本发明涉及中药虎杖浸膏及其主要成分白藜芦醇在农业方面的应用，本发明定性定量分析了虎杖浸膏中白藜芦醇的含量，并确定白藜芦醇为主要活性成分，属农药技术领域。
背景技术：
植物病毒病素有“植物癌症”之称，极难防治，植物病毒分布广泛，种类繁多，它们对农作物的生长和现代农业生产造成了严重的危害和重大损失，在农业生产中病毒病是仅次于真菌的第二大类植物病害。病毒病危害日益严重，尤其是对经济作物，如烟草花叶病毒病的危害成了烟草生产的一个瓶颈问题，烟草花叶病毒除危害烟草外，还能侵染番茄、茄子、马铃薯、辣椒、龙葵等茄科植物，此外还能侵染葫芦科、蓼科、十字花科、豆科、藜科、菊科等30个科的300多种植物。目前开发出的植物病毒防治剂的防效一般都低于60％，其防治效果均不理想，远远满足不了农业的需求。因此，如何防治烟草花叶病毒的侵害一直是科学家们关注的热点。
随着环保意识的不断增强，寻找新型、高效、低毒的抗植物病毒剂已是当务之急。研究发现，很多中草药中含有的天然化学成分，具有高效、低毒，对人类自身以及环境毒害小的特点，所以分析天然产物中有效成分的化学结构，研究其构效关系，寻找人工合成的天然模板，进行绿色合成，进而得到高效、低毒的新型药物。因此从天然产物中寻找具有较高活性的先导化合物，已成为研究和开发新型农药和医药的热点之一。
我国中医药几千年的发展取得了丰硕成果，中草药丰富的资源和研究基础是开发新型植物源农药的一个突出优势，引起广大农药研究人员的广泛关注。随着植物源农药的发展，中草药源农药逐渐成为植物源农药研究的重点。中草药源农药是指用于防治病虫害的中草药提取物或从中分离纯化的单体物质。很多中草药含有抗菌、抑菌、杀虫作用的成分，在人类的长期生活实践过程中已见证了其功效，并且这些成分是自然存在的，一般易于降解，对环境积蓄毒性的可能性不大。因此，与化学农药相比，中草药源农药对人和动物的毒性较低，对生态环境的影响较小，是很有应用前景的环保型农药。
中草药源农药主要有杀菌剂和杀虫剂两大类，有些中草药源农药同时是杀菌剂和杀虫剂，此外，还有些中草药还具有抗植物病毒的活性。近年来，有关中草药源杀菌剂方面的研究取得一定进展，中草药资源中具有杀菌活性的植物种类相当丰富，对中草药提取物的杀菌、抑菌活性研究报道较多。从中草药提取物中研究具有杀菌活性的物质是研究杀菌剂的一个重要途径，由于机理方面的研究仅是探索阶段，没有明确的方式和方法，这些研究尚处于初级阶段，所以目前作为杀菌剂在生产上应用的中草药杀菌剂不多，从资料和农药登记情况看，仅有孟昭礼等研究的银杏杀菌剂被成功开发为绿帝和银泰杀菌剂，被应用在农业生产中，因此中草药杀菌剂还有待更深入的研究。中草药应用在杀虫方面，在我国早有记载，民间更是流传着许多疗效非凡的配方，据报道可以用作杀虫剂原料的中草药有：苦楝、雷公藤、大茶根、侧柏叶、烟草、桃树叶、黄滕根、皂角树叶、野菊花、芦荟、大黄、桑叶、何首乌、黄苓、黄芪、商陆、乌柏叶、松针片、臭椿叶、闹羊花、银杏外种皮、麻黄油等。近年来，应用中草药提取物作为杀虫剂的研究发展很快。
利用丰富的中草药植物资源，结合现代科技，加强对中草药植物源农药的开发，不仅可以促进农药行业的发展，同时也扩大了中草药植物的应用范围，因此加强对中草药植物源农药开发，具有重要的经济意义、生态意义和社会意义。
我国是农业大国，每年用于防治植物病虫害和防止杂草的杀菌剂、杀虫剂、除草剂等各种农药制品高达数百亿元，而中草药源的农药作为环保农药之一，将会带来巨大的经济效益和环保效益，具有广阔的市场前景。
虎杖为寥科寥属多年生草本植物虎杖(polygonumcuspidatumsieb.etzucc.)的根茎，是我国一种常用中药，具有多种药理活性。虎杖的化学成分主要有芪类和蒽醌类化合物，近年来芪类化合物尤其是白黎芦醇(resveratrol)被广泛关注，白藜芦醇是一种多酚物质，据报道白黎芦醇具有抗氧化、抑菌、抗癌、抑制血小板聚集等活性，其在葡萄、花生、桑葚、虎杖等植物中均存在，虎杖中含量较高，是一种极具开发价值的天然物质。白藜芦醇(resveratrol，简称res)，化学名称为3,5,4’-三羟基-1,2-二苯乙烯，其最初作为一种葡萄类植物在受到真菌感染、紫外线照射等不利条件作用时产生的植物抗菌剂而为人所认识。