本发明主要涉及种植
技术领域：
，尤其涉及一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法。
背景技术：
：瓜蒌，又名栝楼、药瓜等，为多年生草质滕本全株供药用的葫芦科栝楼属植物，果壳中药名瓜蒌，种子中药名瓜蒌仁，根中药名天花粉。全瓜蒌入药能清热散结，润肺化痰，养胃生津等，天花粉针剂临床上用于妇女中期妊娠、死胎、流产，并对癌细胞滋生有明显的抑制作用。目前瓜蒌的种植方法多采用种子繁殖和分根繁殖，种子繁殖需要的时间较长，而且雌雄株比例严重不协调，分根繁殖发芽较慢，而且需要将块根挖出，浪费了大量的天花粉，目前瓜蒌的组织培养快繁技术才开始起步，诱导分化阶段需要25~30天才能出现诱导的细胞突起，需要的时间较长，因此，需要一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法。技术实现要素：为了弥补已有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法。一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法，包括以下步骤：（1）外植体选取和处理：选择生长旺盛、结果较多、抗逆性强的优良植株，从叶柄处剪取嫩叶，不会对瓜蒌植株造成伤害，不影响瓜蒌的生长和结果，而且嫩叶来源广泛，任何时期均可以进行组织培养，种植效率明显提高，直接置于4~6℃、质量浓度为2.1~2.3%的食盐水中进行浸泡25~30分钟，取出后再置于22~24℃、体积分数为3~4%的醋酸溶液中浸泡40~45分钟，流水冲洗20分钟后置于营养液中浸泡2~3小时，再用无菌水冲洗冲洗3~4次，营养均衡，促进吸收，抑制病原微生物繁殖，可以避免使用过多的消毒液反复进行浸泡消毒，简化操作过程，节约成本，而且可以使外植体在微酸的环境中继续吸收和积累营养，加快成活和外植体诱导分化的过程，在超净工作台上斜剪叶柄底端少许，得外植体；（2）培养基的配制：配制b5培养基为基础培养基，再加入辅料，加热搅拌至完全溶解，调节ph为5.8~6.0，分装于培养瓶内，于121℃灭菌20分钟，得培养基；（3）外植体接种：在超净工作台上，将外植体伤口处斜面朝下，斜插于培养基上，外植体与培养基的夹角为45~55°，每瓶接种一个外植体，接种后在接种处滴加1滴米糠提取物，能够使伤口充分接触营养成分，富含矿物成分，促进营养成分的吸收，加快伤口愈合，增加米糠的利用途径，变废为宝，节约种植成本，得接种培养瓶；（4）诱导分化培养：将接种培养瓶置于培养室内，1~6天，温度为22~23℃、湿度为86~88%、间歇光照为1600~1800lx、光照8小时、黑暗4小时，增强外植体的环境适应能力和抗逆性，适合突然较浓的营养成分，间歇式光照能够加快光合作用，促进外植体内营养成分的积累和愈伤组织形成及分化，7~25天，温度为26~27℃、湿度为91~92%、间歇光照为2100~2300lx、光照9小时、黑暗3小时，能够加快对营养成分的吸收，促进伤口的愈合和分化，缩短培养时间，增强抗逆性，提高后期的炼苗成活率，明显节约种植成本，得诱导分化苗。所述步骤（1）的营养液，由以下重量份的原料制成：银耳提取物1.3~1.5、花生衣提取物1.1~1.3、芸苔素内酯0.13~0.15、发酵淘米水900~1000；所述的银耳提取物，含量为30%。所述的花生衣提取物，是将花生衣洗净，粉碎，加入花生衣重量50~55倍量的体积分数为76~78%的酒精溶液，于56~58℃、32~34khz超声30~35分钟，过滤，重复超声3次，每次超声减少5分钟，合并所有滤液，烘干至含水量6~8%，得花生衣提取物。