本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种金线莲组培苗快速繁殖方法。
背景技术：
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金线莲别名金线兰、金丝草，是兰科(Orchidaceae)开唇植物花叶兰属(Anoectochilus Bl.)多年生珍稀草本植物，我国有23种左右，其中部分种全草民间作药用,为传统珍稀名贵中药材，它在民间使用范围较广，多用于治疗糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病，素有“药王”、“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，被称为“药中之王”。多年来，由于其市场需求大而导致人工过度采挖，加上金线莲自然繁殖率低、生长缓慢，野生的金线莲资源已非常稀少，濒临灭绝，早在1987年国务院就将金线莲列为重点保护的中药材之一，为国家二级保护植物。而由于人工种植金线莲又有较大的难度，目前人工种植的数量还非常有限。由于原材料量的限制，近年来金线莲产业有所萎缩。因此大力发展人工种植已显得非常必要和迫切。因为金线莲在临床中广泛应用,而且疗效极好,具有极高的经济效益和社会效益，因此市场需求越来越大，而人工种植的金线莲还远不能满足市场的需求，目前市场价格昂贵，由金线莲制成的干品目前售价每公斤达到1万元，市场金线莲鲜品价格亦高达800-1000元/公斤，若每亩能产出300公斤以上鲜品，则亩产值可达24万元以上。是目前农业种植业中效益最高的产业之一。大力发展金线莲的人工种植，不但可以满足人们对金线莲的需求，而且还可以因减少对野生资源的依赖而起到保护野生资源的目的，因此人工种植金线莲不但有很好的市场前景，而且对野生资源的保护也有重要的意义。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种污染率极低，从而有效的降低成本的金线莲组培苗快速繁殖方法。
本发明的金线莲组培苗快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、选取天湖金线莲的健康株系，去掉根、叶片和叶鞘，取其茎条，洗净后切成带节茎段，消毒后接种到不定芽诱导培养基J1上，培养温度为23±2℃，光照强度500～1000lx，光照12h/d，获得不定芽，所述的不定芽诱导培养基J1每升含花宝1号1～2g，蛋白胨0.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤2.0～5.0mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～20g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
B、分切不定芽，将高小于3厘米的丛生芽插植于玻璃培养瓶中的增殖培养基J2上，把高大于3厘米的不定芽单株插植于生根培养基JR上，用瓶塞塞住玻璃培养瓶的瓶口，将含有不定芽的增殖培养基J2和生根培养基JR的玻璃培养瓶横放于全自然光培养室中的培养架上，瓶口统一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培养温度23-25℃，光照强度1000-3000lx，光照时间10-16h/d下培养，当增殖培养基J2在培养下收获增殖材料不定芽，增殖材料不定芽继续接种至新的玻璃培养瓶中的增殖培养基J2上，用瓶塞塞住玻璃培养瓶的瓶口，将含有不定芽的增殖培养基J2的玻璃培养瓶横放于全自然光培养室中的培养架上，瓶口统一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培养条件为培养温度23-25℃，光照强度1000-3000lx，光照时间10-16h/d下培养，当增殖材料不定芽培养一个继代周期后进行接种转移，高小于3厘米的丛生芽插植于增殖培养基J2中，高大于3厘米的不定芽单株插植于生根培养基JR，如此循环，生根培养基JR上的不定芽长根后成为完整植株进行出瓶移栽；
所述的增殖培养基J2每升含花宝1号2～3g，蛋白胨0.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖20～30g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6；
所述的生根培养基JR每升含花宝1号2～3g，蛋白胨0.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤0.2～0.5mg，萘乙酸2～5mg，活性碳500～1000mg，蔗糖20～30g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6。
优选，将步骤A的不定芽转接到不定芽诱导培养基J1上进行继代培养，培养温度为23±2℃，光照度500～1000lx，光照12h/d，继代周期为35-40天，继代培养4-5次后可获得大量的不定芽作为无性繁殖材料。
所述的步骤A的消毒是将带节茎段，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡30s，再在质量分数0.1％升汞水溶液中浸泡并摇动5～16min，无菌水冲洗3次后，用无菌纸吸干茎段表面水分，并切去两端各1～2mm，再接种到不定芽诱导培养基J1。
