技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法。
背景技术：
油菜作为世界上第三大油料作物，满足了全世界至少13%的食用油的需求。而我国的产量位居世界首位，具有较高的经济价值。我国栽培的油菜主要有白菜型油菜（Brassica rapa，n=10）、芥菜型油菜（Brassica juncea，n=18）和甘蓝型油菜（Brassica napus，n=19）三大类型。其中因甘蓝型油菜的产量高、抗性强、品质优、口感好等特性，自引入我国后被大力推广，种植面积迅速扩增，也是目前国内油菜育种工作者主要的研究对象。在常规油菜品种选育过程中，要育成一个稳定的自交系，至少需要5年。然而，通过油菜小孢子胚胎再生技术，易于进行早期选择，可以在较短的时间里获得纯合的育种材料，显著缩短了育种年限。利用小孢子培养途径比传统选育途径具有明显的优势。通过小孢子培养得到的单倍体植株有利于筛选隐性突变体，提高选择效率，有利于隐性基因控制性状的选择；还可以快速获得自交系的超雄株，构建DH群体作为遗传图谱的构图群体等。因此，建立高效快速的油菜小孢子培养体系具有十分重要的应用价值，是植物基因工程的一个新研究方向。自Licther等（1982）首次报道甘蓝型油菜小孢子培养并获得再生植株以来，许多相关研究者对影响油菜小孢子培养及胚状体再生的诸多因素进行了研究，包括培养基组成和培养条件、供体植株基因型及其生长条件、小孢子发育时期等。但培养基成分中的渗透调节剂的研究鲜有报道。因此，寻找一种更加适合的渗透调节剂对于甘蓝型油菜小孢子的培养显得极其重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，该方法小孢子出胚率高，小孢子胚状体植株再生率高，加倍率高，大大增加了培养的效率。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，包括以下步骤：
（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株。
（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×105～5×105个细胞/mL，再加入30～50µL秋水仙碱溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。
所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为： NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2。所述的含甘露醇的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L和蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH 5.6～6.2。所述的秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8%，将秋水仙碱加到NLN-13液体培养基中配制得到；所述的活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN-13液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g。
（3）将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，取出在黑暗条件下于22～28℃培养10～15天（直至肉眼可见胚状体时），再在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体。
（4）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天12～18小时光照、光照强度1000～2000lux和22～28℃条件下培养，形成再生芽。其中，所述再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。
（5）切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照、光照强度2000～3000lux和22～28℃条件下进行生根培养。将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鉴定倍性。其中，所述生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸（NAA）0.5～1mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。
本发明中：
所述的NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水，pH 5.6～6.2。
所述MS液体培养基，以1L计，组分为：NaH2PO4·H2O 150mg，CaCl2 113.24mg，KI 0.75mg，KNO3 2500mg，（NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 2mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O0.025mg，10mg维生素B1，1mg维生素B6，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，烟酸1mg，1L无菌水；
所述的灭菌采用本领域常规的灭菌方法，可采用次氯酸钠溶液通过表面消毒法将花蕾灭菌15～30分钟，无菌水清洗3～5遍后得到灭菌后的花蕾。所述次氯酸钠溶液，以1L计，组成为：次氯酸钠56～100mL、无水乙醇100mm、洗洁精8～10滴和余量用无菌水补齐。配制的次氯酸钠溶液的体积百分浓度为5.6～10%。
优选的技术方案中：
步骤（2）中，所述的花蕾为长度2～4mm、花粉母细胞处于单核晚期至双核早期，花蕾数目为80～100个。
步骤（2）中，所述的研磨、离心、弃上清及用NLN-13液体培养基重悬浮小孢子细胞的操作可以重复进行1～2次，即步骤（2）的具体步骤可以如下：从供体植株上取适宜的花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中再次加入NLN-13液体培养基研磨成悬浮液，再次过滤所得滤液经离心、弃上清液，再次得到沉淀；在沉淀中先加入10～20mL含甘露醇的NLN液体培养基，在显微镜下利用血细胞计数器计算小孢子细胞浓度，用一定量的含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105～5×105个细胞/mL，再加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。