所述的发酵淘米水，将第1~2次淘米时的水混合，向淘米水中加入混合菌，混合均匀，发酵4~5天，得发酵淘米水。所述的混合菌，由以下重量份的原料组成：啤酒酵母22~24、醋酸菌16~18、嗜热链球菌16~18、德氏乳杆菌11~13。所述步骤（2）的辅料，由以下质量浓度的原料组成：白砂糖21~23g/l、琼脂6.2~6.4g/l、复硝酚钠0.5~0.7g/l、氨茶碱0.24~0.26mg/l、缩节胺0.13~0.15mg/l，在提供基础营养的同时，氨茶碱和缩节胺能够保持外植体的细胞活性，加快营养的吸收，增加氨茶碱和缩节胺的新的应用方法，促进外植体愈伤组织形成，加快诱导和分化，增强抗逆性。所述步骤（3）的米糠提取物，将米糠粉碎至80~100目，加入米糠重量8~10倍量的水，混合均匀，加入淀粉酶和纤维素酶的混合酶，使混合酶的质量分数为0.03~0.05%，于38~40℃搅拌酶解180~200分钟，于126~128℃蒸煮30~35分钟，过滤后再加入米糠重量8~10倍量的水，反复蒸煮4次，合并所有滤液，加热浓缩至体积为原来的1/5，得米糠提取物。所述的混合酶，淀粉酶和纤维素酶的重量比为4~5:1~2。本发明的优点是：本发明提供的一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法，方法简单，加快瓜篓组织培养时的诱导分化，b5培养基培养16天后开始产生黄绿色细胞突起，接着出现分化的芽丛，明显缩短诱导分化的时间，提高种植效率，经济收入提高16.2%；以优良植株的嫩叶作为外植体，不会对瓜蒌植株造成伤害，不影响瓜蒌的生长和结果，而且嫩叶来源广泛，任何时期均可以进行组织培养，种植效率明显提高；外植体剪取后分别用食盐水、醋酸溶液及营养液处理，营养液由多种原料组成，营养均衡，促进吸收，抑制病原微生物繁殖，可以避免使用过多的消毒液反复进行浸泡消毒，简化操作过程，节约成本，而且可以使外植体在微酸的环境中继续吸收和积累营养，加快成活和外植体诱导分化的过程；用b5培养基进行培养，在培养基中加入多种辅料，在提供基础营养的同时，氨茶碱和缩节胺能够保持外植体的细胞活性，加快营养的吸收，增加氨茶碱和缩节胺的新的应用方法，促进外植体愈伤组织形成，加快诱导和分化，增强抗逆性；接种时将外植体进行斜插，增加与培养基的接触面积，接种后在接种处滴加米糠提取物，能够使伤口充分接触营养成分，富含矿物成分，促进营养成分的吸收，加快伤口愈合，增加米糠的利用途径，变废为宝，节约种植成本；培养时先进行低温培养，增强外植体的环境适应能力和抗逆性，适合突然较浓的营养成分，间歇式光照能够加快光合作用，促进外植体内营养成分的积累和愈伤组织形成及分化，提高温度后，能够加快对营养成分的吸收，促进伤口的愈合和分化，缩短培养时间，增强抗逆性，使后期的炼苗成活率高达97.6%，明显节约种植成本。具体实施方式下面用具体实施例说明本发明。实施例1一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法，包括以下步骤：（1）外植体选取和处理：选择生长旺盛、结果较多、抗逆性强的优良植株，从叶柄处剪取嫩叶，不会对瓜蒌植株造成伤害，不影响瓜蒌的生长和结果，而且嫩叶来源广泛，任何时期均可以进行组织培养，种植效率明显提高，直接置于4℃、质量浓度为2.1%的食盐水中进行浸泡25分钟，取出后再置于22℃、体积分数为3%的醋酸溶液中浸泡40分钟，流水冲洗20分钟后置于营养液中浸泡2小时，再用无菌水冲洗冲洗3~4次，营养均衡，促进吸收，抑制病原微生物繁殖，可以避免使用过多的消毒液反复进行浸泡消毒，简化操作过程，节约成本，而且可以使外植体在微酸的环境中继续吸收和积累营养，加快成活和外植体诱导分化的过程