金线莲组织培养已有很多的报道，有无菌播种种子繁殖和无性繁殖两种方式，但因其培养基富含营养加上继代培养周期偏长，普遍存在金线莲组培苗生产过程中污染率高于15％，从而导致生产成本高甚至导致停产的问题，本发明利用广东从化天湖金线莲的优良株系为外植体进行无性克隆快速繁殖种苗，确保种苗保持原有优良种性及其药效，利用培养容器横放和全自然光的培养方式，可有效解决金线莲组培快繁中污染率常常高于15％的难题，同时不用荧光灯作为光源，明显降低了生产成本，经济效益更加显著。本发明的方法具有低成本，种性强，药效高的特点，提高了金线莲种苗使用的安全性，对濒危紧缺金线莲药用植物资源再生和持续利用具有十分重要意义，满足健康产业对珍贵中药材金线莲的巨大市场需求。
本发明操作简便，生产成本低，便于道地金线莲优良株系的无性克隆快速繁殖种苗，确保金线莲原有的优良种性和疗效。利用本发明繁殖金线莲种苗，有利于保持种源的优良种性，促进金线莲生长及药效的提高，提高道地金线莲的使用价值和安全性，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有十分积极的影响。
本发明的技术特点如下：
1、以原生地的金线莲优良株系为外植体建立其无性繁殖系。
2、将培养容器横放，污染率控制在0.5％以下，且培养材料受光均匀，培养材料生长健壮划一，利于标准化生产。
3、利用全自然光培养室，可显著降低了生产成本，提高经济效益。
4、实施本发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.材料：天湖金线莲(Anoectochilus roxburghii(wall)lindl.‘tianhu’)生长健壮、茎粗、叶片大、叶片网纹清晰且多、抗逆性、抗病虫害强的健康株系。
2.药品购买
购买植物组培苗生产所需的培养基成分中的常规的所有药品，将药品储存于干燥凉爽的室内待用。
3.母液配制
根据培养基配方要求，分门别类按组成成分配制其母液。药品逐一完全溶解，倒入选定的容量瓶内，最后定容。如遇加热才能溶解情况，需待溶液冷却后再定容。盛装母液的试剂瓶，应贴明显标签纸，写上母液名称、浓度和配制日期，配制好的母液放置冰箱(2～5℃)备用。
4.培养基配制
根据培养材料组培苗生产的要求，配制其增殖培养基和生根培养基，配制培养基按以下程序添加药品或母液：糖——无离子水——铁盐母液——大量元素母液——微量元素母液——维生素母液——甘氨酸母液——肌醇母液——植物生长调节剂母液——琼脂，调整pH至5.4-5.6，分别将100毫升的培养基灌装至每一500毫升的方形玻璃培养容器中，再将培养基立放于一长方体的消毒车上，整体推进配套的高压消毒锅中于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min。
5.培养基冷却
当培养基灭菌完毕后，于培养基凝固之前把长方体的消毒车立起来，使方形玻璃培养瓶处于横放、瓶口朝左右方向状态进行冷却培养基，培养基凝固于玻璃培养瓶的一边上后待用。
6.外植体选择、消毒及诱导不定芽和形成无性繁殖系
于广东从化天湖金线莲原生地中(北纬23度37分至23度40分，东经113度36分至113度38分)，选取生长健壮、茎粗、叶片大、叶片网纹清晰且多、抗逆性、抗病虫害强的健康株系，用软毛刷在流水下将苗株表面小心洗净，去掉根、叶片和叶鞘，顶部未展开叶片可保留约1cm。用洗衣粉水浸泡，同时轻轻摇动约10min，清水洗净后拿至超净工作台。将处理好的金线莲茎条切成2cm左右带节茎段，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡30s，再在质量分数0.1％升汞水溶液中浸泡并摇动5～16min，无菌水冲洗3次后，用无菌纸吸干茎段表面水分，并切去两端各1～2mm，再接种到不定芽诱导培养基J1进行不定芽诱导，培养温度为(23±2)℃，光照度500～1000lx，光照12h/d，由此获得不定芽，不定芽进行继代培养，继代培养的培养基为不定芽诱导培养基J1，继代培养的条件同不定芽诱导，继代周期为35-40天，同继代培养4-5次后可获得大量的不定芽作为无性繁殖材料。
所述的不定芽诱导培养基J1，每升含花宝1号1g，蛋白胨2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg，烟酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)5.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖20g，琼脂6g，余量为水，pH 5.4，其配置方法是将花宝1号1g，蛋白胨2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg，烟酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)5.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖20g，琼脂6g加入到少量水中，然后用水定容至1L，调pH值至5.4，灭菌备用。
7.接种转移
按规定要求将步骤6的无性繁殖材料(不定芽)逐一细致观察，剔除污染材料，用体积分数75％酒精水溶液抹干净玻璃培养瓶表面，于玻璃培养瓶中装填增殖培养基J2或生根培养基JR。于超净工作台上，按正常的操作分切无性繁殖材料得到培养材料，从侧边开瓶口中从分切好的培养材料中把高小于3厘米的丛生芽插植于增殖培养基J2中和把高大于3厘米的不定芽单株插植于生根培养基JR中，用瓶塞盖住瓶口。
