床工作中十分关注的热点。如：引起皮肤屏障功能破坏最常见的疾病--特异性皮炎，是一种慢性的、反复发作的炎症性皮肤疾病，目前有10％-20％的儿童受此疾病困扰[Carroll CL,Balkrishnan R,Feldman SR,Fleischer AB Jr,Manuel JC.The burden of atopic dermatitis:impact on the patient,family,and society.Pediatr Dermatol.2005；22(3):192-199.]。

皮肤表皮最外层的角质层(stratum corneum)，是皮肤的第一道屏护门，在皮肤屏障中起着至关重要的作用。机体90％的皮肤屏障功能依靠角质层完成。角质层由退化的角质形成细胞层叠交错构成，在皮肤不同位置，角质层有不同的厚度，约5～20层细胞，厚度约10～15微米“砖墙模型”是现在公认的表皮角质层屏障结构模型。角质层屏障的主要成分是角质套膜(砖)(Cornified envelop)和胞间的脂质双分子层(泥)(Intercellular lipid)；角质套膜由占角质层80％的兜甲蛋白(loricrin，LOR)、内披蛋白(involucrin,IVL)和丝聚合蛋白(filaggrin，FLG)等相互交联形成不溶性致密结构[Kalinin,A.E.,Kajava,A.V.and Steinert,P.M.2002.Epithelial barrierfunction:assembly and structural features of the cornified cellenvelope.Bioessays 24:789.]。

FLG是表皮颗粒细胞角质透明蛋白颗粒的主要成分，位于人类染色体1q2u1，即所谓的表皮分化复合体里面。越来越多的研究表明FLG基因表达异常(降低)会导致一些以皮肤干燥和皮肤屏障功能受损的疾病，如特异性皮炎(atopic dermatitis，AD)和寻常型鱼鳞病。许多类型鱼鳞病的研究发现表皮异常分化与染色体1q21有关，因此证明了鱼鳞病的发生与FLG的基因表达缺失有关[Zhong W，Cui B，Zhang Y，et al.Linkage analysis suggests a locus of ichthyosis vulgaris on 1q22.J Hum Genet，2003，48:390-392.]。在对特异性皮炎(AD)患者皮肤的表达谱研究中发现，FLG,LOR,IVL基因表达明显降低，深入的研究认为：尤其是FLG基因表达异常(下调)成为AD患者皮肤屏障功能破坏的主要原因之一[Hitokazu Esaki,David A.Ewald,Benjamin Ungar，Krueger，Emma Guttman-Yassky.Identification of novel immune and barrier genes in atopic dermatitis by means of laser capture microdissection,J ALLERGY CLIN IMMUNOL,2015:135；153-163.][Katherine Grey,Sheilagh Maguiness.Atopic Dermatitis:Update for Pediatricians,PEDIATRIC ANNALS,2016:45；280-286.]。

目前，FLG基因表达异常(缺失)的转基因动物已经成为公认的皮肤屏障功能障碍的转基因动物模型[Gyohei Egawa,Kenji Kabashima,Altered stratum corneum barrier and enhanced percutaneous immune responses in filaggrin-null mice,J ALLERGY CLIN IMMUNOL,2012:129；1538-1546.]，但国内未见此类转基因动物的报道。而国内报道的，皮肤机械屏障功能障碍动物模型制作方法仅见丙酮乙醚法和胶带法。丙酮乙醚法既：将小鼠腿毛后，以脱脂棉蘸取丙酮－乙醚混合液(1：1)反复擦拭腿毛处皮肤，每天2次，连续5天处理皮肤。胶带法既：用强力胶带反复粘贴腿毛后皮肤，每天2次，连续造模5天处理皮肤。而丙酮乙醚法和胶带法制作的皮肤机械屏障功能障碍动物模型，操作过程繁琐，不可控因素多，模型制备标准均一性较差，尤其是与临床疾病模型相似性差。

Cre-loxp重组酶系统是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。应用Cre-loxp重组酶系统能够实现条件性基因敲除技术，即实现目的基因在特定组织特定时间内的敲除。目前，条件基因敲除动物已经成为用于研究某个特定基因在动物体内特定部位功能的较好的动物模型。