步骤（2）中，所述的过滤可采用44µm无菌滤网。
步骤（2）中，所述的离心的条件一般为：900～1200rpm离心3～5min。
步骤（3）中，所述的小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理，热激后的小孢子悬浮液能够更促进小孢子细胞的胚胎发生。
步骤（3）中，所述的子叶期胚状体可放入3～8℃冰箱中冷藏保存，以延长胚状体的保存期限。
步骤（3）中，在黑暗条件下的培养温度优选为25±2℃，即：在黑暗条件下25±2℃于培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25±2℃条件下摇动培养。在黑暗条件下摇动培养相对于不摇动培养的小孢子吸收营养更充分，因此胚生长得较迅速以及较健壮。
步骤（4）中，所述的培养条件优选为：每天16小时光照和25℃下培养。一般培养时间为20～30天。
步骤（4）中，所述的子叶期小孢子胚状体接种到再生培养基上，只需要留下已经直接成苗的幼芽，其他愈伤组织都不再保留，这样既保证了苗的质量也避免了不必要的时间浪费。
步骤（5）中，所述的再生芽（即直接成苗的幼苗）接种到生根培养基上，培养条件为：每天16小时光照和25℃下培养。一般培养时间为25～30天。
步骤（5）中，移栽时用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5～7天，在温室中培养15～20天后移栽到大的盆钵中。
步骤（5）中，所述的鉴定采用本领域常用的倍性鉴定方法，如取再生植株最嫩的叶片检测各再生植株倍性。可用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析鉴定。
本发明中，采用含甘露醇的NLN液体培养基，以甘露醇部分代替NLN-13液体培养基中的蔗糖。甘露醇是一种高度溶于水的无毒中性化合物，热水条件下溶解度更高，是一种非常常用的高渗物质，能够营造出有利的一个低水势的培养环境。在NLN-13液体培养基中减少蔗糖含量，并加入一定量的甘露醇作为渗透调节物，产生的胚胎比现有技术中完全用蔗糖培养的要大一些，再生植株的能力有所增强。由含甘露醇的NLN液体培养基诱导的小孢子植株的加倍率高于常规方法（43～52%），而完全用蔗糖作为渗透调节剂的NLN-13液体培养基中只有2～18%的植株会发生自发加倍。
可见，本发明在小孢子胚胎发生过程中采用含甘露醇的NLN液体培养基，以甘露醇部分代替NLN-13液体培养基中的蔗糖（甘露醇的质量百分浓度从6.25%递增到25%，相应地，蔗糖的质量百分浓度从6.5%递减到0.1%），始终保持0.1%含量的蔗糖以保证碳元素的供给量，超过部分的蔗糖作为渗透调节剂与甘露醇一起将溶液的渗透压保持衡定，取得更好的培养效果。此外，在小孢子游离过程中加入秋水仙碱溶液与常规的浸泡再生植株根部的方法相比，加倍率比较高，而且用量少，污染小。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
采用易出胚的油菜品种作为供体植株，以甘露醇部分代替NLN-13液体培养基中蔗糖的作用，在保证碳元素供给的条件下，利用甘露醇代替或者部分代替蔗糖的渗透调节作用，提供了一种新型的油菜小孢子培养方法。本发明方法培养出的油菜出胚率最高达32个/蕾，小孢子培养技术的利用效率高。经观察记录数据以及流式细胞仪检测发现，甘露醇法培养的小孢子胚状体植株再生率高达94.3%，加倍率能够达到52.4%，比常规的80%左右再生率及2～18%的加倍率要高，效果好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）培养基配制
① NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水，过滤灭菌。
② NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L和蔗糖130g，pH 6.0，过滤灭菌。
③含甘露醇36.5g/L的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，甘露醇36.5g，蔗糖65g，pH6.0，过滤灭菌。
④ MS液体培养基，以1L计，组成为：NaH2PO4·H2O 150mg，CaCl2 113.24mg，KI 0.75mg，KNO3 2500mg，（NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 2mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，10mg维生素B1，1mg维生素B6，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，烟酸1mg，1L无菌水。
⑤再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1.5mg，蔗糖25g，琼脂粉6.5g，pH5.8，高温高压灭菌。
⑥生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸（NAA）1.0mg，蔗糖25g，琼脂粉6.5g，pH5.8，高温高压灭菌。
（2）利用甘露醇作为渗透调节剂的小孢子培养方法
1）供体植株花蕾的选择：取甘蓝型油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体植株；取花序上花瓣和花药长度比在0.5、单核晚期至双核早期的花蕾40个。
2）花蕾的灭菌：用次氯酸钠56mL/L+无水乙醇100mL/L+洗洁精10滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5.6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把步骤（1）取得的油菜花蕾放入无菌培养皿中，加入50mL次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用。
