本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说是一种神经干细胞的无血清冻存液。
背景技术：
神经干细胞是指来源胚胎和成体脑、脊髓等神经组织中分离培养的一种干细胞，是具有分裂潜能和自我更新能力的一类母细胞，能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可提供大量神经组织细胞的干细胞。因此培养神经干细胞旨在获得足够数量的具有增殖及分化潜能的神经干细胞，以进行中枢神经系统功能损害的治疗和攻击肿瘤的生长的治疗等。目前大量临床前实验研究表明神经干细胞对于脑中风和创伤性脑损伤有一定的治疗效果，并取得令人鼓舞的实质性进展。
神经是人身体中复杂和高度分化的组织，神经干细胞的培养难度高，在培养过程中容易出现自发分化，从而很快就失去干性和分化功能。所以目前有大量神经干细胞体外培养的研究，均旨在培养高质量和数量的神经干细胞，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞冻存过程中无外源性污染是神经干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，在不明生长因子、营养因子或其他细胞因子的刺激下，细胞内关键的信号通路被激活。另一方面采用动物血清冻存的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人神经干细胞的无血清冻存液。
近年来的研究发现，一些中草药来源的天然产物能促进神经干细胞的增殖，揭示了这些中药益智作用的可能机制。现代药理学研究表明，天麻具有神经保护功能，改善衰老、健忘和脑缺血模型动物的学习记忆能力。最新研究表明天麻的单体化合物影响神经干细胞的增殖和自我更新。
人神经干细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存液的微环境对人神经干细胞有着重要影响，当细胞微环境出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老。优化干细胞的冻存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。
技术实现要素：
本发明的技术任务是解决现有冻存条件的不足，提供一种神经干细胞的冻存液，解决常规冻存液中胎牛血清带来的动物源性成分和病原体污染问题，减少细胞死亡并维持干细胞特性。神经干细胞使用无血清冻存液保存在液氮中14天，细胞重新复苏后贴壁率达到90%以上，死细胞很少，大大提高了细胞的活性与数量，同时流式细胞术检测细胞表型时,通过分析神经干细胞特异性标记物(nestin,sox1和sox2）、巨细胞特异性标记物（cd44）、星形胶质细胞特异性标记物（gfap）、神经元特异性标记物（dcx）和细胞增殖标记物（ki-67）的表达，干细胞特性也没有发生变化。
设计一种人神经干细胞的无血清冻存液，其混合溶液体系中成分的百分比为：含有人神经干细胞的无血清培养基65%-75%、中药天麻来源的单体化合物溶液3-5.5%、二甲基亚砜9-12%，腺苷3-5.5%、以及人神经干细胞来源的外泌体溶液2.5-5%和人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5-5%。
人神经干细胞的无血清培养基的配制可以选择不同体积百分比的无血清培养基建立储存体系，优化后分别配制体积百分比为65%、67%、69%、71%，73%，75%的冻存液体系。
人神经干细胞无血清培养基包括基础培养基和添加营养因子成份，其中基础培养基为alpha-mem培养基，根据需要添加如下成份：营养因子a1（50ng/ml），营养因子b1（50ng/ml），4-羟乙基呱嗪乙磺酸（5mg/ml），血小板源性细胞因子（50ng/ml），表皮生长因子（50ng/ml），碱性成纤维生长因子（50ng/ml），细胞因子抗体e（20ng/ml），细胞因子抗体f（20ng/ml），细胞因子抗体m（20ng/ml）。
加入浓度为2mmol/l浓度的中药天麻来源的单体化合物ztd1，ztd1溶液的体积百分比分别优化为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%。
加入浓度为4mmol/l浓度的腺苷，腺苷的体积百分比分别优化为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%。
在冻存液体系中，加入浓度为400ng/ml人神经干细胞来源的外泌体，人神经干细胞来源的外泌体溶液体积百分比分别优化为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%。
