本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于提高青花菜游离小孢子培养胚胎发生率及成苗率的方法。
背景技术：
青花菜是国际、国内市场十分畅销的一种名特蔬菜，营养价值与风味、蛋白质、氨基酸及维生素的含量都比较高，菜价较贵，种子也非常昂贵，因此选育优异的青花菜品种很重要。青花菜属典型的十字花科异花传粉植物，具有很强的杂种优势。利用小孢子培养方法获得纯合的亲本时间只需要一年，时间短，效率高，可以加快育种速度。青花菜的小孢子培养目前有尚有许多难出胚的基因型以及胚状体成苗率低，限制了这一技术在实际育种工作中的应用。
技术实现要素：
本发明通过改良青花菜小孢子培养的培养基配方发明一种用于提高青花菜游离小孢子培养的胚胎发生率及成苗率的方法，建立高效的青花菜小孢子培养体系，为育种工作奠定基础。
本发明所述的小孢子培养方法主要过程包括一种提高青花菜游离小孢子胚胎发生率及成苗率的方法，包括如下步骤：
首先，选取花蕾长度在2～4cm之间的无裂蕾、虫蕾和病蕾的健康花蕾，流水冲洗3min，将挑选后的花蕾放入灭过菌的大烧杯内，依次经过30s的75％乙醇溶液、6～8min的0.1％hgcl2溶液、3次5min的无菌水消毒、灭菌和洗涤。再加入10～15ml含130g/l蔗糖的b5液体培养基，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子游离出来。将含有小孢子的悬浮液先用300目细胞筛过滤，再用40μm与50ml离心管配套的细胞筛过滤，收集滤液于50ml离心管中，1000～1200rpm离心3min。弃上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净的小孢子。
其次，将游离出的纯净小孢子沉淀物用含tdz浓度为0.05～0.45mg/l的nln培养基进行稀释培养。在稀释时使细胞密度保持在1×105～2×105个/ml(用血球计数板计数)，将每5ml小孢子悬浮液分装入为90mm×15mm的一次性塑料培养皿内，每皿添加5g/l的灭菌后的活性炭溶液100μl，用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到摇床上(50rpm)继续暗培养。25d后统计胚状体数目，小孢子胚诱导率以每个花蕾产生胚状体数表示。在接种小孢子25d后转接胚状体到添加30g/l蔗糖，7.5g/l琼脂，0.1～0.3mg/ltdz，0.1g/l活性炭ms的培养基上，培养基ph为5.8～6.0，高温湿热灭菌；接种量为每100ml广口三角瓶含50ml培养基接种3～5个胚状体。于25±1℃，16h光照/天条件下培养，25～30d后胚状体发育为根、茎、叶明显健壮的小苗；形成次生胚、愈伤组织和发育畸形的胚状体转接到同样的培养基上，使其继续发育成苗。
有益效果
1.通过在胚状体诱导阶段在nln诱导培养基中添加0.15mg/ltdz，比不加tdz的nln培养基中小孢子胚胎发生率提高了2.5倍。
2.青花菜从接种小孢子到获得再生植株只需要50天左右，在添加0.15mg/ltdz的nln诱导培养基中，青花菜的成苗率最高，达到了86.30％，无tdz添加的成苗率为53.9％，提高了1.6倍。在ms培养基中添加0.2mg/l的tdz可使成苗率达到90.12％，提高1.8倍。
3.操作简单易行，在诱导阶段和成苗阶段加入特定浓度的tdz即可。
附图说明
图1为tdz对青花菜小孢子胚诱导的影响对照表。
图2nln诱导培养基中tdz浓度对绿生70天、绿帝、优秀胚状体成苗的影响对照表。
图3ms成苗培养基中tdz浓度对绿生70天、绿帝、优秀胚状体成苗的影响对照表。
具体实施方式
本发明所述的青花菜游离小孢子培养方法主要过程包括：
一、游离小孢子培养过程
选取花瓣长度/花药长度在2～4cm之间的无裂蕾、虫蕾和病蕾的健康花蕾，流水冲洗3min，将挑选后的花蕾放入灭过菌的大烧杯内，依次经过30s的75％乙醇溶液、6～8min的0.1％hgcl2溶液、3次5min的无菌水消毒、灭菌和洗涤。再加入10～15ml含130g/l蔗糖的b5液体培养基，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子游离出来。将含有小孢子的悬浮液先用300目细胞筛过滤，再用40μm与50ml离心管配套的细胞筛过滤，收集滤液于50ml离心管中，1000～1200rpm离心3min。弃上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净的小孢子。
将游离出纯净的小孢子沉淀物用含有tdz的nln培养基进行稀释培养，tdz浓度为0.00、0.05、0.15、0.45mg/l。在稀释时使细胞密度保持在1×105～2×105个/ml(用血球计数板计数)，将每5ml小孢子悬浮液分装入为90mm×15mm的一次性塑料培养皿内，每皿添加5g/l灭菌后的活性炭溶液100μl，用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到摇床上(50rpm)继续暗培养。25d后统计胚状体数目，小孢子胚诱导率以每个花蕾产生胚状体数表示。在接种小孢子后25天转接胚状体到添加30g/l蔗糖，tdz浓度为0.1、0.2、0.3mg/l，7.5g/l琼脂，0.1g/l活性炭的ms培养基上，培养基ph为5.8～6.0，高温湿热灭菌。平均每3d观察一次，记录每个胚的成长情况，30d后把再生植株进行继代，同时对成苗的数目进行统计。
本发明经试验研究，其结果报告如下：
1材料：青花菜绿生70天、绿帝、优秀3个品种。
2试验方法及培养基
2.1试验方法同游离小孢子培养过程
2.2nln培养基：添加130g/l蔗糖，ph为5.8。添加的浓度为0.00、0.05、0.15、0.45mg/ltdz过滤灭菌。ms培养基：添加30g/l蔗糖，7.5g/l琼脂，tdz浓度为0.1、0.2、0.3mg/l，0.1g/l活性炭，ph为5.8，高温湿热灭菌。
3试验结果
3.1nln诱导培养基中tdz对青花菜小孢子胚诱导的影响
tdz对于青花菜小孢子的诱导出胚有一定的促进作用，以浓度0.15mg/l为最佳浓度，与对照组(浓度为0.00mg/l)相比，对于绿生70天、绿帝、优秀基因型出胚率分别提高了2.2、2.5、2.1倍。
3.2nln诱导培养基中加入tdz对青花菜绿生70天、绿帝、优秀基因型小孢子胚状体成苗的影响
tdz对于青花菜小孢子的诱导成苗有一定的促进作用，以浓度0.15mg/l为最佳浓度，与对照组(浓度为0)相比，对于绿生70天、绿帝、优秀基因型出胚率分别提高了1.5、1.6、1.6倍，见图2。
3.3ms成苗培养基中加入tdz对青花菜绿生70天、绿帝、优秀基因型小孢子胚状体成苗的影响
tdz对于青花菜小孢子的诱导成苗有一定的促进作用，以浓度0.2mg/l为最佳浓度，与对照组(浓度为0)相比，对于绿生70天、绿帝、优秀基因型成苗率分别提高了1.4、1.6、1.8倍，见图3。
利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。