一种川西獐牙菜生态抚育方法与流程

本发明属于高原药材生产领域，具体涉及一种川西獐牙菜生态抚育方法。

背景技术：

川西獐牙菜(swertiamussotiifranch.)属龙胆科(gentianaceae)獐牙菜属(swertial.)植物，主要分布于青海省的称多、玉树、囊谦、班玛等青南地区以及西藏自治区的昌都和四川省的甘孜州、阿坝州以及甘肃省的甘南地区，生长于海拔3200～4400m的山坡、灌丛草地、林缘、路边、河滩以及弃耕地。川西獐牙菜是藏因陈药材的原植物和重要的代表性品种之一，以全草入药，具有清热解毒、疏肝利胆的功能，是治疗肝胆系统疾病的有效药物，为藏族民间常用单方或复方上品草药。

现代药理学试验证明，川西獐牙菜中的獐牙菜苦苷具有镇痛、解挛、健胃、抗肿瘤作用，龙胆苦苷可保肝、抗炎、抗疟原虫、促进毛发生长,芒果苷和异荭草苷具有保肝、抗氧化、降血糖、抗炎等作用，可作为川西獐牙菜药材质量控制的依据。

近年来，随着我国民族医药产业的迅速发展，川西獐牙菜的需求量快速增加，市场上的川西獐牙菜主要来源于野生资源，长期采挖野生川西獐牙菜，特别是在其生长阶段的花果期大量采收，加之种子萌发率低，导致其资源量锐减和逐渐枯竭，地域分布亦日益狭窄，也对高原脆弱的生态环境造成了严重破坏，加剧了高原草场退化和水土流失等生态问题，对藏茵陈相关医药产业的发展十分不利。

前期发明人也曾采用人工栽培方法繁育成功了川西獐牙菜药材，但是在不断的实践过程中也发现存在一定问题，比如采取传统的人工栽培方式，经过多代种植后，会导致川西獐牙菜药材品种混杂、品质退化、病虫害严重等问题，导致药材减产和质量下降，同样制约了藏茵陈产业的发展。

生态抚育(ecologicaltending)作为药材生产的一个新方向，是指在最大限度避免对资源繁育地原有生态环境造成不良影响的前提下，在开展优良种质资源选择、适宜抚育区选择等人为辅助措施的基础上，将抚育目标资源种类的优质繁育种源大规模合理散布于适宜天然生境中，使其利用自然生境条件完成其生活史周期，最终成为可利用资源并大幅提升目标资源种类可持续利用能力的资源种类繁育模式，该资源繁育模式是能够继续保持群落平衡、稳定的一种生产方式，是野生药材采集与栽培药材种植的有机结合，既可保护数量日渐减少的野生川西獐牙菜，又能满足不断增长的市场需要，促进其可持续发展，因此开展川西獐牙菜生态抚育势在必行。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种川西獐牙菜道地药材的生态抚育方法。

本发明提供了一种川西獐牙菜生态抚育方法，它包括以下步骤：

(1)优良种质资源的选择及处理：选取千粒重不小于0.076g的川西獐牙菜种子，置于-10℃～0℃的环境中放置6个月，维持湿度为60～80％；播种前用浓度为150～200ppm的赤霉素浸泡6h；

(2)抚育区选择：以原有野生川西獐牙菜自然分布区或与自然分布区相似生境的弃耕地为抚育区；

(3)生态抚育：选地、施基肥，取步骤(1)浸泡后的川西獐牙菜种子，播种；

(4)采收，即可。

其中，步骤(1)中，所述种子为川西獐牙菜野生种子或野生种子选育的第二代至第三代种子。

其中，步骤(2)中，野生川西獐牙菜自然分布区为：青海或其毗邻地区海拔为3200～4400m，年降水量大于400mm，土壤疏松，中性或偏碱性的沙质壤土或砂石地，阳性山坡或半阴坡，原生植被为林缘、路边以杂类草为主的河谷谷地稀疏灌丛或农田边稀疏灌丛。

其中，抚育区的海拔为3500～4200m；进一步地，抚育区的海拔为3700m。

其中，抚育区为青海省玉树州通天河流域或与其生境相似的环境中；进一步地，抚育区为玉树市仲达乡。

其中，步骤(3)中，所选地块的土壤为排水良好、质地疏松、富含腐殖质的土壤；所施基肥为有机肥，其有机质含量大于30％，施肥量为2000～2500kg/亩。

有机肥(organicfertilizer)：指采用生物发酵技术处理手段生产，经检测达到规定质量要求的有机肥料。

其中，步骤(3)中，播种的方式为：将种子与沙拌匀后撒播，种子量为250～400g/亩；然后覆土，深度为0.2～0.5cm；浅耙，轻碾，覆盖枯草或碎麦秸，厚度为1～2cm。