角蛋白5(keratin5，K5)是皮肤表皮层的角质细胞表达的一种角蛋白。正常情况下，K5和K14二者成对表达，是角质形成细胞分化的标志物之一[Xunwei Wu,Fabio Quondamatteo,Tine Lefever,Aleksandra Czuchra,Hannelore Meyer,Anna Chrostek,Ralf Paus,Lutz Langbein,and Cord Brakebusch.Cdc42controls progenitor cell differentiation andβ-catenin turnover in skin.Genes Dev.2006 20:571-585.]。Cdc42全称为细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42)，大小为25×10³bp，基因定位于lp36.l，Cdc42是小G蛋白Rho家族蛋白中的重要成员，体内的Cdc42有两种形式，即GDP结合的无活性状态与GTP结合的活性状态。Cdc42在细胞信号转导通路中具有分子开关作用。活化的Cdc42通过作用于细胞内一系列下游效应底物来影响细胞的生长、分化、凋亡和细胞周期等一系列重要生命现象[Jaime Melendez,Matthew Grogg and Yi Zheng.Signaling Role of Cdc42in Regulating Mammalian Physiology.J Biol Chem.2011；286(4):2375-2381.]。

技术实现要素：

本发明的目的在于：获得皮肤角质形成细胞Cdc42基因敲除小鼠作为皮肤屏障功能障碍的转基因动物模型。

发明人以K5-Cre转基因小鼠和Cdc42^loxp/loxp转基因小鼠为基础，利用Cre-Loxp条件性基因敲除技术，将2种小鼠杂交后获得皮肤角质形成细胞Cdc42基因敲除小鼠，并进一步证明在皮肤角质形成细胞内Cdc42的表达明显缺失。

在对皮肤角质形成细胞Cdc42基因敲除(knockout，KO)小鼠的表型观察中发现，KO小鼠脱屑增加，皮肤过度角化，皮肤薄弱部位点片状溃疡等皮炎表现。

在对小鼠进行皮肤屏障功能检测实验之一----通透性功能检测实验，结果发现：KO组小鼠甲苯胺蓝染料容易渗透，进入皮肤深层。

进一步对刚出生小鼠进行皮肤屏障功能检测实验之一：皮肤保水功能检测实验，结果发现：KO组小鼠机体脱水速度明显加快，皮肤保水功能破坏。

在对小鼠进行皮肤组织学光镜下观察中发现：出生7周后，出现明显脱毛表型的KO组小鼠皮肤组织，角质层明显增厚，松散，易脱落，皮肤过度角化。

在对小鼠进行皮肤组织学扫描电子显微镜下观察中发现：KO组小鼠皮肤组织表面更粗糙，角质层细胞排列杂乱、松散。而野生型(wild type，WT)小鼠皮肤表面光滑，角质层细胞排列整齐、有序、紧密。

在对小鼠进行皮肤组织学透射电子显微镜下观察中发现：KO组小鼠皮肤组织，角质层细胞间脂质层消失，基底细胞间间隙增加。

在对小鼠皮肤组织表皮内3种皮肤屏障功能主要相关蛋白Filaggrin，Involucrin，Loricrin的表达情况研究中发现：KO组小鼠表皮内,构成砖-墙结构的Involucrine，Loricrine和Filaggrin三种蛋白表达明显减少，尤其是Filaggrin的表达减少最明显。

以上结果表明：获得皮肤角质形成细胞Cdc42基因敲除小鼠，皮肤屏障功能明显破坏。并且在基因的表达谱水平，与特异性皮炎(AD)等临床皮肤屏障功能破坏类疾病相似，可作为皮肤屏障功能破坏类疾病的动物模型用于基础和临床实验研究。

附图说明

图1转基因小鼠的构建流程；

图2转基因小鼠组织PCR基因鉴定结果；

图3转基因小鼠皮肤表皮细胞的Cdc42免疫组化染色结果；

图4皮肤角质形成细胞Cdc42基因敲除小鼠皮肤的表型观察；

图5皮肤屏障功能检测实验----甲苯胺蓝染料对皮肤通透性检测实验结果；

图6皮肤屏障功能检测实验----皮肤保水功能实验结果；

图7小鼠皮肤组织学水平光镜下观察结果；

图8小鼠皮肤组织学水平扫描电子显微镜下观察结果；

图9小鼠皮肤组织学水平透射电子显微镜下观察结果；

图10小鼠皮肤屏障功能主要相关蛋白filaggrin，involucrin，loricrin在小鼠皮肤组织的表达情况结果。

具体实施方式

一：转基因小鼠的构建

发明人利用Cre/loxP重组酶系统，将Cdc42^loxp/loxp转基因小鼠和K5-Cre转基因小鼠进行杂交，获得的F1代小鼠基因型为Cdc42^loxp/+/-K5-Cre+。而后利用Cdc42^loxp/+/-K5-Cre+小鼠再与Cdc42^loxp/loxp转基因小鼠杂交，其后代获取1/4比例Cdc42基因敲除(knockout)小鼠，简称KO小鼠，基因型为Cdc42^loxp/loxp/-K5-Cre+；获取1/2比例Cdc42基因未敲除(野生型)小鼠，简称WT小鼠，基因型为Cdc42^loxp/+/K5-Cre-或Cdc42^loxp/loxp/-K5-Cre-。构建流程如图1所示。

