一种缓解猕猴桃果树干旱胁迫的方法与流程

本发明属于果树栽培领域，具体涉及一种缓解猕猴桃果树干旱胁迫的方法。

背景技术：

随着全球气候异常和生态平衡的破坏，水资源短缺愈来愈成为人类面临的一个严重的生态问题。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的三分之一。我国干旱、半干旱地区约占国土面积的二分之一，即使在非干旱地区也经常会发生突发性干旱。干旱胁迫常常影响植物生长发育，造成作物严重减产，干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中占首位，仅次于生物胁迫病虫害造成的损失。

良好的生态环境是果树赖以生存的条件，对果树生长发育具有极其重要的影响。干旱给果树生产带来不可低估的损失，严重影响产量与品质，制约果树生产的发展。在生产栽培上猕猴桃是一种喜温但不耐热，不耐干旱的树种，其叶片肥大，输导组织发达，叶片和果实怕强光直射，对高温、水分胁迫敏感，易造成伤害。生产中干旱缺水易使猕猴桃产量降低，品质下降，造成经济损失，因此开展猕猴桃干旱胁迫的抗性研究是很有必要的。

目前，对于缓解猕猴桃干旱胁迫的研究不多，一般还是利用复水来进行处理。然而，对于缺水年份而言，大面积进行复水是不太现实的。虽然偶见利用脱落酸和黄腐酸钠来缓解猕猴桃干旱胁迫(如《复水与外源脱落酸处理对干旱胁迫下猕猴桃幼苗抗旱性的影响》和《黄腐酸钠增强猕猴桃幼苗抗旱能力的生理效应研究》)，然而其处理方法为叶面喷施，喷施全部树叶时，较为费时费力，且该方式对于药剂的浪费较为严重。另外，除了上述有限的处理方法之外，目前还未找到其它有效的、适合于猕猴桃干旱胁迫的处理方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种缓解猕猴桃果树干旱胁迫的方法，该方法包括如下步骤：

对猕猴桃实生苗浇灌浓度为50-200μmol/L的褪黑素，浇灌量为200ml，每隔2天浇灌一次，共4次。

所述实生苗的获得方法为：选取饱满的猕猴桃种子经4℃层积处理发芽后，播入营养钵(23cm×18cm)中(基质为草炭土：椰壳：珍珠岩＝2：2：1)，放在25±2℃的培养室中生长，白昼设置为12h/12h，到幼苗完全展开1片真叶时开始浇1/2Hoagland营养液，每周浇一次，其间用清水补充。待幼苗长到6片真叶时将营养钵转移到室外遮雨棚内，每个营养钵中3株幼苗，常规管理，每15天浇一次0.2％的尿素和磷酸二氢钾溶液，其间补充清水维持适宜的土壤湿度。

所述猕猴桃为野生中华猕猴桃。

优选的，褪黑素的浓度为100μmol/L。

优选的，褪黑素的浓度为200μmol/L。

浇灌褪黑素时，首次浇灌于7月份进行。每次浇灌褪黑素时，于当天傍晚进行。

褪黑素(melatonin)是一种吲哚类小分子物质，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，作为一种广谱的生理调节剂，褪黑素存在于绝大多数生物有机体中，从单细胞的藻类到高等植物，从鱼类、鸟类、哺乳动物到灵长类的人。在植物体内，褪黑素通过清除活性氧和自由基而具有强抗氧化作用，可以调节植物的生长和繁殖。

不过，褪黑素并非一定可以提高植物的抗逆性。本发明的发明人发现，利用褪黑素无法缓解高盐胁迫和重金属胁迫。另外，褪黑素对于蔬菜的干旱胁迫也没有效果。

通过对不同植物进行大量的实验，本发明的发明人发现，在众多胁迫中，褪黑素对于猕猴桃的干旱胁迫有着较好的缓解作用。

本发明的有益效果：

本发明可以显著提高干旱胁迫下当年生野生中华猕猴桃实生苗的叶片相对含水量，减少丙二醛对细胞膜的伤害，降低相对膜透性，降低脯氨酸和可溶性糖的浓度，抑制可溶性蛋白降解，维持较高的保护酶活性，使植物更好的适应干旱环境，增强植株的抗旱性。