其中，步骤(3)中，播种的时期为春播，时间为4月中下旬～5月初，土壤地表温度大于0℃即可；和/或，播种时，将种子与细沙按照1:30～1:50的比例拌匀。

细沙：为粒径过100目筛的沙子，以浸水后沙子可以握成团为宜。

其中，步骤(3)中，播种后第二年出苗后可在雨前施用一次有机肥，施肥量为1500～2000kg/亩。

其中，步骤(4)中，所述采收是在抚育后第二年8～10月初的盛花期，进行采收。

本发明提供的生态抚育方法，通过选择特定的种质资源、播种方法及抚育条件，得到的川西獐牙菜药材产量稳定，活性成分含量高，品质优良。本发明方法不仅可以培育出地道的优质川西獐牙菜药材，而且操作简便易行，在田间管理上无需较多人工投入，无需灌溉浇水，成本低，经济节约；同时有效地保护了当地生态环境，对抚育地块无需大规模整地和耕翻，减少了水土流失和对生态环境的破坏；同时也促进了种群良性循环增殖，实现了药材生产与生态环境保护的有机协调发展，契合当前生态文明建设指导思想，有利于促进藏药材产业的可持续发展，具有良好的推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1标准品色谱图。

图2野生川西獐牙菜色谱图。

图3人工栽培川西獐牙菜色谱图。

图4本发明抚育的川西獐牙菜色谱图；其中，图2-4中峰1-6分别是马钱苷酸、獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和异荭草苷。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明生态抚育方法

本发明方法包括：药材生产基地生态环境选择、种(子)源繁育、药材生态抚育、产品的采收过程，具体如下：

1、川西獐牙菜药材生态抚育生产环境选择

1.1自然生态环境条件

1.1.1气候条件

川西獐牙菜在青海省内生长适宜区主要为3200～4400m的特定地形、地貌类型中，多集中于河谷谷地、山坡河谷、山坡平洼地等，尤以通天河流域分布较为密集。气候为高原大陆性气候，年平均日照时数2494～3000h，日照百分率为56％～75％，太阳辐射量为610kj/m²～700kj/m²，年平均温度3.0℃左右，年平均降水量大于400mm，无霜期为100～120d。

1.1.2土壤条件

川西獐牙菜适生地气候较为寒冷，土壤多为砂质壤土或砂石地，土壤ph值中性或偏碱性，一般在7.3～8.4之间，土壤通气状况良好，以山地棕壤、暗棕壤和高山草甸土或河滩沙地为主。

1.1.3群落分布特征

野生川西獐牙菜所在植物群落以河谷灌丛和河谷温性草原为主，群落的区系成分以温带成分为主，特别是北温带成分的科属。主要的植被类型有鸡骨柴+毛球莸+细裂叶莲蒿群丛、狭叶青蒿+阿尔泰狗哇花+伞女蒿群丛、鲜黄小檗+狭叶青蒿+细裂叶莲蒿群丛下部和空隙间、刺檗+狭叶青蒿+金露梅群丛下部和空隙间、鲜黄小檗+短叶锦鸡儿群丛边缘和空隙处、沙棘+金露梅+长芒草群丛边缘和空隙处、狭叶青蒿+疏花针茅群丛等。

2、川西獐牙菜药材种(子)源繁育

2.1繁育方法

2.1.1川西獐牙菜种源繁殖材料

川西獐牙菜繁育材料为种子(有性繁殖)。

2.1.2选种

应选择种源明确、植株健壮、无病虫害侵染、高度大于25.0cm、蒴果直径大于0.40cm的植株作为种源。采种时，蒴果颜色呈黄褐色或深褐色，蒴果裂口时采集。野生种子采集时，应按照由低向高的海拔高度进行采集(低海拔的种子先成熟)，将整株植株一起采集，待其阴干后，让种子自然脱落。采种密度应控制在50％之内。人工生产的种子应在优质种源基地中采选。