在冻存液体系中，加入400ng/ml的浓度人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物，人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液的体积百分比分别优化为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%。
取培养6天后人神经干细胞，用吸管在培养瓶中轻轻吹打神经细胞球，使聚于瓶底的神经干细胞球悬浮，然后将培养形成的神经干细胞球悬液转移至离心管，400g离心10分钟，弃上清后，用木瓜蛋白酶对收集到的神经干细胞球进行消化，用本发明的人神经干细胞冻存液冻存获得的神经干细胞，按冻存细胞数所需浓度为2x106个细胞/ml冻存液，定量加入预冷的本发明人神经干细胞冻存液，充分混匀后，将此细胞悬液转移到冷冻管中，每管1ml，封口，贴上预打印的标签，扫描标签录入管理系统，然后放入程序降温专用冻存盒中分级冷冻细胞：-80℃，12小时后，将冻存管转移至液液氮中保存。
本发明同现有技术相比，其优点在于：
1、本发明的一种人神经干细胞无血清冻存液，克服了动物源性血清污染的缺陷和并解决了细胞扩增数量和维持干细胞特性的问题：不含血清，避免了不明血清成份中动物源性的污染；培养基中添加了特殊的细胞因子和特定的细胞因子抗体，可促进神经干细胞的增殖和维持干细胞特性，增加了神经干细胞的存活率，确保了细胞的质量和安全性符合国家的gmp要求，为广泛的临床应用铺平道路。
2、本发明人神经干细胞无血清冻存液中的神经干细胞保持良好的分化功能特性，神经干细胞可分化为神经元和神经胶质细胞，细胞可保持正常状态，通过分析神经干细胞特异性标记物(nestin,sox1和sox2）、巨细胞特异性标记物（cd44）、星形胶质细胞特异性标记物（gfap）、神经元特异性标记物（dcx）和细胞增殖标记物（ki-67）的表达,干细胞特性没有变化。
3、本发明的冻存体系中的人神经干细胞在7-10天生长良好，冻存复苏率可达85%以上，但在对照的冻存体系中神经干细胞的冻存复苏率只有40-60%，由此可以看出，本发明的无血清冻存液能够有效地促进神经干细胞的生长，调高细胞的存活率。
4、本发明所述的无血清冻存液和对照组冻存液中冻存的细胞的流式细胞表型对比结果显示,本发明提供的无血清培养基和对照组培养基神经干细胞的特异蛋白的阳性表达没有统计学差异。
[附图说明]
图1为无血清冻存液和常规冻存液中保存的人神经干细胞复苏后培养的细胞生长情况图。
如图所示，图中：
曲线1为本发明的人神经干细胞无血清冻存液中保存的人神经干细胞复苏后培养的生长曲线图；
曲线2为常规冻存液冻存中保存的人神经干细胞复苏后培养的生长曲线图；
横坐标表示生长时间单位为天数，纵坐标表示吸光度。
[具体实施方式]
下面结合附图对本发明作进一步说明，这种装置的结构和原理对本专业的人来说是非常清楚的。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
参见图1，本发明的技术方案是按以下方式实现的，该实验方法的步骤是：
1）本发明提出的一种神经干细胞冻存液,是含各成分的体积百分比为：预先制备的人神经干细胞无血清培养基65%-75%、人血白蛋白9-12%、二甲基亚砜9-12%、腺苷3-5.5%、以及人神经干细胞来源的外泌体溶液2.5-5%和人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液2.5-5%的混合溶液。
2)具体实施方式中，冻存液是含人神经干细胞无血清培养基的体积百分比可以为65%，67%，69%，71%，73%，75%；人血白蛋白的体积百分比可以为9%，9.5%，10%，10.5%，11%，12%；二甲基亚砜体积百分比可以为9%，9.5%，10%，10.5%，11%，12%、腺苷的体积百分比可以为3%，3.5%，4%，4.5%，5%，5.5%，以及人神经干细胞来源的外泌体溶液体积百分比可以为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%、人神经干细胞来源的短肽和多肽类化合物溶液的体积百分比可以为2.5%，3%，3.5%，4%，4.5%，5%的混合溶液。
3）在冻存液中加入上述体积百分比的人神经干细胞无血清培养基，该培养基包括基础培养基和添加营养因子成份，其中，基础培养基为alpha-mem培养基，根据需要添加如下成份：营养因子a1（50ng/ml），营养因子b1（50ng/ml），4-羟乙基呱嗪乙磺酸（5mg/ml），血小板源性细胞因子（50ng/ml），表皮生长因子（50ng/ml），碱性成纤维生长因子（50ng/ml），细胞因子抗体e（20ng/ml），细胞因子抗体f（20ng/ml），细胞因子抗体m（20ng/ml）。无血清培养基是一种主要的细胞营养成分，维持细胞的微环境。冻存液中加入适量的无血清培养基，保证了人神经干细胞的营养供给与细胞活性，同时保障了临床应用的安全性和有效性。