，在超净工作台上斜剪叶柄底端少许，得外植体；（2）培养基的配制：配制b5培养基为基础培养基，再加入辅料，加热搅拌至完全溶解，调节ph为5.8~6.0，分装于培养瓶内，于121℃灭菌20分钟，得培养基；（3）外植体接种：在超净工作台上，将外植体伤口处斜面朝下，斜插于培养基上，外植体与培养基的夹角为45~55°，每瓶接种一个外植体，接种后在接种处滴加1滴米糠提取物，能够使伤口充分接触营养成分，富含矿物成分，促进营养成分的吸收，加快伤口愈合，增加米糠的利用途径，变废为宝，节约种植成本，得接种培养瓶；（4）诱导分化培养：将接种培养瓶置于培养室内，1~6天，温度为22℃、湿度为86%、间歇光照为1600lx、光照8小时、黑暗4小时，增强外植体的环境适应能力和抗逆性，适合突然较浓的营养成分，间歇式光照能够加快光合作用，促进外植体内营养成分的积累和愈伤组织形成及分化，7~25天，温度为26℃、湿度为91%、间歇光照为2100lx、光照9小时、黑暗3小时，能够加快对营养成分的吸收，促进伤口的愈合和分化，缩短培养时间，增强抗逆性，提高后期的炼苗成活率，明显节约种植成本，得诱导分化苗。所述步骤（1）的营养液，由以下重量份的原料制成：银耳提取物1.3、花生衣提取物1.1、芸苔素内酯0.13、发酵淘米水900；所述的银耳提取物，含量为30%。所述的花生衣提取物，是将花生衣洗净，粉碎，加入花生衣重量50倍量的体积分数为76%的酒精溶液，于56℃、32khz超声30分钟，过滤，重复超声3次，每次超声减少5分钟，合并所有滤液，烘干至含水量6~8%，得花生衣提取物。所述的发酵淘米水，将第1~2次淘米时的水混合，向淘米水中加入混合菌，混合均匀，发酵4~5天，得发酵淘米水。所述的混合菌，由以下重量份的原料组成：啤酒酵母22、醋酸菌16、嗜热链球菌16、德氏乳杆菌11。所述步骤（2）的辅料，由以下质量浓度的原料组成：白砂糖21g/l、琼脂6.2g/l、复硝酚钠0.5g/l、氨茶碱0.24mg/l、缩节胺0.13mg/l，在提供基础营养的同时，氨茶碱和缩节胺能够保持外植体的细胞活性，加快营养的吸收，增加氨茶碱和缩节胺的新的应用方法，促进外植体愈伤组织形成，加快诱导和分化，增强抗逆性。所述步骤（3）的米糠提取物，将米糠粉碎至80目，加入米糠重量8倍量的水，混合均匀，加入淀粉酶和纤维素酶的混合酶，使混合酶的质量分数为0.03%，于38℃搅拌酶解180分钟，于126℃蒸煮30分钟，过滤后再加入米糠重量8倍量的水，反复蒸煮4次，合并所有滤液，加热浓缩至体积为原来的1/5，得米糠提取物。所述的混合酶，淀粉酶和纤维素酶的重量比为4:1。实施例2一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法，包括以下步骤：（1）外植体选取和处理：选择生长旺盛、结果较多、抗逆性强的优良植株，从叶柄处剪取嫩叶，不会对瓜蒌植株造成伤害，不影响瓜蒌的生长和结果，而且嫩叶来源广泛，任何时期均可以进行组织培养，种植效率明显提高，直接置于5℃、质量浓度为2.2%的食盐水中进行浸泡28分钟，取出后再置于23℃、体积分数为3%的醋酸溶液中浸泡40分钟，流水冲洗20分钟后置于营养液中浸泡2.5小时，再用无菌水冲洗冲洗3~4次，营养均衡，促进吸收，抑制病原微生物繁殖，可以避免使用过多的消毒液反复进行浸泡消毒，简化操作过程，节约成本，而且可以使外植体在微酸的环境中继续吸收和积累营养，加快成活和外植体诱导分化的过程，在超净工作台上斜剪叶柄底端少许，得外植体；（2）培养基的配制：配制b5培养基为基础培养基，再加入辅料，加热搅拌至完全溶解，调节ph为5.8~6.0，分装于培养瓶内，于121℃灭菌20分钟，得培养基；（3）外