是植物在受到病原性进攻和环境恶化时自身合成的一种抗毒素。1940年日本人首次从毛叶藜芦(veratrumgrandiflorum)的根中获得的。1963年，nonomura等提出白藜芦醇是某些草药治疗炎症、脂类代谢和心脏疾病的有效成分。1976年，langcake和pryce发现在葡萄(vitisriparia)的叶片中存在白藜芦醇，其合成在遭受紫外线照射、机械损伤及真菌感染时急剧增加，并且能够抵抗灰霉菌(botrytiscinerea)的侵染，是植物体在逆境或遇到病原侵害时分泌的一种抗毒素，故称之为“植物杀菌素”。白藜芦醇除了能提高植物的抗病性，研究发现它还有有益于人类健康的多种生物学活性及药理作用，深受生物医学界的重视。目前国际上对白藜芦醇的研究开发十分活跃，富含白藜芦醇的保健品、药品、酒类、化妆品的种类很多，白藜芦醇现已成为食品、医药和化学领域研究的热点之一。
既然白藜芦醇是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素，将白藜芦醇的天然活性应用于农药的开发具有广阔的前景。它的开发和利用，必将为农药及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
技术实现要素：
本发明目的在于对虎杖浸膏中活性成分白藜芦醇定性定量分析，确定虎杖的主要活性成分，提供虎杖浸膏和白藜芦醇在农业中的应用。本发明基于中药虎杖中的天然活性物质白藜芦醇广泛的生物活性，特别是白藜芦醇是植物在受到病原性进攻和环境恶化时自身合成的一种抗毒素。首次测试了白藜芦醇的抗烟草花叶病毒活性、杀菌活性、杀虫杀螨活性、杀小菜蛾杀蚜虫活性以及除草活性，发现白藜芦醇具有抗烟草花叶病毒活性、杀菌活性，还表现出了杀虫杀螨活性以及除草活性。目前白藜芦醇在农药开发领域的研究还未见报道。本发明为创制新型、广谱、高效、低毒，对人类自身及环境毒害小的植物病毒防治药剂奠定了基础，具备很好的创造性。
本发明虎杖中活性成分白藜芦醇的结构：
化学名称为3,5,4’-三羟基-1,2-二苯乙烯。
采用hplc法对虎杖浸膏中活性成分白藜芦醇进行定性定量分析，色谱柱为hypersilods2(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水溶液，梯度洗脱：0～30min10％～90％甲醇，30～40min90％甲醇，柱温：40℃，检测波长305nm，进样量：10μl，流速：1ml/min-1。通过梯度洗脱对虎杖浸膏中的主要成分白藜芦醇进行了定性分析，并定量测定了虎杖中白藜芦醇的含量。
表1梯度洗脱
本发明虎杖浸膏在16.584min析出的成分与白藜芦醇标准品(保留时间为16.586min)的保留时间一致，所以确认该物质为白藜芦醇。本发明根据白藜芦醇标准曲线，经计算得到虎杖中白藜芦醇含量为0.390mg/g。
本发明以宁南霉素和病毒唑为对照，虎杖浸膏和白藜芦醇均对烟草花叶病毒表现出了抑制活性，特别是白藜芦醇对烟草花叶病毒的活体钝化活性、活体治疗活性、活体保护活性均高于商品化品种病毒唑，白藜芦醇的活体治疗活性为50.2％，而病毒唑的为37.6％。
本发明虎杖浸膏和白藜芦醇均表现出了杀菌活性，而白藜芦醇的杀菌活性大大高于虎杖浸膏。
本发明虎杖浸膏和白藜芦醇对东方粘虫、蚊幼虫、棉铃虫、玉米螟均表现出了活性，但对杀小菜蛾活性只有虎杖浸膏在600ppm表现出了50％的活性，白藜芦醇并没有表现出活性。但是虎杖浸膏和白藜芦醇都对朱砂叶螨成螨表现出了活性，对蚜虫的杀蚜虫活性均为0。
本发明虎杖浸膏和白藜芦醇也表现出了除草活性。
本发明的虎杖浸膏和白藜芦醇较现有使用的农用病虫害防治剂，具有很大的优势：白藜芦醇化学结构简单，制备简易，生物谱广、农用生物活性显著；毒性低，环境兼容性好，对非靶标生物安全。本发明为创制新型、广谱、高效的农用病虫害防治剂奠定了基础，具备很好的创造性。
附图说明
图1白藜芦醇标准曲线
图2白藜芦醇标准品hplc色谱图
图3虎杖浸膏hplc色谱图
