2,6‑二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果果实上的应用的制作方法

本发明属于植物诱导抗病性技术领域，具体涉及2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果果实上的应用。

背景技术：

苹果含有丰富的碳水化合物、维生素和无机盐等物质，是人们重要的营养来源和物质基础。在我国苹果作为重要的经济作物和出口水果，栽培面积和产量均居世界首位，然而，苹果出口率不足总产量的3％，在国际上的市场占有率与我国苹果生产大国的地位极不相称，苹果病害尤其果实病害是造成该现象的一个重要因素，苹果生产中各环节因真菌感染而造成的病害给人们带来了巨大的损失。

苹果果实病害主要包括：苹果轮纹病(botryosphaeriadothidea)、灰霉病(botrytiscinerea)、青霉病(penicilliumexpansum)、炭疽病(glomerellacingulata)、褐腐病(moniliniafructicola)、斑点病(acremoniumsclerotigenum)和霉心病(trichotheciumroseum或alternariaalternata或fusariumspp)等。目前，生产上防治苹果果实病害以套袋保护为主，由于苹果套袋成本逐年上涨，苹果的无袋栽培已成为必然趋势，但是果实病害是苹果无袋栽培首先要解决的关键问题。苹果采后病害的防治主要依靠化学药剂浸泡果实的方法，但是化学杀菌剂的药剂残留、病原菌易对其产生抗性和环境污染严重等问题已日趋严重，多种杀菌剂已被限制或禁止使用。因此，寻求可替代化学杀菌剂的安全有效防治措施已成为苹果生产和采后贮藏果实病害防治中亟待解决的问题。

通过激发植物本身的防御体系来控制病害，是开发高效、安全、绿色农药的一条重要途径。通过长期的进化，植物已经形成了一套完整的防御机制，植物的诱导抗性起始于植物对来自病原菌信号物质的识别，通过激活植物体内多种信号途径，如水杨酸、茉莉酸、乙烯等信号途径，导致植物产生一系列抗性反应，其中包括防御基因表达水平升高、防御化合物的累积等等。能够诱导植物产生抗病性的化学物质称为植物抗病激活剂(plantactivator)，bth是目前商品化最成功的植物抗病激活剂。大量研究已表明，利用诱导抗性控制植物病害具有抗性持续时间长、抗病谱广及不污染环境等优点，被认为是植物病害防治的一种新策略和可行途径。

技术实现要素：

本发明针对目前农业生产中苹果果实病害防治难度大，成本高，化学农药残留及抗药性日益突出等问题，提供了一种诱导苹果果实抗病性的方法，对苹果果实病害进行有效防治。以此减少化学药剂的使用次数和使用量，消弱其对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，并可延迟苹果果实病害病原菌抗、耐药菌株的出现，以实现苹果产业向着安全、高效、可持续的方向发展。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂在苹果果实上的应用。

在上述方案的基础上，所述2,6-二叔丁基对甲酚用于增强植物体内防御酶的活性，所述的防御酶为cat、pod、sod。

在上述方案的基础上，使用时将2,6-二叔丁基对甲酚制备成溶液。

在上述方案的基础上，所述2,6-二叔丁基对甲酚溶液通过喷施或浸润的方式施用于苹果果实。

在上述方案的基础上，所述2,6-二叔丁基对甲酚溶液的浓度为0.1mmol·l^-1～0.2mmol·l^-1。

在上述方案的基础上，所述2,6-二叔丁基对甲酚溶液的浓度为0.1mmol·l^-1

在上述方案的基础上，2,6-二叔丁基对甲酚溶液用于防治由病原菌引起的苹果果实病害。

在上述方案的基础上，所述苹果果实病害为苹果轮纹病、灰霉病、青霉病、炭疽病、褐腐病、斑点病和霉心病。

在上述方案的基础上，所述苹果轮纹病病原菌为葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)，灰霉病病原菌为灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)，青霉病病原菌为扩展青霉菌(penicilliumexpansum)，炭疽病病原菌为炭疽病菌(glomerellacingulata)，褐腐病病原菌为美澳型核果褐腐菌(moniliniafructicola)，斑点病病原菌为菌核生枝顶孢(acremoniumsclerotigenum)，霉心病病原菌为粉红单端孢菌(trichotheciumroseum)、链格孢菌(alternariaalternate)和镰刀菌(fusariumspp.)。

一种诱导苹果果实抗病性的方法，是使用喷雾器在苹果表面喷洒浓度为0.1mmol·l^-1～0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，直到果实表面有水滴滴下。

