浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法与流程

本发明属于植物组培领域，尤其是一种涉及浙江金线莲组织培养体系的建立方法。

背景技术：

浙江金线莲（Anoectochilus zhejiangensis）为兰科开唇兰属多年生珍稀草本植物，主要分布在浙江、福建等地，作为一种珍贵中草药，具有广阔的开发利用前景。浙江金线莲的生物学特性及药理活性与同属基原植物金线莲相近，对生长条件要求比较严格，自然萌发率不到千分之一，且自然繁殖时间长且繁殖率不高，再加上近年来人为大量采挖，导致浙江金线莲野生资源日趋枯竭，因此保护野生浙江金线莲已经到了刻不容缓的地步。

植物组织培养是保护濒危植物的有效技术手段，可在短时间内繁殖出大量新生植株。在组织培养中，培养基的筛选将直接影响到组织培养的成功与否，植物激素的浓度配比将直接影响到植株快繁的效率。因此培养基与激素配比的选择对组织培养的成功与否具有重要作用。

迄今有关金线莲基原植物，如中国台湾金线莲、金线莲、福建金线莲等快速繁殖体系的研究已有报道[王勇.金线莲组织培养新体系建立及优化.北方园艺,2010,13: 178-179；陈永快,林一心,邹晖等.福建金线莲和中国台湾金线莲的组培快繁技术.现代园艺,2008,10:9-12.]，并发现不同基原植物间的快速繁殖体系相差较大，但是关于浙江金线莲组织培养方面的研究尚属空白。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本申请提供了一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法。

一种浙江金线莲组织培养快速繁殖体系的建立方法，包括类原球茎诱导、增殖、分化及生根步骤，

其中，类原球茎的诱导、增殖及分化以MS为基本培养基，生根以1/2 MS为基本培养基，加入植物生长调节剂，pH 5.8，液体培养基蔗糖质量百分比浓度为5.0%，固体培养基蔗糖质量百分比浓度为3.0%，类原球茎分化培养基中添加质量含量10%香蕉泥；

１）类原球茎诱导：采用液体培养基或固体培养基，

液体培养基中含 TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.4 mg/L；

固体培养基含TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L；

2）类原球茎增殖：

增值培养基中含稀效唑1.5 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L，其中稀效唑是类原球茎增殖的主要因子；

3）类原球茎分化：对类原球茎进行分化培养，10天类原球茎球体顶部开始突起变尖，变绿，60 天后可分化成带有茎节、叶片及幼小毛状根的小苗，

分化培养基中含6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L；

4）植株生根：分化的幼苗在生根培养基中培养10 d后开始有根长出，生根培养基中含 NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L。

所述１）类原球茎诱导，取生长健康的无菌苗，在超净工作台上将其叶片从柄部切除，气生根从基部切除，将茎切成含2-4个节的茎段。

所述１）类原球茎诱导，采用液体培养基，第一次接种3 天后即更换培养基，以后每7 天更换1次培养基，90 r/min，光照时间12 h/d，3000 lx，温度为25℃。

所述类原球茎固体诱导、增殖、分化及生根的培养条件为：3000 lx，光照时间12 h/d，温度为25℃。

本发明的有益效果是，为了解决资源稀缺问题，有必要建立其快速繁殖的最优体系。因此本申请以浙江金线莲为材料，探讨不同植物激素配比对类原球茎诱导、增殖、分化及生根的影响，建立植株快速繁殖的最优体系，为浙江金线莲的扩大培养打下基础，也为今后对浙江金线莲成分等方面的研究及开发利用提供条件。同时研究结果对解决金线莲基原植物资源保护与合理利用之间的矛盾具有一定的指导意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是浙江金线莲类原球茎的诱导图；

图2是浙江金线莲类原球茎的增殖图；

图3是浙江金线莲类原球茎分化图；

其中A部分：分化培养10d；B部分：分化培养60d；

图4 是60 d后浙江金线莲的生根培养情况图，

其中A部分：4号培养基；B部分：7号培养基；

图5是120 d后浙江金线莲的生根培养情况图，

其中A部分：4号培养基，B部分：7号培养基；

图6是180 d后浙江金线莲的生根培养情况图，

其中A部分：4号培养基，B 部分：7号培养基。

具体实施方式

一、材料与方法

1.1 材料

浙江金线莲（ZJJ）组培苗由同济大学丽水中药研究院资源植物实验室提供。

1.2方法

1.2.1 培养基的配制

类原球茎的诱导、增殖及分化以MS为基本培养基，生根培养以1/2 MS为基本培养基，加入不同浓度的植物生长调节剂，pH 5.8，液体培养基蔗糖质量百分比浓度为5.0%，固体培养基蔗糖质量百分比浓度为3.0%，类原球茎分化培养基中额外添加10%香蕉泥。所有培养基121℃高压灭菌20 min，冷却备用。