3）在超净工作台上将40个灭菌后的油菜花蕾置于无菌烧杯中，加入5mL NLN-13液体培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜NLN-13液体培养基至30mL；该悬浮液用44µm无菌滤网过滤到50mL离心管中，盖紧，900rpm离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液体培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇36.5g/L的NLN液体培养基10mL，在显微镜下利用血细胞计数器，计算小孢子细胞浓度，再用一定量的含甘露醇36.5g/L的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105个细胞/mL后，加入40µL秋水仙碱溶液（质量百分浓度为0.5%）及100µL高压灭菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合悬浮液。
4）将该小孢子混合悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4mL小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm®封口膜（美国parafilm公司）封口，后置于30℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理2天，然后取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养10～15天得到子叶期胚状体，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、光照强度1000lux、25℃条件下培养20～25天，直接形成再生幼芽。
6）切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、光照强度2000lux、25℃条件下进行生根培养；25～30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。
结果：小孢子出胚率为32个/蕾，经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，小孢子胚状体的植株再生率为高达88.5%，加倍率达67.8%。
实施例2
（1）培养基配制
① NLN液体培养基，同实施例1。
② NLN-13液体培养基，同实施例1。
③含甘露醇54.8g/L的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，54.8g甘露醇，蔗糖32.5g，pH 6.0，过滤灭菌。
④MS液体培养基，同实施例1。
⑤再生培养基，同实施例1。
⑥生根培养基，同实施例1。
（2）利用甘露醇作为渗透调节剂的小孢子培养方法
1）供体植株花蕾的选择：取甘蓝型油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体植株；取花序上花瓣和花药长度比在0.5、单核晚期至双核早期的花蕾40个。
2）花蕾的灭菌：用次氯酸钠56mL/L+无水乙醇100mL/L+洗洁精8滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5.6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把步骤（1）取得的花蕾放入无菌小瓶中，加入50mL次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用。
3）在超净工作台上将40个灭菌后的油菜花蕾置于无菌烧杯中，加入5mL NLN-13液体培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜NLN-13液体培养基至30mL；该悬浮液用44µm无菌滤网过滤到50mL离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液体培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇54.8g/L的NLN液体培养基10mL，在显微镜下利用血细胞计数器，计算小孢子细胞浓度，再用一定量的含甘露醇54.8g/L的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105个细胞/mL后，加入40µL秋水仙碱溶液（质量百分浓度为0.5%）及100µL高压灭菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合悬浮液。
4）将该小孢子混合悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4mL小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm®封口膜（美国parafilm公司）封口，后置于30℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理2天；然后取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养10～15天得到子叶期胚状体，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、光照强度1000lux、25℃条件下培养20～25天，直接形成再生幼芽。
6）切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、光照强度2000lux、25℃条件下进行生根培养；25～30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。
结果：小孢子出胚率为30个/蕾，经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，小孢子胚状体的植株再生率高达89.1%，加倍率达47.6%。
实施例3
（1）培养基配制
①NLN液体培养基，同实施例1。
②NLN-13液体培养基，同实施例1。
③含甘露醇73g/L的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，73g甘露醇，蔗糖1g，pH6.0，过滤灭菌。
④MS液体培养基，同实施例1。
⑤再生培养基，同实施例1。
⑥生根培养基，同实施例1。
（2）利用甘露醇作为渗透调节剂的小孢子培养方法
1）供体植株花蕾的选择：取甘蓝型油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体植株；取花序上花瓣和花药长度比在0.5、单核晚期至双核早期的花蕾40个。