一种诱导苹果果实抗病性的方法，是将苹果果实在浓度为0.1mmol·l^-1～0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液中浸泡1～2min。

本发明的有益效果：

本发明所提供的化合物2,6-二叔丁基对甲酚作为植物抗病激活剂，与传统农药相比具有以下优点：1)本身无离体的杀菌或抑菌作用，在活体条件下才能诱发植物自身的免疫系统抵御病害的侵袭；2)诱导产生的抗病性具有持效性长和广谱特性，经2,6-二叔丁基对甲酚处理过的苹果果实对苹果的轮纹病、灰霉病、青霉病、炭疽病、褐腐病、斑点病和霉心病的病原菌均具有显著的防效，处理60天后的苹果果实对苹果的轮纹病、灰霉病病原菌防治效果分别为92.5％和70.6％，防效显著；3)2,6-二叔丁基对甲酚诱导产生的抗病性属于植物机体自身生理代谢反应，环保安全，不宜产生抗药性；4)使用方法简单，浓度低，用量少，成本低；5)防治上述苹果果实病害效果显著，最高防治效果可达83％，具有很高的经济效益；6)使用2,6-二叔丁基对甲酚还能提高苹果果实内防御酶cat、pod、sod的活性，使果实总抗氧化能力显著提高。

附图说明

图1不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果轮纹病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，a为苹果轮纹病菌孢子萌发率，b为苹果轮纹病菌菌落直径；

图2不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，a为苹果灰霉病菌孢子萌发率，b为苹果灰霉病菌菌落直径；

图32,6-二叔丁基对甲酚对苹果轮纹病病原菌防治效果随使用间隔时间的变化；

图42,6-二叔丁基对甲酚对苹果灰霉病病原菌防治效果随使用间隔时间的变化；

图52,6-二叔丁基对甲酚浸泡处理提高苹果果实对病害的抗性，a1为接种苹果灰霉病病菌的对照组，a2为2,6-二叔丁基对甲酚浸泡处理对苹果灰霉病的防治效果，b1为接种苹果轮纹病菌的对照，b2为2,6-二叔丁基对甲酚浸泡处理对苹果轮纹病的防治效果；

图62,6-二叔丁基对甲酚处理对苹果果实内防御酶活性的影响。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明涉及一种激发苹果果实抗病性的方法，其包括将有效浓度的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液应用于苹果果实，经吸收后激发果实的抗病性，从而提高苹果果实对病害的抗性。

本发明所述的2,6-二叔丁基对甲酚具有以下结构：

实施例1

1.12,6-二叔丁基对甲酚对苹果病原菌菌丝生长的影响

配置pda培养基，在其中添加2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，使其终浓度为0.1mmol·l^-1和0.2mmol·l^-1，在上述pda培养基中分别接种活化好的苹果轮纹病病原菌葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)，灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)，青霉病病原菌扩展青霉菌(penicilliumexpansum)，炭疽病病原菌炭疽病菌(glomerellacingulata)，褐腐病病原菌美澳型核果褐腐菌(moniliniafructicola)，斑点病病原菌菌核生枝顶孢(acremoniumsclerotigenum)，霉心病病原菌粉红单端孢菌(trichotheciumroseum)、链格孢菌(alternariaalternate)和镰刀菌(fusariumspp.)，上述菌均为本领域的常规病原菌，于25℃恒温暗培养3～5d，测量菌落直径。

上述所用pda培养基，其组分及配方如下：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000ml，ph值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。

结果显示，0.1mmol·l^-1和0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚对上述病原菌的菌落直径无明显影响，说明该浓度化合物对病原菌菌丝生长没有抑制作用。

1.22,6-二叔丁基对甲酚对苹果病原菌孢子萌发的影响

分别制备上述苹果果实病害病原菌的孢子悬浮液，浓度为10⁵个·ml^-1，分别向上述孢子悬浮液中添加2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，使其终浓度为0.1mmol·l^-1和0.2mmol·l^-1，置于25℃条件下，24h观察孢子萌发情况。

结果显示：0.1mmol·l^-1和0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚对上述病原菌孢子萌发没有明显影响，说明该浓度化合物对病原菌孢子萌发没有抑制作用。

不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对苹果轮纹病菌和灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，结果见图1和图2。