所述的增殖培养基J2每升含花宝1号2g，蛋白胨2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg，烟酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖30g，琼脂6g，pH 5.6。其配制方法是：将花宝1号2g，蛋白胨2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg，烟酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖30g，琼脂6g溶于少量水中，然后用水定容至1L，调pH至5.6，灭菌备用。
所述的生根培养基JR每升含花宝1号2g，蛋白胨2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg，烟酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg，萘乙酸(NAA)2mg，活性碳1000mg，蔗糖20g，琼脂7g，pH 5.4。其配制方法为：将花宝1号2g，蛋白胨2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.8mg，烟酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg，萘乙酸(NAA)2mg，活性碳1000mg，蔗糖20g，琼脂7g溶于少量水中，然后用水定容到1L，调pH值至5.4，灭菌备用。
8.全自然光照培养室的设计和培养
使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、降温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000Lux，顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000Lux，底层即顶层下第四层光照强度100～1000Lux。降温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～25℃。培养架宽为60厘米，高为200厘米，离地面10厘米为第四层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。
将接种有不定芽的增殖培养基J2和生根培养基JR的玻璃培养瓶横放于全自然光培养室中的培养架上，瓶口统一朝一方向，散射光能直接照射培养材料上，避免常规的立放的培养容器瓶盖对光的遮挡而影响培养材料对光的吸收；同时由于瓶口的侧开可有效避免培养室中的微粒进入培养容器中，污染发生小于0.5％，远低于通常污染率低于5％的要求。放置于培养温度(23-25)℃，光照强度1000-3000lx，光照时间10-16h/d下培养，当增殖培养基J2在培养下收获增殖材料不定芽，增殖材料不定芽继续接种至新的玻璃培养瓶中的增殖培养基J2上，用瓶塞塞住玻璃培养瓶的瓶口，将含有不定芽的增殖培养基J2的玻璃培养瓶横放于全自然光培养室中的培养架上，瓶口统一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培养条件为培养温度23-25℃，光照强度1000-3000lx，光照时间10-16h/d下培养，当增殖材料不定芽培养一个继代周期后进行接种转移，高小于3厘米的丛生芽插植于增殖培养基J2中，高大于3厘米的不定芽单株插植于生根培养基JR，如此循环，生根培养基JR上的不定芽长根后成为完整植株进行出瓶移栽。
实施例2：
1.材料：天湖金线莲(Anoectochilus roxburghii(wall)lindl.‘tianhu’)生长健壮、茎粗、叶片大、叶片网纹清晰且多、抗逆性、抗病虫害强的健康株系。
2.药品购买
购买植物组培苗生产所需的培养基成分中的常规的所有药品，将药品储存于干燥凉爽的室内待用。
3.母液配制
根据培养基配方要求，分门别类按组成成分配制其母液。药品逐一完全溶解，倒入选定的容量瓶内，最后定容。如遇加热才能溶解情况，需待溶液冷却后再定容。盛装母液的试剂瓶，应贴明显标签纸，写上母液名称、浓度和配制日期，配制好的母液放置冰箱(2～5℃)备用。
4.培养基配制
根据培养材料组培苗生产的要求，配制其增殖培养基和生根培养基，配制培养基按以下程序添加药品或母液：糖——无离子水——铁盐母液——大量元素母液——微量元素母液——维生素母液——甘氨酸母液——肌醇母液——植物生长调节剂母液——琼脂，调整pH至5.4-5.6，分别将100毫升的培养基灌装至每一500毫升的方形玻璃培养容器中，再将培养基立放于一长方体的消毒车上，整体推进配套的高压消毒锅中于1.06kg/cm2(121℃)条件下灭菌20min。
5.培养基冷却
当培养基灭菌完毕后，于培养基凝固之前把长方体的消毒车立起来，使方形玻璃培养瓶处于横放、瓶口朝左右方向状态进行冷却培养基，培养基凝固于玻璃培养瓶的一边上后待用。
6.外植体选择、消毒及诱导不定芽和形成无性繁殖系