2）花蕾的灭菌：用次氯酸钠56mL/L+无水乙醇100mL/L+洗洁精9滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5.6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把步骤（1）取得的花蕾放入无菌小瓶中，加入50mL次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用。
3）在超净工作台上将40个灭菌后的油菜花蕾置于无菌烧杯中，加入5mL NLN-13液体培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜NLN-13液体培养基至30mL；该悬浮液用44µm无菌滤网过滤到50mL离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液体培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇73g/L的NLN液体培养基10mL，在显微镜下利用血细胞计数器，计算小孢子细胞浓度，再用一定量的含甘露醇73g/L的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105个细胞/mL后，加入40µL秋水仙碱溶液（质量百分浓度为0.8%）及100µL高压灭菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合悬浮液。
4）将该小孢子混合悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4mL小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm®封口膜（美国parafilm公司）封口，后置于30℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理2天；后取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养10～15天得到子叶期胚状体，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、光照强度1000lux、25℃条件下培养20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、光照强度2000lux、25℃条件下进行生根培养；25～30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。
结果：小孢子出胚率为24个/蕾，经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，小孢子胚状体植株再生率高达94.3%，加倍率达52.4%。
实施例4
（1）培养基配制
①NLN液体培养基，同实施例1。
②NLN-13液体培养基，同实施例1。
③含甘露醇73g/L的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，73g甘露醇，蔗糖1g，pH6.0，过滤灭菌。
④MS液体培养基，同实施例1。
⑤再生培养基，同实施例1。
⑥生根培养基，同实施例1。
（2）利用甘露醇作为渗透调节剂的小孢子培养方法
1）供体植株花蕾的选择：取甘蓝型油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体植株；取花序上花瓣和花药长度比在0.5、单核晚期至双核早期的花蕾40个。
2）花蕾的灭菌：用次氯酸钠56mL/L+无水乙醇100mL/L+洗洁精9滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5.6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把步骤（1）取得的花蕾放入无菌小瓶中，加入50mL次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用。
3）在超净工作台上将40个灭菌后的油菜花蕾置于无菌烧杯中，加入5mL NLN-13液体培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜NLN-13液体培养基至30mL；该悬浮液用44µm无菌滤网过滤到50mL离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液体培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入含甘露醇73g/L的NLN液体培养基10mL，在显微镜下利用血细胞计数器，计算小孢子细胞浓度，再用一定量的含甘露醇73g/L的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105个细胞/mL后，加入40µL秋水仙碱溶液（质量百分浓度为0.8%）及100µL高压灭菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合悬浮液。
4）将该小孢子混合悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4mL小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm®封口膜（美国parafilm公司）封口，不用30℃热激处理，直接置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养10～15天得到子叶期胚状体，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、光照强度1000lux、25℃条件下培养20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、光照强度2000lux、25℃条件下进行生根培养；25～30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。
结果：小孢子出胚率为22个/蕾，经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，小孢子胚状体植株再生率高达91.6%，加倍率达50.1%。
实施例5
（1）培养基配制
①NLN液体培养基，同实施例1。
②NLN-13液体培养基，同实施例1。
③MS液体培养基，同实施例1。
④再生培养基，同实施例1。
⑤生根培养基，同实施例1。
（2）利用蔗糖作为渗透调节剂的小孢子培养方法
1）供体植株花蕾的选择：取甘蓝型油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体植株；取花序上花瓣和花药长度比在0.5、单核晚期至双核早期的花蕾40个。