附图说明

图1为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片相对含水量的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图2为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片过氧化氢含量的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图3为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片丙二醛含量的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图4为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片相对膜透性的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图5为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片脯氨酸含量的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图6为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片可溶性糖含量的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图7为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片可溶性蛋白含量的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图8为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片SOD活性的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图9为外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片POD活性的影响结果图；其中，不同的字母表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

试验材料为当年生野生中华猕猴桃实生苗。选取饱满的野生中华猕猴桃种子经4℃层积处理发芽后，播入营养钵(23cm×18cm)中(基质为草炭土：椰壳：珍珠岩＝2：2：1)，放在25±2℃的培养室中生长，白昼设置为12h/12h，到幼苗完全展开1片真叶时开始浇1/2Hoagland营养液，每周浇一次，其间用清水补充。待幼苗长到6片真叶时将营养钵转移到室外遮雨棚内，每个营养钵中3株幼苗，常规管理，每15天浇一次0.2％的尿素和磷酸二氢钾溶液，其间补充清水维持适宜的土壤湿度。

待幼苗适应遮雨棚环境正常生长后，于7月选取长势一致的野生中华猕猴桃实生苗分成五组，对照组(CK)和处理组(T1，T2，T3，T4)，进行褪黑素浇灌处理和自然干旱胁迫处理(表1)。褪黑素浇灌处理在傍晚19：00进行，对照组(CK)浇灌200ml清水，处理组(T1，T2，T3，T4)分别浇灌200ml浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每两天浇灌一次，共4次。干旱胁迫期间对照组(CK)正常浇水，处理组(T1，T2，T3，T4)不浇水，采用自然干旱的方式进行干旱胁迫，在干旱胁迫处理的第0天(以最后一次浇灌褪黑素溶液的第二天作为干旱胁迫第0天)采取对照组(CK)和第9天分别采取各组植株3～9叶位的叶片，用于各项生理指标测定，每处理6株，设3次重复。

表1褪黑素溶液浓度和干旱胁迫处理

试验方法：

生理指标测定

叶片相对含水量和游离脯氨酸含量测定均采用李合生的方法；相对膜透性用DDS-307型电导仪测定，相对膜透性＝(叶片煮沸前外渗液电导值/叶片煮沸后外渗液电导值)×100％；H₂O₂含量用林植芳等的方法；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法；采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用愈创木酚显色法测定过氧化物酶(POD)活性。上述指标均重复测定3次以上，以平均值作为各处理的实测值。

数据处理

采用Excel 2010计算试验数据，SPSS20.0进行统计分析，利用SigmaPlot 12.5软件作图。

结果与分析：

(1)外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片相对含水量和过氧化氢含量的影响：

叶片相对含水量(RWC)在一定程度上反应了植物抗旱性的强弱。由图1可知，干旱胁迫9天时，处理组的叶片相对含水量均显著下降，T1叶片相对含水量最低，比CK下降了29.32％，而T3和T4仅分别下降了3.98％和7.04％，其中T3叶片相对含水量最高，下降幅度最小，说明100μmol/L浓度的褪黑素处理保持叶片相对含水量的效果较好。此外，由图3可以看出，受干旱胁迫植株叶片过氧化氢含量显著升高，褪黑素浓度为0μmol/L的T1叶片过氧化氢含量最高，与对照相比增幅达到80.00％，T2增加53.33％。T3与T4受干旱胁迫9天后过氧化氢含量差异不显著，增幅分别为33.33％和31.33％，T4增幅最小。说明外源褪黑素处理可在一定程度上缓解干旱胁迫下猕猴桃叶片的失水情况，抑制过氧化氢含量的升高。

(2)外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片丙二醛含量和相对膜透性的影响：

细胞膜是逆境攻击的对象，丙二醛是膜质过氧化的产物，也是细胞膜被破坏的标志物质。图3和图4显示，干旱胁迫9天后MDA含量和相对膜透性均显著增大，说明活性氧的积累对细胞膜造成伤害，引起膜质过氧化的发生，膜透性增大。干旱胁迫9天后，T1的MDA含量较CK升高了133.80％，T2、T3和T4分别升高了75.32％、61.49％和50.79％，其中T3与T4的MDA含量相对较低且差异不显著。干旱胁迫9天后，处理组相对膜透性随褪黑素浓度升高而减小，当褪黑素浓度为200μmol/L时，相对膜透性最小。这表明，经褪黑素预处理的猕猴桃实生苗在干旱胁迫后，与未经褪黑素处理的相比膜脂过氧化水平明显降低，使膜脂过氧化产物MDA的累积量减少，减轻了对膜的伤害，相对膜透性下降。