2.1.3采集

2.1.3.1种子采集

川西獐牙菜种子的成熟是从植株顶端开始，等植株低部种子成熟后，一些顶端的种子己开始脱落。植株顶端的种子粒大、饱满，品质好。一般采收期在9～10月初，当川西獐芽菜顶端的果实饱满鼓胀，蒴果裂口时采收。采收种子时，连同植株根部一同采集，将植株散放在通风较好的干燥处，随时翻动植株，防治植株及种子霉变。将采集的植株晾干后，让种子脱落，收集种子，用筛子过筛除去大的杂物，利用自然风(风选)将种子中的不饱满的种子、细土以及碎叶片除去，种子净度达98％以上。除杂后的种子，移入布袋内，置于冰箱中，保持-10℃～0℃放置6个月，维持湿度为60～80％。

2.1.3.2选种标准

选择的种子应籽粒大、饱满，无褐变、无虫蛀，千粒重不小于0.076g。

2.2定植

2.2.1选地

在川西獐牙菜原生生境或相似生境条件下，选择排水良好的沙质土壤上，以质地疏松、富含腐殖质的沙质土为好；地势低洼和土质黏重的地点不宜选择。

所选地块，无需大规模整地和耕翻处理，对原有植被类型破坏较小。

播种前，应施足基肥(有机肥，其有机质含量大于30％，施肥量为2000～2500kg/亩，或根据抚育区土壤养分状况进行科学增减。施肥后覆盖土壤1cm～3cm厚。

2.2.2播种和施肥

2.2.2.1人工播种

先对川西獐牙菜种子用浓度为200ppm的赤霉素浸泡6h，然后播种。

播种以春季播种为最佳，春播时间为4月中下旬，海拔较高地方可延迟到5月初，待土壤地表温度大于0℃即可开展春播工作。播种时，种子与细沙按照1:30～1:50的比例拌匀，均匀撒播在所选地块内。播种量控制在种子量为250～400g/亩(其中，在立地条件较好的地方，播种量为250～300g/亩，条件差的地方播种量为350～400g/亩)。播种后适度覆土(种子覆土深度0.2～0.5cm)，适度均匀浅耙、轻碾，确保种子和土壤充分接触。在苗床上均匀覆盖枯草或碎麦秸进行适度遮阴，枯草或碎麦秸的厚度以1～2cm为宜。

2.2.2.2施肥

施肥应根据药材生长发育规律开展。川西獐牙菜为两年生草本植物，第一年实生苗生长期间不宜施用肥料，以免伤苗。到第二年开春后雨前施用一次有机肥，施肥量为1500～2000kg/亩。施肥方式：将肥料均匀撒播在试验地内，然后覆土1～3cm厚。

2.3种子质量要求

2.3.1川西獐牙菜种子质量

川西獐牙菜种子质量应符合表1中要求。

表1

2.3.2检验方法

净度分析、发芽试验、真实性和品种纯度、水分测定以及其他检验项目按gb/t3543.3、gb/t3543.4、gb/t3543.5、gb/t3543.6和gb/t3543.7的规定执行。

2.3.3检验规则

2.3.3.1扦样

扦样方法和种子批的确定按gb/t3543.2的规定执行。

2.3.3.2种子标签

按gb20464的规定执行。

2.3.4包装、贮藏

包装、贮藏按gb/t7414和gb/t7415执行。

3、川西獐牙菜生态抚育方法

3.1抚育管理

3.1.1选种、选地和播种

同2.2.1的选地、2.2.2.1的人工播种。

3.1.2种植密度

从生态抚育方式繁殖资源的角度出发，着眼于最大限度地减缓对抚育区生态环境的扰动和不良影响，参照以往对川西獐牙菜资源野外调查结果，宜采用稀疏散布的繁殖资源定植格局。种子定植密度控制在6株/m²～15株/m²，保苗数4000株/亩～10000株/亩。一年生实生苗期间，不需要进行间苗。

3.1.3科学施肥

为保证抚育效果，根据不同抚育地块土壤肥力状况，要施足底肥，雨前巧施追肥。播种前，使用有机质含量不低于30％的有机肥作底肥。

3.1.4抚育管理

利用自然降水，无需灌溉；利用天然野生环境，野外状态下自然生长，无需人工管护。必要的管护措施主要在于对繁育期资源的保护性监护，通过设置围栏或人为看管尽量避免或减缓放牧家畜对幼苗的意外伤害或践踏，以及其他人为造成的药材盗采盗挖等。

4、川西獐牙菜药材产品的采收、加工、包装和运输技术规范(包括采收时间、采收方法、产地加工、包装与标志等)