通过PCR方法和Cdc42免疫组织化学方法进行基因水平和蛋白水平鉴定。

小鼠组织PCR基因鉴定：K5-Cre+为667bp特异条带，Cdc42^loxP/loxP为700bp特异性条带，WT为600bp特异性条带；K5-Cre+且Cdc42^loxP/loxP的小鼠为KO小鼠，基因型为Cdc42^loxp/loxp-K5-Cre+(图2)。皮肤表皮细胞的Cdc42免疫组化染色，可见KO小鼠皮肤角质细胞内Cdc42蛋白的表达明显消失(图3)，说明成功构建皮肤角质细胞Cdc42基因敲除小鼠。

(1)PCR反应及免疫组织化学所用试剂：

异丙醇、75％乙醇、30％H2O2、琼脂糖等为实验室常规试剂。

二抗试剂盒和DAB显色试剂盒：生物素化羊抗小鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、链霉亲和素‐生物素‐过氧化物酶复合物(SABC)、3，3‐二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)购置武汉博士德公司，HRP标记二抗购自Cell Signaling。

(2)溶液配制

Genotyping buffer配制：

配置后，将其放入4℃冰箱保存。

10×TAE buffer配制：

用HCl调节pH值至8.0，室温保存。

1.5％琼脂糖凝胶的配制：

琼脂糖 3g

10×TAE buffer 20ml

dH₂O 180ml

微波(高火)加热7min，待其冷却至60℃，加入20ul的EB，轻摇混匀，倒入制胶槽，冷却。

(3)基因组DNA的提取

A:从乳鼠的尾部或脚趾剪下少量组织置于1.5mlEP管，每管加入300ul genotyping buffer和7.5u1蛋白酶K(简称PK，现用现加)，充分混匀。于50℃水浴消化过夜。

B:将消化好的组织充分摇匀，放入95℃恒温器5min，灭火PK。

C:将EP管移至离心机，8000rpm，室温离心5min。

D:小心转移300u1上清液至新的标记好编号的1.5mlEP管内，加入等体积-20℃异丙醇，上下颠倒混匀，可见白色絮状的DNA析出。

E:将EP管移至冰冻离心机，13000rpm，4℃离心10min。

F:弃去上清，加入300ul的-20℃75％乙醇洗涤沉淀。

G:将EP管移至冰冻离心机，13000rpm，4℃离心10min。

H:弃去上清，室温风干沉淀。

I:加入35ulddH2O溶解沉淀，紫外分光光度计下测定A260和A280吸光度，分析浓度和纯度。

J:4℃保存DNA样品备用。

(4)K5-Cre转基因小鼠的基因型鉴定

引物序列:

PCR反应体系：

K5-Cre反应条件：

94℃3min；95℃30sec，60℃1min，72℃1min；33cycles；72℃2min

Cdc42flox/flox反应条件：

94℃5min；94℃30sec，60℃1min，72℃1min；33cycles；72℃8min

(5)免疫组织化学染色步骤

A:组织切片脱蜡、入水：二甲苯2×10min，梯度酒精(100％I、100％Ⅱ、95％、90％、80％、70％)各5min，下行入水；蒸馏水洗3min；

B:热处理抗原修复：将组织切片置于一容器中并用10mM柠檬酸钠缓冲液覆盖，加热至沸腾，煮沸3分钟，断电5分钟，再次加热沸腾，煮沸3分钟，断电，让玻片在缓冲液中逐渐冷却约20分钟。蒸馏水清洗3×2min。