1.2.2 类原球茎的诱导

液体培养诱导类原球茎。选取TDZ和NAA各0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L 3种浓度进行实验。取生长健康的无菌苗，在超净工作台上将其叶片从柄部切除，气生根从基部切除，将茎切成含2-4个节的茎段，随机接种到各组培养基中，每组4瓶，每瓶接种10个，第一次接种3 d后即更换培养基，以后每7 d更换1次培养基，接种31 d后统计诱导出类原球茎的茎段数，取平均值计算其诱导率。诱导率 =（诱导出类原球茎茎段数/接种茎段数）× 100% 。

固体培养诱导类原球茎。选取TDZ 0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L 、NAA 0.2 mg/L、0.4 mg/L和6-BA 2.0 mg/L共5种浓度配比组合进行实验。茎段处理与3.2.2.1相同，随机接种到各组培养基中，每组3瓶，每瓶7个-8个，每7 d更换1次培养基，接种30 d后统计诱导出类原球茎的茎段数，取平均值计算其诱导率及诱导效率。诱导率 =（诱导出类原球茎茎段数/接种茎段数）× 100% ；诱导效率 =（诱导出的类原球茎个数/接种茎段数）× 100%

1.2.3 类原球茎的增殖

选取稀效唑0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，6-BA1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L各3个浓度进行实验。将诱导出的带类原球茎的茎段随机接种到各组培养基中，每组5瓶，每瓶接种10个-15个，60 d统计结果，取平均值计算增殖系数。增殖系数 =（增殖出的类原球茎个数/接种茎段数）× 100% 。

1.2.4 类原球茎的分化

选取6-BA 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L各3种浓度进行实验。将增殖培养后的类原球茎切割成团，随机接种到各组培养基中，每组5瓶，每瓶接种5个类原球茎团，培养60 d统计分化情况，取平均值计算分化率。分化率 =（分化的类原球茎数/接种类原球茎数）× 100%。

1.2.5 生根培养

选取IBA和NAA各0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L 3种浓度进行实验。将分化培养得到的幼嫩小苗（约2.0 cm）随机接入生根培养基中，每组3瓶，每瓶接种7个-8个幼嫩小苗，每培养60 d统计生根情况，取平均值计算生根率。生根率 =（生根幼嫩小苗数/接种幼嫩小苗数）× 100% 。

1.2.6 培养条件

类原球茎液体诱导的培养条件为：90 r/min，光照时间12 h/d，3000 lx，25℃；

类原球茎固体诱导、增殖、分化及生根的培养条件为：3000 lx，光照时间12 h/d，温度为25℃。

二、结果与分析

2.1 类原球茎的诱导

2.1.1 液体培养诱导类原球茎

茎段经诱导培养10 d后，节间部位形成2个-6个乳白色类原球茎（图1），培养30 d后统计诱导出类原球茎的茎段数，如表1。结果表明：TDZ和NAA配合使用能诱导浙江金线莲茎段长出类原球茎，但不同的激素对类原球茎的诱导效果影响不同。当TDZ浓度一定时，随着NAA浓度的增加类原球茎的诱导率没有明显变化，例如TDZ浓度为0.2 mg/L，NAA浓度分别为0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L 时，类原球茎的诱导率依次为10.8%、12.5%、9.2%。当NAA浓度一定时，随着TDZ浓度的增加，类原球茎的诱导率有较为显著地提高，例如当NAA浓度为0.2 mg/L，TDZ的浓度分别为0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L时，类原球茎的诱导率依次为10.8%、29.2%、50.0%。可见TDZ对类原球茎的诱导效果的影响大于NAA。在所有激素配比中，8号培养基类原球茎的诱导率最高，达到62.5%。因此，优选的诱导条件为TDZ和NAA的浓度分别为0.6 mg/L和0.4 mg/L。

2.1.2 固体培养诱导类原球茎

与液体培养诱导类原球茎类似，固体诱导培养一周左右，在茎段节间部位开始出现乳白色类原球茎。培养30 d后统计诱导出类原球茎的茎段数，结果如表2所示。TDZ、NAA和6-BA按不同的配比使用均能诱导浙江金线莲茎段长出类原球茎，但不同激素配比对金线莲类原球茎的诱导效果不同，从诱导率来看3号、4号、5号培养基的诱导能力均较好，类原球茎的诱导率在3者间不存在明显的差异，其中3号培养基的诱导率最高，达到68.0%。从诱导效率来看，5号培养基的诱导效率最高，为144.6%，显著高于其他4组。因此综合诱导率与诱导效率，固体培养基中类原球茎诱导优选条件为TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L。