(3)外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片脯氨酸含量和可溶性糖含量的影响

脯氨酸和可溶性糖是重要的渗透调节物质，在植物遭受逆境时大量合成，维持细胞内渗透势，保护膜系统稳定性，因此在抵抗逆境中起重要作用。从图5和图6可以看出，对照组的脯氨酸和可溶性糖含量在第0天和第9天变化不大；而干旱胁迫第9天，处理组脯氨酸含量和可溶性糖含量均显著升高，且两者的变化模式相似，T3和T4含量相对较低，两者差异不显著。干旱胁迫第9天，T1和T2脯氨酸含量分别是CK的2.43和2.25倍，两者差异不显著。干旱胁迫9天时，T1可溶性糖含量最高，是CK的5.24倍，T2、T3和T4可溶性糖含量分别是CK的4.04、2.06和2.44倍，说明干旱胁迫下可溶性糖积累明显，而褪黑素处理能显著抑制其积累，也说明褪黑素处理后植株更能适应干旱胁迫。这表明褪黑素处理在一定程度上缓解了干旱胁迫对猕猴桃实生苗的不利影响，增强植株对干旱的适应能力，其中100μmol/L和200μmol/L浓度的褪黑素处理效果较好。

(4)外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片可溶性蛋白含量的影响

植物在遭受干旱胁迫时，叶片可溶性蛋白合成速率会发生变化，而可溶性蛋白含量变化可以反映蛋白质合成、变性和降解的多方面信息。图7表明干旱胁迫9天后，处理组可溶性蛋白含量均不同程度的减少，T1和T2分别减少23.91％和24.71％，两者差异不显著，降幅均较大；处理组中T3可溶性蛋白含量相对较高，仅比照下降了4.18％，且两者可溶性蛋白含量差异不显著；T4较对照下降了13.17％。说明褪黑素处理可以缓解干旱胁迫下猕猴桃实生苗蛋白质的降解，以100μmol/L浓度的褪黑素处理效果最好。

(5)外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片保护酶活性的影响

在干旱胁迫下，植物体内形成了一套活性氧清除体系，其中SOD和POD是重要的保护酶。从图8中可以看出，干旱胁迫9天后，处理组的SOD活性大小顺序是T3>T4>T2>T1，其中T3的SOD活性与CK相差不大，T2与T1差异不显著，说明100μmol/L浓度的褪黑素预处理能维持干旱胁迫下植株较高的SOD活性。图9表明，干旱胁迫使POD活性显著升高，T1、T2、T3和T4的POD活性较CK分别升高了82.40％、44.81％、100.00％和120.99％，其中T4增幅最大，POD活性也显著高于其他处理，T3其次。表明褪黑素处理在维持干旱胁迫下猕猴桃实生苗较高的保护酶活性方面起着重要的作用，100μmol/L和200μmol/L浓度的褪黑素处理效果较好。

叶片相对含水量(RWC)是植株叶片细胞水分生理状态的反映，在一定程度上反映了植物组织水分亏缺程度，叶片RWC越高，植物叶片的抗脱水能力就强，抗旱性也强。干旱胁迫时，RWC降低的同时，自由基的代谢平衡被破坏，产生大量的自由基，导致生物膜过氧化，形成损坏膜系统的MDA，导致电解质外渗，相对膜透性增大。当植物遇到干旱胁迫时，会通过代谢活动增加细胞内渗透调节物质如脯氨酸和可溶性糖的浓度，使渗透势降低，水势降低，保持细胞持续吸水的能力，维持细胞膨压，使植物保证正常的生命活动。另外，干旱胁迫条件下，土壤中可利用水分减少,植物体尚未适应外界环境变化，导致根系吸水困难，水分缺失导致了植物体内蛋白质降解。干旱胁迫会导致植物细胞内活性氧自由基产生和清除的不平衡，对植物造成伤害，植物体内为保护自身免受伤害形成相应的抗氧化保护系统，如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)，它们在清除超氧自由基、过氧化氢和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面起着重要的作用。