4）在冻存液中加入上述百分体积比的浓度为40mg/l的中药天麻来源的单体化合物ztd1，主要是提高dna损伤修复能力，保护神经干细胞在受到缺氧的情况下，细胞凋亡减少，同时细胞内部的复制及物质合成能力加强，保证细胞的正常增值能力。
5）在冻存液中加入上述百分体积比的二甲基亚砜，这是一种主要的细胞防冻保护剂。冻存液中加入适量的医用二甲基亚砜降低细胞内的水熔点，保证了人神经干细胞细胞内水分动态平衡，防止微冰晶造成的细胞损伤。
6）在冻存液中加入上述百分体积比的浓度为4mmol/l浓度的腺苷，可在冻存过程中保持细胞内atp水平的稳定，为细胞生长提供必须的能量物质，在细胞的代谢过程中起着非常重要的营养作用，能够增强细胞活性，同时发挥细胞保护作用，防止冻存条件下造成的功能损伤。
7）在冻存液中加入上述百分体积比的浓度为400ng/ml的人神经干细胞p3-p6代来源的外泌体，可以促进人神经干细胞的增殖及迁移，抑制细胞的凋亡信号通路，对维持细胞的干性具有重要意义。
8）在冻存液中加入上述百分体积比的浓度为400ng/ml的人神经干细胞p3-p6代来源的短肽和多肽类化合物，可显著提高人神经干细胞的存活率，抑制细胞的凋亡信号通路，在对维持细胞的活性与干性具有重要意义。
上述各成分均是生物医药领域常用的化学试剂、生物制品或原料药，在用于细胞冻存时，优选使用国家食品药品监督管理局批准的药用级产品，白蛋白优选使用人血白蛋白，外泌体、短肽和多肽类化合物均为人神经干细胞的自身产物，并通过无菌质量检测。
实施例2
人神经细胞在上述冻存液中冻存，然后进行复苏、传代培养及扩增的实验步骤是：
1.细胞复苏步骤：
a)从液氮罐中快速取出1管冻存的神经干细胞管至备有液氮的冰盒中，待用；
b)打开水浴锅至37℃；
c)用10ml移液管吸取5ml神经干细胞无血清培养基至15ml离心管中，待用；
d)用镊子从冰盒中夹出细胞，在37℃水浴中快速解冻，轻轻摇晃，直至只有一小块冰坨，复苏时间控制在1min以内；
e)用100-1000μltip头将复苏好的细胞吸至离心管中，轻晃混匀，tip头可吸取少量离心管中的细胞悬液清洗一遍冻存管，400g，室温离心3min；
f)用移液管向1个t75培养瓶中加入7ml完全培养基；离心完，倒去上清，擦拭管口，加入8ml完全培养基重悬细胞，吹打10次混匀，取20μl细胞悬液用于计数，接种至培养瓶中；
g)培养瓶上手动标记细胞名称、复苏代数和复苏日期，放至37℃，5%co2培养箱中培养；
h)20μl细胞悬液用配制好的台盼蓝染液（0.4%台盼蓝染液用pbs稀释1倍）稀释2倍计数；
i)操作完，整理生物安全柜和桌面，紫外照射消毒30min。
2.传代培养步骤（以t75cm2培养瓶为例）：
a)从培养箱中取出培养瓶，于显微镜下观察神经干细胞生长状态和细胞形态，当神经球形成时，用吸管在培养瓶中轻轻吹打，使沉淀于瓶底的细胞球浮起；
b)用5ml移液管吸取神经干细胞球悬液（注：不要直接吹打细胞）至离心管，400g，室温离心3min，弃上清；
c)吸取2ml木瓜蛋白酶溶液加入到离心管内，丢弃移液管，轻轻摇晃离心管使液体覆盖整个细胞，37℃，5%co2培养箱中放置20min，然后500g，室温离心5min，弃上清；
d)用5ml移液管吸取2ml神经干细胞完全培养基至上述离心管内，吹打50次混匀，移入1个15ml离心管中，混匀，丢弃移液管；
e)用5ml移液管吸取5ml生理盐水将原离心管中残留的神经干细胞球洗一遍，移入上述15ml离心管中，混匀，丢弃移液管，400g，室温离心3min；
f)倒去上清，擦拭管口，用10ml移液管吸取32ml神经干细胞完全培养基至1个t225培养瓶中；再吸取8ml完全培养基重悬离心管中细胞，吹打50次混匀，取100μl细胞悬液用于计数；然后将离心管中的细胞转移至t225培养瓶中，混匀；
g)培养瓶上手动标记细胞名称、传代代数和传代日期，放至37℃，5%co2培养箱中培养；
h)20μl细胞悬液用配制好的台盼蓝染液（0.4%台盼蓝染液用pbs稀释1倍）稀释5倍计数；
i)操作完，整理生物安全柜和桌面，紫外照射消毒30min。
3.培养细胞的表面标记分析的试验步骤是:取培养的神经干细胞球，移入15ml离心管中，在400g，室温离心3min，用pbs洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为106/ml的细胞悬液，加入10ul抗体，在4度下孵育20分钟，用pbs洗涤1次，在400g，室温离心3min，用500ul的pbs重悬细胞，然后上流式细胞仪进行检测并记录结果。
参见图1，无血清冻存液和常规冻存液中保存的人神经干细胞复苏后培养的细胞生长情况差异有显著性意义(p>0.05)。