实施例2

不同浓度的2,6-二叔丁基对甲酚对苹果果实病害的防治效果：

配置0.1mmol·l^-1和0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，苹果轮纹病病原菌葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)，灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)，青霉病病原菌扩展青霉菌(penicilliumexpansum)，炭疽病病原菌炭疽病菌(glomerellacingulata)，褐腐病病原菌美澳型核果褐腐菌(moniliniafructicola)，斑点病病原菌菌核生枝顶孢(acremoniumsclerotigenum)，霉心病病原菌粉红单端孢菌(trichotheciumroseum)、链格孢菌(alternariaalternate)和镰刀菌(fusariumspp.)在pda培养基上活化培养3d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼备用。

挑选大小均匀健康的富士苹果，流水洗净后75％酒精进行表面消毒，室温晾干，在苹果赤道处刺伤，每伤口直径约0.3mm，深约1.0mm，每果实3～4处伤口，将上述0.1mmol·l^-1和0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液均匀喷雾到果实上，直到有水滴滴下，室温晾干后，在刺伤处接种上述病原菌菌饼。接种后3d观察并测量病斑直径，根据发病病斑面积计算防治效果。

防治效果＝(对照组病斑面积-处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。

所述不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚对上述苹果果实病害的防治效果见表1，2,6-二叔丁基对甲酚水溶液对9种苹果果实病害均具有显著的防治效果，防效均在50％以上，最高防效可达83％，其中0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液对各病害的防治效果显著高于0.2mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，说明该植物激活剂表现出良好的广谱抗病性且防效显著。

表1不同浓度2,6-二叔丁基对甲酚防治苹果果实病害的效果

实施例3

2,6-二叔丁基对甲酚防治效果随使用间隔时间的变化：

按照实施例2中方法处理苹果果实，针刺造成伤口后，将0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液均匀喷雾到果实上，直到有水滴滴下，室温晾干，分别于喷雾后6h，12h，24h，48h，72h和96h，在刺伤处接种苹果轮纹病菌(botryosphaeriadothidea)和灰霉病菌(botrytiscinerea)菌饼，并分别测定接种3d、5d后2,6-二叔丁基对甲酚防治效果随使用间隔时间的变化。

结果如图3和图4所示：

图3为2,6-二叔丁基对甲酚对苹果轮纹病病原菌防治效果随使用间隔时间的变化，由图3可知：0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理后，间隔不同时间接种病原菌，其防治效果存在显著差异。间隔时间在6～48h内，随间隔时间的延长，对苹果轮纹病的防效逐渐升高，但随接种病原菌时间的延长，接种后3d和接种后5d的防效没有显著变化。间隔48h时，防治效果最好，与间隔72h的防治效果没有显著差异，间隔96h时防效略有降低，但防效仍在58％以上；

图4为2,6-二叔丁基对甲酚对苹果灰霉病病原菌防治效果随使用间隔时间的变化，由图4可知：0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理后，随着间隔时间的延长，对苹果灰霉病的防治效果呈现上升趋势，但随接种病原菌时间的延长，接种后3d和接种后5d的防效没有显著变化。其中间隔时间在48～96h时，防治效果好并无显著差异，均在70％以上。

实施例4

2,6-二叔丁基对甲酚浸泡处理提高苹果果实对病害的抗性：

配置0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，苹果采摘后，经上述水溶液浸泡处理1～2min，室温下自然晾干，于4℃，相对湿度95％条件下，黑暗贮藏。贮藏60d后，刺伤接种苹果轮纹病菌和灰霉病菌，接种后3d，测量病斑直径计算病斑面积，根据发病病斑面积计算防治效果。

防治效果＝(对照组病斑面积-处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。

0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液浸泡处理苹果果实60d后，苹果果实仍然对苹果轮纹病和灰霉病的病原菌具有显著的防效，对苹果轮纹病和灰霉病的病原菌防治效果分别为92.5％和70.6％(图5)。

实施例5

2,6-二叔丁基对甲酚诱导果实抗病机理：

按照实施例2种方法处理果实，果实表面消毒晾干后，在苹果赤道处刺伤，每伤口直径约0.3mm，深约1.0mm，每果实3～4处伤口，均匀喷施0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚水溶液，以无菌水处理的果实作为对照。以刺伤处为中心，分别于处理后0、0.5、1、2、3、4、5d取样，测定果实组织内抗氧化相关酶活性的变化趋势。

结果如图6所示：0.1mmol·l^-1的2,6-二叔丁基对甲酚处理苹果果实后，果实组织内过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)、超氧化歧化酶(sod)和总抗氧化能力相比对照均显著升高，说明2,6-二叔丁基对甲酚可通过提高果实内防御酶活性诱导苹果果实对病害的抗性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。