植体接种：在超净工作台上，将外植体伤口处斜面朝下，斜插于培养基上，外植体与培养基的夹角为45~55°，每瓶接种一个外植体，接种后在接种处滴加1滴米糠提取物，能够使伤口充分接触营养成分，富含矿物成分，促进营养成分的吸收，加快伤口愈合，增加米糠的利用途径，变废为宝，节约种植成本，得接种培养瓶；（4）诱导分化培养：将接种培养瓶置于培养室内，1~6天，温度为22℃、湿度为87%、间歇光照为1700lx、光照8小时、黑暗4小时，增强外植体的环境适应能力和抗逆性，适合突然较浓的营养成分，间歇式光照能够加快光合作用，促进外植体内营养成分的积累和愈伤组织形成及分化，7~25天，温度为26.5℃、湿度为91%、间歇光照为2200lx、光照9小时、黑暗3小时，能够加快对营养成分的吸收，促进伤口的愈合和分化，缩短培养时间，增强抗逆性，提高后期的炼苗成活率，明显节约种植成本，得诱导分化苗。所述步骤（1）的营养液，由以下重量份的原料制成：银耳提取物1.4、花生衣提取物1.2、芸苔素内酯0.14、发酵淘米水1000；所述的银耳提取物，含量为30%。所述的花生衣提取物，是将花生衣洗净，粉碎，加入花生衣重量53倍量的体积分数为77%的酒精溶液，于57℃、33khz超声33分钟，过滤，重复超声3次，每次超声减少5分钟，合并所有滤液，烘干至含水量6~8%，得花生衣提取物。所述的发酵淘米水，将第1~2次淘米时的水混合，向淘米水中加入混合菌，混合均匀，发酵4~5天，得发酵淘米水。所述的混合菌，由以下重量份的原料组成：啤酒酵母23、醋酸菌17、嗜热链球菌17、德氏乳杆菌12。所述步骤（2）的辅料，由以下质量浓度的原料组成：白砂糖22g/l、琼脂6.3g/l、复硝酚钠0.6g/l、氨茶碱0.25mg/l、缩节胺0.14mg/l，在提供基础营养的同时，氨茶碱和缩节胺能够保持外植体的细胞活性，加快营养的吸收，增加氨茶碱和缩节胺的新的应用方法，促进外植体愈伤组织形成，加快诱导和分化，增强抗逆性。所述步骤（3）的米糠提取物，将米糠粉碎至100目，加入米糠重量9倍量的水，混合均匀，加入淀粉酶和纤维素酶的混合酶，使混合酶的质量分数为0.04%，于39℃搅拌酶解180分钟，于127℃蒸煮33分钟，过滤后再加入米糠重量9倍量的水，反复蒸煮4次，合并所有滤液，加热浓缩至体积为原来的1/5，得米糠提取物。所述的混合酶，淀粉酶和纤维素酶的重量比为5:2。实施例3一种促进瓜蒌组培育苗分化的方法，包括以下步骤：（1）外植体选取和处理：选择生长旺盛、结果较多、抗逆性强的优良植株，从叶柄处剪取嫩叶，不会对瓜蒌植株造成伤害，不影响瓜蒌的生长和结果，而且嫩叶来源广泛，任何时期均可以进行组织培养，种植效率明显提高，直接置于6℃、质量浓度为2.3%的食盐水中进行浸泡30分钟，取出后再置于24℃、体积分数为4%的醋酸溶液中浸泡45分钟，流水冲洗20分钟后置于营养液中浸泡3小时，再用无菌水冲洗冲洗3~4次，营养均衡，促进吸收，抑制病原微生物繁殖，可以避免使用过多的消毒液反复进行浸泡消毒，简化操作过程，节约成本，而且可以使外植体在微酸的环境中继续吸收和积累营养，加快成活和外植体诱导分化的过程，在超净工作台上斜剪叶柄底端少许，得外植体；（2）培养基的配制：配制b5培养基为基础培养基，再加入辅料，加热搅拌至完全溶解，调节ph为5.8~6.0，分装于培养瓶内，于121℃灭菌20分钟，得培养基；（3）外植体接种：在超净工作台上，将外植体伤口处斜面朝下，斜插于培养基上，外植体与培养基的夹角为45~55°，每瓶接种一个外植体，接种后在接种处滴加1滴米糠提取物，能够使伤口充分接触营养成分，富含矿物成分，促进营养成分的吸收，加快伤口愈合，增加米糠的利用途径，变废为宝，节约种植成本，得接种培