本发明发现，外源褪黑素预处理能显著提高干旱胁迫下当年生野生中华猕猴桃实生苗的叶片相对含水量，减少MDA对细胞膜的伤害，降低相对膜透性，降低脯氨酸和可溶性糖的浓度，抑制可溶性蛋白降解，维持较高的保护酶活性，使植物更好的适应干旱环境，增强植株的抗旱性。以100μmol/L和200μmol/L浓度的褪黑素处理效果较好。对比实验例1

以巨峰葡萄扦插盆栽苗为试验材料。选取长势基本一致的盆栽苗，平均分成5组，对照组(CK)和处理组(H1，H2，H3，H4)，进行褪黑素浇灌处理和高温胁迫处理(表2)。褪黑素浇灌处理在傍晚19：00进行，对照组(CK)浇灌300ml清水，处理组(H1，H2，H3，H4)分别浇灌300ml浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每3天浇灌一次，共5次。褪黑素最后一次浇灌结束后的第2天，擦净盆栽苗叶片上的污渍，分别将对照组和处理组放入25±1℃培养箱中适应24h，光暗(8:00—20:00)/(20:00—8:00)，湿度为70％，光照为3000lx。适应后将处理组转移到45±1℃培养箱，湿度为70％，光照为3000lx，当温度刚升到45℃时记为高温胁迫0h，此时采取对照组的3～9叶位的叶片，再分别在高温胁迫4h和8h采取各组植株3～9叶位的叶片，测定MDA含量，过氧化氢含量和相对膜透性，每处理6株，设3次重复。

表2褪黑素溶液浓度和高温胁迫处理

试验方法和数据处理方法同上

结果分析：

(1)外源褪黑素对高温胁迫下巨峰葡萄叶片MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性的影响

MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性是反应植物受胁迫程度的3个重要生理指标。由表3可以看出，对巨峰葡萄根灌不同浓度褪黑素溶液后进行高温胁迫处理，随高温胁迫时间延长，MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性均呈升高趋势。高温胁迫后，各处理组MDA含量相比于对照显著升高，且8h的MDA含量显著高于4h的MDA含量，而在各处理组之间的MDA含量差异不显著。H₂O₂含量和相对膜透性的变化与MDA含量变化一致。说明根灌50-200μmol/L褪黑素溶液对巨峰葡萄高温胁迫没有缓解作用。

表3

注：不同的字母表示差异显著(P<0.05)

对比实验例2

以夏黑葡萄扦插盆栽苗为试验材料。选取长势基本一致的盆栽苗，平均分成5组，对照组(CK)和处理组(C1，C2，C3，C4)，进行褪黑素浇灌处理之后再干旱胁迫处理(表4)。褪黑素浇灌处理在傍晚19：00进行，对照组(CK)浇灌300ml清水，处理组(T1，T2，T3，T4)分别浇灌300ml浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每3天浇灌一次，共5次。干旱胁迫期间对照组(CK)正常浇水，处理组(C1，C2，C3，C4)不浇水，采用自然干旱的方式进行干旱胁迫，在干旱胁迫处理的第0天(以最后一次浇灌褪黑素溶液的第二天作为干旱胁迫第0天)采取对照组(CK)和第9天分别采取各组植株3～9叶位的叶片，用于测定MDA含量，过氧化氢含量和相对膜透性，每处理6株，设3次重复。

结果与分析：

(1)外源褪黑素对干旱胁迫下夏黑葡萄叶片MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性的影响

表4褪黑素溶液浓度和干旱胁迫处理

(2)试验方法和数据处理方法同上

MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性是反应植物受胁迫程度的3个重要生理指标。对夏黑葡萄根灌不同浓度褪黑素溶液后进行干旱胁迫处理，表5结果显示，干旱胁迫后，各处理组的MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性相对于对照组均显著升高。干旱第0天和第9天，对照组的MDA含量差异不显著；在干旱第9天，各处理组的MDA含量差异不显著。同样，过氧化氢含量和相对膜透性的变化趋势和MDA相近：干旱胁迫第9天，各处理组过氧化氢含量和相对膜透性均显著高于对照组，但各处理组之间差异不显著。说明，根灌50-200μmol/L褪黑素溶液不能缓解干旱胁迫对夏黑葡萄的伤害。

表5

注：不同的字母表示差异显著(P<0.05)。