4.1采收

川西獐牙菜采收在第二年8～10月初盛花期，连同植株根部一同采集，抖去根部的土，用干净的饮用水将根部的剩余细土洗净，抖去水分，在通风好的场地上摊开阴干，随时翻动以免发霉变质。

4.2加工

川西獐牙菜药材产品的干燥采用自然阴干法。将收获的全草植株，置于大块塑料篷布上阴干，期间，每隔24h翻动一次。翻动时，动作要轻，翻动后要将药材铺设均匀。阴干20～30d，经水分检测合格后，集中收集到纸箱内，放置在通风、干燥、阴凉、避光的库房内待加工包装。

4.3产品包装

4.3.1包装车间消毒和灭菌

包装车间应进行封闭和灭菌消毒，实行人流与物流分开，包装操作工人应经过更衣、灭菌等程序后方可进入包装车间。

4.3.2抽样

对每一批次阴干的药材抽样采用随机抽样方法，分别抽样检测，抽样样品不得低于检测样品的5‰，检测重复次数不低于3次。

4.3.3含水率

检测样品含水率限值为10％以内。

4.3.4产品包装规格

拣去多余杂质，产品进行含水率检测，合格后进入紫外线灭菌室，灭菌后直接装箱并封口。装箱后出厂销售。

4.3.5产品标签与说明

产品标签应符合gb7718的要求。川西獐牙菜作为药材产品要严格按照《中药材生产质量管理规范》、《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》等要求，编制产品产地、引种来源、种植人员、管理技术方案、药材活性成分、重金属和农药残留测试结果等说明内容。

4.4产品的储运技术规范

4.4.1贮藏

产品应贮藏在清洁、干燥、阴凉、通风且无异味的专用仓库中。

4.4.2运输

运输工具应清洁、干燥、无异味、无污染，运输中应防雨、防潮、防暴晒、防污染，严禁与可能污染其品质的货物混装运输。

5本发明川西獐牙菜的检测

5.1外观性状

主根黄色。茎直立，四棱形，棱上有窄翅。叶无柄，卵状披针形至狭披针形，长0.8～3.5cm，宽0.3～1.0cm，先端钝，全缘，基部略呈心形，半抱茎。圆锥状聚伞花序几乎占据了整个植株，多花；花梗细，四棱形；花4数，直径8～13cm；花萼绿色，深裂至基部，裂片线形披针形或披针形，长4～7mm，先端急尖；花冠暗紫色，深裂近基部，裂片披针形，长7～9mm，先端渐尖，具芒尖，基部有两腺窝，腺窝狭长圆形，边缘具柔毛；花丝线形，花药黄色。蒴果长圆状披针形，长达8～14mm；种子椭圆形，表面有细网纹。

5.2质量检测

根据《中华人民共和国药典》、企业标准和购销合同，按每批件数的1％随机抽检样品。

按照《中国药典》2015年版检测方法进行，其中，本发明抚育方法获得的川西獐牙菜水分低于10.0％；总灰分低于10.0％；

重金属指标中，重金属总量≤20mg/kg、铅(pb)≤5.0mg/kg、镉(cd)≤0.3mg/kg、砷(as)≤2.0mg/kg、汞(hg)≤0.2mg/kg；

农药残留指标中，滴滴涕(ddt)≤0.1mg/kg、六六六(bhc)≤0.1mg/kg、五氯硝基苯≤0.1mg/kg；

醇溶性浸出物不少于4.0％；水溶性浸出物不少于8.0％；

主要活性成分中，芒果苷含量为2.288％、龙胆苦苷含量为3.044％、獐牙菜苦苷含量为0.410％。

可见，本发明的川西獐牙菜品质优良，各指标已经均符合药典标准，达到入药要求。

5.3产量数据

出苗统计结果见表2。

表2玉树州生态抚育种植川西獐牙菜出苗统计

按照本发明抚育方法，第一年种植后保苗数维持在4000株/亩～10000株/亩，以越冬成活率为56.2％计算，预计可收获干药材65～160斤。一旦在青藏高原广袤区域进行推广，应用前景广阔。

以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：

试验例1川西獐牙菜种子播种前处理方法的筛选

川西獐牙菜播种前首先对种子进行前处理，筛选方法如下：

设置6个不同浓度赤霉素液浸种川西獐牙菜种子，进行催芽试验，具体操作如下：将干净种子分成3组，每皿100粒，设3次重复。分别用浓度0、20、50、100、150、200ppm的赤霉素溶液浸泡种子6小时，以0ppm下的试验结果作为对照，每培养皿摆放浸泡过的种子100粒，每批处理重复3次，发芽温度利用萌发最适温度的结果。