2）花蕾的灭菌：用次氯酸钠56mL/L+无水乙醇100mL/L+洗洁精9滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5.6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把步骤（1）取得的花蕾放入无菌小瓶中，加入50mL次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用。
3）在超净工作台上将40个灭菌后的油菜花蕾置于无菌烧杯中，加入5mL NLN-13液体培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜NLN-13液体培养基至30mL；该悬浮液用44µm无菌滤网过滤到50mL离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液体培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入NLN-13液体培养基10mL，在显微镜下利用血细胞计数器，计算小孢子细胞浓度，再用NLN-13液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105个细胞/mL后，加入40µL秋水仙碱溶液（质量百分浓度为0.8%）及100µL高压灭菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合悬浮液。
4）将该小孢子混合悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4mL小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm®封口膜（美国parafilm公司）封口，后置于30℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理2天；后取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养10～15天得到子叶期胚状体，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、光照强度1000lux、25℃条件下培养20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、光照强度2000lux、25℃条件下进行生根培养；25～30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。
结果：小孢子出胚率为48个/蕾，经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，小孢子胚状体植株再生率达43.2%，加倍率达38.6%。
实施例6
（1）培养基配制
①NLN液体培养基，同实施例1。
②NLN-13液体培养基，同实施例1。
③MS液体培养基，同实施例1。
④再生培养基，同实施例1。
⑤生根培养基，同实施例1。
（2）利用蔗糖作为渗透调节剂的小孢子培养方法
1）供体植株花蕾的选择：取甘蓝型油菜生长健康、无病虫害的初花期的花序作为小孢子培养的供体植株；取花序上花瓣和花药长度比在0.5、单核晚期至双核早期的花蕾40个。
2）花蕾的灭菌：用次氯酸钠56mL/L+无水乙醇100mL/L+洗洁精9滴+无菌水配制成的体积百分浓度为5.6%的次氯酸钠水溶液灭菌液；把步骤（1）取得的花蕾放入无菌小瓶中，加入50mL次氯酸钠水溶液灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒15分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用。
3）在超净工作台上将40个灭菌后的油菜花蕾置于无菌烧杯中，加入5mL NLN-13液体培养基，用灭过菌的平头玻璃棒挤碎、研磨成悬浮液，加入新鲜NLN-13液体培养基至30mL；该悬浮液用44µm无菌滤网过滤到50mL离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入5mL NLN-13液体培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液，再次得到沉淀；向沉淀中加入NLN-13液体培养基10mL，在显微镜下利用血细胞计数器，计算小孢子细胞浓度，再用NLN-13液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105个细胞/mL后，加入40µL秋水仙碱溶液（质量百分浓度为0.8%）及100µL高压灭菌后的活性炭混合液（1L活性炭混合液的组成为：NLN液体培养基1L、琼脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合悬浮液。
4）将该小孢子混合悬浮液分装到60mm玻璃无菌培养皿中，每60mm培养皿加4mL小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm®封口膜（美国parafilm公司）封口，不用30℃热激处理，直接置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养10～15天得到子叶期胚状体，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天16小时光照、光照强度1000lux、25℃条件下培养20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生长健康的再生幼芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、光照强度2000lux、25℃条件下进行生根培养；25～30天后将根生长健壮的苗用蒸馏水洗净组培苗根部培养基，剪去较长的根，以便于移栽。随后植于装有灭菌土的穴盘中，塑料膜罩住保湿5天，在温室中培养15天后移栽到大的盆钵中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCanto流式细胞仪进行倍性分析，检测各植株倍性，仅保存双单倍体植株。
结果：小孢子出胚率为5个/蕾，经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，小孢子胚状体植株再生率达38.7%，加倍率达40.6%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。