养瓶；（4）诱导分化培养：将接种培养瓶置于培养室内，1~6天，温度为23℃、湿度为88%、间歇光照为1800lx、光照8小时、黑暗4小时，增强外植体的环境适应能力和抗逆性，适合突然较浓的营养成分，间歇式光照能够加快光合作用，促进外植体内营养成分的积累和愈伤组织形成及分化，7~25天，温度为27℃、湿度为92%、间歇光照为2300lx、光照9小时、黑暗3小时，能够加快对营养成分的吸收，促进伤口的愈合和分化，缩短培养时间，增强抗逆性，提高后期的炼苗成活率，明显节约种植成本，得诱导分化苗。所述步骤（1）的营养液，由以下重量份的原料制成：银耳提取物1.5、花生衣提取物1.3、芸苔素内酯0.15、发酵淘米水1000；所述的银耳提取物，含量为30%。所述的花生衣提取物，是将花生衣洗净，粉碎，加入花生衣重量55倍量的体积分数为78%的酒精溶液，于58℃、34khz超声35分钟，过滤，重复超声3次，每次超声减少5分钟，合并所有滤液，烘干至含水量6~8%，得花生衣提取物。所述的发酵淘米水，将第1~2次淘米时的水混合，向淘米水中加入混合菌，混合均匀，发酵4~5天，得发酵淘米水。所述的混合菌，由以下重量份的原料组成：啤酒酵母24、醋酸菌18、嗜热链球菌18、德氏乳杆菌13。所述步骤（2）的辅料，由以下质量浓度的原料组成：白砂糖23g/l、琼脂6.4g/l、复硝酚钠0.7g/l、氨茶碱0.26mg/l、缩节胺0.15mg/l，在提供基础营养的同时，氨茶碱和缩节胺能够保持外植体的细胞活性，加快营养的吸收，增加氨茶碱和缩节胺的新的应用方法，促进外植体愈伤组织形成，加快诱导和分化，增强抗逆性。所述步骤（3）的米糠提取物，将米糠粉碎至100目，加入米糠重量10倍量的水，混合均匀，加入淀粉酶和纤维素酶的混合酶，使混合酶的质量分数为0.05%，于40℃搅拌酶解200分钟，于128℃蒸煮35分钟，过滤后再加入米糠重量10倍量的水，反复蒸煮4次，合并所有滤液，加热浓缩至体积为原来的1/5，得米糠提取物。所述的混合酶，淀粉酶和纤维素酶的重量比为5:1。对比例1步骤（1）中的嫩叶改为茎尖，其余方法，同实施例1。对比例2去除步骤（1）中的食盐水、醋酸溶液及营养液浸泡，改为传统的消毒，其余方法，同实施例1。对比例3步骤（2）中的b5培养基改为ms培养基，其余方法，同实施例1。对比例4去除步骤（2）中的辅料，其余方法，同实施例1。对比例5步骤（3）中的外植体进行垂直接种，去除米糠油提取物，其余方法，同实施例1。对比例6步骤（4）中的培养条件一直保持温度为26℃、湿度为91%、光照为2100lx、每天连续光照10小时，其余方法，同实施例1。对比例7现有传统的促进瓜蒌组培育苗分化方法。实施例和对比例促进瓜蒌组培育苗分化方法的促进效果：分别选择同一优良瓜蒌的嫩叶和茎尖，分别用实施例和对比例的促进瓜蒌组培育苗分化方法进行组培，每组培养100瓶，在培养16天时观察每组开始分化的外植体，计算分化率，培养炼苗后在安徽省蚌埠地区进行栽植，观察成活率，实施例和对比例促进瓜蒌组培育苗分化方法的促进效果见表1。表1：实施例和对比例促进瓜蒌组培育苗分化方法的促进效果项目分化率（%）炼苗成活率（%）栽植成活率（%）实施例19896.693.6实施例29797.694.7实施例39896.593.9对比例19496.392.8对比例27490.294.2对比例37989.491.7对比例47584.392.2对比例57889.591.3对比例68286.790.8对比例71383.488.5从表1的结果表明，实施例的促进瓜蒌组培育苗分化的方法，分化率、炼苗成活率及栽植成活率明显较对比例高，说明本发明提供的促进瓜蒌组培育苗分化的方法具有很好的育苗效果。当前第1页12