结果见表3。

表3赤霉素溶液浓度处理的川西獐牙菜种子萌发率

可见，未处理前的川西獐牙菜种子平均萌发率仅为38.67％，经赤霉素处理后，平均萌发率有不同程度的提高。其中，以赤霉素150～200ppm浓度处理时的萌发率最高，尤其以200ppm浓度处理时，川西獐牙菜种子萌发率高达91.33％，对川西獐牙菜种子萌发起到良好的促进作用。

试验例2川西獐牙菜不同栽培方法的药材品质比较

比较不同方法得到的川西獐牙菜药材品质，具体如下：

1、实验材料及试剂

1)实验材料

本发明抚育方法得到的川西獐牙菜药材，栽培地点为青海省玉树市仲达乡；

野生川西獐牙菜药材：采自川西獐牙菜原产地青海玉树等地，原植物标本经中国科学院西北高原生物研究所植物分类专家卢学峰研究员鉴定为川西獐牙菜；

人工栽培川西獐牙菜药材：陈桂琛等栽培得到的川西獐牙菜(详细栽培方法见陈桂琛等，藏药川西獐牙菜的引种栽培研究，安徽农业科学，2005,33：272-273)。

2)仪器试剂

agilent1260高效液相色谱仪，agilenteclipseplusc18柱(250mm*4.6mm，5um)，梅特勒mettlertoltdoms205du天平，kq-500e型超声清洗器，色谱纯甲醇。

2、实验方法：

采用hplc方法，分别检测不同药材的活性成分含量。

2.1hplc条件

色谱柱：agilenteclipseplusc18柱(250mm*4.6mm，i.d.5um)；流动相：甲醇-水(0min，10:90；15min，40:60；25min，50:50；30min，50:50)，流速1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：254nm。

2.2标准品溶液的配制

精密称取(1)獐牙菜苦苷9.09mg；(2)芒果苷3.72mg；(3)龙胆苦苷9.09mg；(4)异荭草苷9.38mg；(5)獐牙菜苷9.17mg；(6)马钱苷酸9.19mg，分别定容至10ml的棕色容量瓶中，分别取以上标准品溶液0.2、1.0、1.0、0.2、0.4、0.2ml混合，配制成浓度分别为0.061、0.124、0.303、0.061、0.125、0.061mg/ml的混合标准品溶液。

2.3标准曲线的绘制

分别精密吸取对照品溶液4、6、8、10、12、14ul，在2.1项色谱条件下依次进样，以进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。

2.4样品溶液的制备

精密称取粉碎的不同川西獐牙菜药材，每份1.500g，置于50ml三角瓶中，加20ml甲醇于40℃超声提取，提取两次，合并提取液过滤并用甲醇定容至50ml容量瓶中，即为样品溶液。

3实验结果

3.1hplc分析

在2.1条件下标准品及样品实现基线分离，色谱图见图1-4。

3.2方法学考察

3.2.1稳定性试验

取四份样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h各进样10ul，测定六种成分的峰面积，结果六种成分的rsd均小于2.5％，表明样品在24h内稳定。

3.2.2线性、检测限、精密度考察(n＝5)，见表4。

表4不同活性成分检测的线性、检测限、精密度

由表4可知，各成分在选定浓度范围内呈现良好的线性关系，仪器及进样精密度良好。

3.2.3加标回收率试验

取已知六种成分含量的样品，分别加入相当于样品中六种成分含量80％、100％、120％的对照品溶液进行测定。精密吸取10ul进样分析，计算回收率(n＝3)。结果显示，六种成分的平均回收率在97％～102％之间，且rsd均小于2.0％。

3.3含量测定(n＝5)，结果见表5。

表5不同培育方式下川西獐牙菜药材活性成分含量比较(n＝5)

由表5可知，与野生川西獐牙菜药材相比，人工栽培及本发明抚育方法得到的药材中6种有效化学成分含量均显著升高。其中，本发明抚育方法得到的药材中各种活性成分含量均最高，是野生药材活性成分的1.75～7.90倍，是人工栽培药材活性成分的1.12～2.03倍，药材品质优良。

因此，采用本发明抚育方法，通过选择特定的种质资源、播种方法及抚育条件，得到的川西獐牙菜药材产量稳定，质量佳，推广应用价值良好。