于广东从化天湖金线莲原生地中(北纬23度37分至23度40分，东经113度36分至113度38分)，选取生长健壮、茎粗、叶片大、叶片网纹清晰且多、抗逆性、抗病虫害强的健康株系，用软毛刷在流水下将苗株表面小心洗净，去掉根、叶片和叶鞘，顶部未展开叶片可保留约1cm。用洗衣粉水浸泡，同时轻轻摇动约10min，清水洗净后拿至超净工作台。将处理好的金线莲茎条切成2cm左右带节茎段，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡30s，再在质量分数0.1％升汞中浸泡并摇动5～16min，无菌水冲洗3次后，用无菌纸吸干茎段表面水分，并切去两端各1～2mm，再接种到不定芽诱导培养基J1进行不定芽诱导，培养温度为(23±2)℃，光照度500～1000lx，光照12h/d，由此获得不定芽，不定芽进行继代培养，继代培养的培养基为不定芽诱导培养基J1，继代培养的条件同不定芽诱导，继代周期为35-40天，同继代培养4-5次后可获得大量的不定芽作为无性繁殖材料。
所述的不定芽诱导培养基J1每升含花宝1号2g，蛋白胨0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg，烟酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖15g，琼脂7g，pH 5.6。其配制方法是将花宝1号2g，蛋白胨0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg，烟酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖15g，琼脂7g加入到少量水中，然后用水定容至1L，调pH值至5.6，灭菌备用。
7.接种转移
按规定要求将步骤6的无性繁殖材料(不定芽)逐一细致观察，剔除污染材料，用体积分数75％酒精水溶液抹干净玻璃培养瓶表面，于玻璃培养瓶中装填增殖培养基J2。于超净工作台上，按正常的操作分切无性繁殖材料得到培养材料，从侧边开瓶口中从分切好的培养材料中把高小于3厘米的丛生芽插植于增殖培养基J2中和把高大于3厘米的不定芽单株插植于生根培养基JR。
所述的增殖培养基J2每升含花宝1号3g，蛋白胨0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg，烟酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖20g，琼脂7g，pH 5.4。其配制方法是：将花宝1号3g，蛋白胨0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg，烟酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖20g，琼脂7g溶于少量水中，然后用水定容至1L，调pH至5.4，灭菌备用。
所述的生根培养基JR每升含花宝1号3g，蛋白胨0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg，烟酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2mg，萘乙酸(NAA)5mg，活性碳500mg，蔗糖30g，琼脂6g，pH 5.6。其配制方法为：将花宝1号3g，蛋白胨0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4mg，烟酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2mg，萘乙酸(NAA)5mg，活性碳500mg，蔗糖30g，琼脂6g溶于少量水中，然后用水定容到1L，调pH值至5.6，灭菌备用。
8.全自然光照培养室的设计和培养
使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、降温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000Lux，顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000Lux，底层即顶层下第四层光照强度100～1000Lux。降温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～25℃。培养架宽为60厘米，高为200厘米，离地面10厘米为第四层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。
将接种有不定芽的增殖培养基J2和生根培养基JR的玻璃培养瓶横放于全自然光培养室中的培养架上，瓶口统一朝一方向，散射光能直接照射培养材料上，避免常规的立放的培养容器瓶盖对光的遮挡而影响培养材料对光的吸收；同时由于瓶口的侧开可有效避免培养室中的微粒进入培养容器中，污染发生小于0.5％，远低于通常污染率低于5％的要求。放置于培养温度(23-25)℃，光照强度1000-3000lx，光照时间10-16h/d下培养，当增殖培养基J2在培养下收获增殖材料不定芽，增殖材料不定芽继续接种至新的玻璃培养瓶中的增殖培养基J2上，用瓶塞塞住玻璃培养瓶的瓶口，将含有不定芽的增殖培养基J2的玻璃培养瓶横放于全自然光培养室中的培养架上，瓶口统一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培养条件为培养温度23-25℃，光照强度1000-3000lx，光照时间10-16h/d下培养，当增殖材料不定芽培养一个继代周期后进行接种转移，高小于3厘米的丛生芽插植于增殖培养基J2中，高大于3厘米的不定芽单株插植于生根培养基JR，如此循环，生根培养基JR上的不定芽长根后成为完整植株进行出瓶移栽。