2.2 类原球茎的增殖

将诱导出类原球茎的茎段转移至固体增殖培养基上，培养60 d后观察到新增殖的类原球茎数量众多、生长旺盛（见图2）。统计类原球茎个数，计算增殖系数，结果见表3。结果表明：稀效唑、6-BA和NAA配合使用能有效使浙江金线莲类原球茎增殖，且不同的激素配比对类原球茎的增殖效果存在差异，其中第8号培养基的增殖系数最高，为8.4。从极差R值分析可知，稀效唑对类原球茎的增殖起主要作用，其次为6-BA，影响最小的是NAA。根据k值大小，可以得出类原球茎增殖的优选条件为稀效唑1.5 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。

2.2.1 类原球茎的分化

对类原球茎进行分化培养，10 d左右类原球茎球体顶部开始突起变尖，变绿，然后逐渐伸长，分化出嫩芽（图3 A），60 d后可分化成带有茎节、叶片及幼小毛状根的小苗（图3 B）。对分化的类原球茎数进行统计，并计算分化率。结果如表4所示，不同的激素配比对类原球茎的分化效果产生不同影响。当6-BA浓度一定时，随着NAA浓度的增加，分化率逐渐降低，例如，当6-BA浓度为1.0 mg/L，NAA浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L时，分化率分别为73.3%、65.3%、57.3%。当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度的增加，分化率逐渐降低，例如，当NAA浓度为0.2mg/L，6-BA浓度为0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L时，分化率分别为81.3%、65.3%、46.7%。因此1号培养基的分化率最高，分化的优选条件为6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L。

2.2.2 生根培养

分化的幼苗在生根培养基中培养10 d后开始有根长出，生根培养60 d后统计生根数及植株生长状况（图4），计算生根率，结果如表5所示。7种培养基均能诱导浙江金线莲生根，且不同激素配比对生根效果的影响不同，其中1-6号培养基的生根率都达到了100%，但是从生根数、根长等植株生长的整体状况看，4号培养基的生长状况最好，平均根数为1.51条，根长为1.53 cm，株高7.90 cm，茎节数6.50个，7号培养基的生长状况最差，生根率仅为70%，株高、茎节数、平均根数等指标均低于其他6组培养基。因此浙江金线莲生根培养的优选条件为1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L。

60 d后，即累计培养120 d再次观察和统计植株生根状况（图5），结果如表6所示，随着培养时间的延长，根不断增多变长，植株不断生长。从整体上看4号培养基和6号培养基中植株生长状况都较好，平均株高、茎节数、根长及根数在2者间均无显著差异。7号培养基的平均株高、茎节数、根长、根数及生根率也都有所增加，生根率达到92%，但相比其他几组整体生长状况依然最差。

60 d后即累计培养180 d，再次观察植株的生根状况（图6），结果如表7所示。植株整体都在不断生长，7组植株间生长状况的差距逐渐减小，其中7号培养基中的植株的生根率达到了100%，可见随着培养时间的延长，生根率不断增加，但其生长状况与其他组比依然较差。生长状况较好的为4号培养基和5号培养基。

综合3次实验结果发现，随着培养时间的延长，生根数不断增多，根不断变长，平均株高不断增长，诱导率不断升高，在4号培养基上浙江金线莲植株生长状况一直最好，7号培养基上的生长状况则始终最差。可见优选的生根培养条件为1/2 MS + NAA1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L，生根率可达100%。

在建立浙江金线莲快速繁殖体系的过程中发现，不同浓度的植物激素配比对类原球茎的诱导、增殖、分化及生根产生较大的影响。

对于类原球茎的诱导，在不同的培养基中，优选激素配比不同。在液体培养和固体培养中优选类原球茎诱导条件分别为TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.4 mg/L和TDZ 0.6 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L，诱导率分别为62.5%，59.3%。类原球茎增殖、分化、生根的优选激素组合依次为：稀效唑1.5 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L、6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L、1/2 MS + NAA 1.0 mg/L + IBA 1.0 mg/L，增殖系数、分化率、生根率分别为8.4、87.3%、100%，其中稀效唑是促进类原球茎增殖的主要因子。