C:去除内源性过氧化物酶：组织切片滴加3％H2O2，RT下孵育10min；

D:TBST清洗：3×5min；

E:血清封闭：1.5％山羊血清封闭液室温封闭1h；

F:一抗孵育：一抗1:50(用血清封闭液稀释一抗)，4℃过夜。

G:TBST清洗：3×5min；

H:二抗孵育：滴加1:200荧光素标记羊抗小鼠IgG，RT孵育1h，避光。

注意：以下步骤均需要避光

I:TBST清洗：3×5min；

J:Hoechst孵育：滴加1:400荧光素标记羊抗小鼠IgG，RT孵育10min。

K:TBS清洗：3×5min；

L:水溶性甘油封片、光镜观察。

二：转基因小鼠皮肤功能的改变

为观察小鼠皮肤屏障功能变化，对小鼠进行通透性功能检测---甲苯胺蓝染料渗透实验(图5)：甲苯胺蓝染料渗透实验步骤：

A:脱水：25％甲醇2min，50％甲醇2min，75％甲醇2min，100％甲醇2min；

B:再水化：100％甲醇2min，75％甲醇2min，50％甲醇2min，25％甲醇2min；

C:PBS洗2min；

D:0.1％甲苯胺蓝染色(PBS溶解，质量体积比)5min；

E:PBS洗2min；

F:观察、拍照。

为进一步观察小鼠皮肤屏障功能变化，对出生第一天小鼠进行皮肤保水功能检测实验(图6)。

实验方法：对出生第一天小鼠，在非哺乳的条件下，每隔2小时进行体重称量，既称取0hour，2hour，4hour，6hour体重，然后用称取的2hour，4hour，6hour体重减去0小时小鼠体重，即为小鼠脱水量，将KO,WT两组小鼠脱水量进行统计学分析。

为观察小鼠皮肤组织学改变，对小鼠进行皮肤组织光镜，扫描电镜和投射电镜下观察(见图7，8,9)。

取出生后8周(P8weeks)和12周(P12weeks)的KO小鼠和WT小鼠皮肤，并将其放入4％多聚甲醛中固定、石蜡包埋、切片和染色。

光镜观察H.E.染色步骤：

A:脱蜡：二甲苯I、II各10min。

B:复水：梯度酒精(100％I、100％II、95％、90％、80％、70％)至水，各3min。

C:苏木精染色：15min，自来水轻轻冲洗返蓝。1％盐酸酒精分色几秒，自来水轻轻冲洗，观察。

D:脱水以及伊红染色：70％、80％、伊红染液(1min)、90％I、90％II、95％、100％I、II酒精各5min。

E:透明：二甲苯I、II各10min。

F:中性树脂封片，37℃烘干，长期保存,光镜观察。

扫描电镜和透射电镜标本处理过程：

脱毛后切取p8weeks小鼠背部皮肤(长宽为：1cm×1mm)，置入2.5％电镜级戊二醛中固定24h，PBS漂洗(4×30min)，锇酸固定1h，PBS漂洗(3×5min)，丙酮梯度脱水：50％丙酮10min→70％丙酮15min→90％丙酮15min→100％丙酮15min(4次)，浸透组织用丙酮与树脂按比例依次1：1(1h，RT)，1：2(2h，RT)，纯树脂(over night，RT)，树脂包埋，修块、扫描/透射电镜染色，分别行扫描和透射电镜观察。

为观察与皮肤屏障功能密切相关的角质套膜结构变化，对小鼠皮肤组织表皮内构成角质套膜结构的主要相关蛋白filaggrin，involucrin，loricrin的表达情况进行免疫荧光化学染色研究(图10)。

免疫荧光化学染色步骤：

A:组织切片脱蜡、入水：二甲苯2×10min，梯度酒精(100％I、100％Ⅱ、95％、90％、80％、70％)各5min，下行入水；蒸馏水洗3min；

B:热处理抗原修复：将组织切片置于一容器中并用10mM柠檬酸钠缓冲液覆盖，加热至沸腾，煮沸3分钟，断电5分钟，再次加热沸腾，煮沸3分钟，断电，让玻片在缓冲液中逐渐冷却约20分钟。蒸馏水清洗3×2min。

C:去除内源性过氧化物酶：组织切片滴加3％H2O2，RT下孵育10min；

D:TBST清洗：3×5min；

E:血清封闭：1.5％山羊血清封闭液室温封闭1h；

F:一抗孵育：一抗1:50(用血清封闭液稀释一抗)，4℃过夜。

G:TBST清洗：3×5min；

H:二抗孵育：滴加1:200荧光素标记羊抗小鼠IgG，RT孵育1h，避光。

注意：以下步骤均需要避光

I:TBST清洗：3×5min；

J:Hoechst孵育：滴加1:400荧光素标记羊抗小鼠IgG，RT孵育10min。

K:TBS清洗：3×5min；

L:水溶性甘油封片,正置荧光显微镜观察。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 基因敲除动物作为皮肤屏障功能障碍动物模型的应用

<130> K5-Cre

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

ctcttcaggg tcttcagtgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

catcttgtcc ctgaagtcgc 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

agacaaaaca acaaggtcca gaaac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

tacagttggt acatattccg atggg 25