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1：虎杖样品溶液制备称取虎杖约500g置于5l的圆底烧瓶中，加入无水乙醇2000ml，加热回流提取24h。取提取液500μl用无水乙醇稀释4倍后得到待测样品溶液，0.45μm微孔滤膜滤过进行测定。
高效液相色谱分析c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：40℃，检测波长305nm，进样量：10μl，流速：1ml/min-1。
白藜芦醇标准曲线的绘制精密称取2mg白藜芦醇标准品，用无水乙醇溶解并定容到10ml容量瓶中，配成质量浓度200μg/ml的白藜芦醇标准储备液，用无水乙醇分别稀释，得到质量浓度为100、50、25、12.5、6.25μg/ml的标准溶液，按色谱条件进样分析后，以白藜芦醇浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积(mau)为纵坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程：y＝110.63x-64.61r2＝0.9999。
hplc所检测白藜芦醇标准品的保留时间为16.586min，虎杖浸膏在16.584min析出的成分与白藜芦醇标准品的保留时间一致，所以确认该物质为白藜芦醇。
虎杖中白藜芦醇的定量分析
虎杖中白藜芦醇含量的计算公式为：α＝(cv/m)×100
式中，α为白藜芦醇在虎杖中含量(mg/g)；c为虎杖样品液中白藜芦醇的质量浓度(mg/ml)；v为提取液体积(ml)；m为虎杖质量(g)。根据白藜芦醇标准曲线，经计算得到虎杖中白藜芦醇含量为0.390mg/g。
实施例2：虎杖浸膏和虎杖中活性成分白藜芦醇的生物活性测试(表2，表3，表4，表5，表6，表7，表8，表9)：
测定程序如下：
抗烟草花叶病毒活性的测定
1、病毒提纯及浓度测定：
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
2、化合物溶液配制：
称量后，原药加入dmf溶解，制得1×105μg/ml母液，后用含1‰(质量百分比浓度，以下没有特别指明的百分比均为质量百分比)吐温80水溶液稀释至所需浓度；宁南霉素制剂直接兑水稀释。
3、离体作用：
摩擦接种珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10μg/ml。收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于1‰吐温水及药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次。3d后记录病斑数，计算防效。
4、活体保护作用：
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
5、活体治疗作用：
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。3d后，记录病斑数，计算防效。
6、活体钝化作用
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1‰吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％
表2虎杖浸膏和白藜芦醇抗烟草花叶病毒(tmv)活性
以商品化品种宁南霉素和病毒唑为对照，进行了烟草花叶病毒的活体钝化活性、活体治疗活性、活体保护活性的测试，测试结果表明虎杖浸膏和白藜芦醇均对烟草花叶病毒表现出了抑制活性，白藜芦醇的活体治疗活性为50.2％，而病毒唑的为37.6％。
杀真菌活性的测定，测定程序如下：
以番茄早疫病菌为例，可以换成其他菌体。
测试方法：将番茄早疫病菌接到pda培养基上培养7天，用打孔器在菌落边缘制取直径4cm的菌碟接种到含有50μg/ml和不含药剂的pda培养基上培养4天，量取菌落直径，与对照比较计算出药剂的抑制百分率。
表3虎杖浸膏和白藜芦醇杀菌活性
表4虎杖浸膏和白藜芦醇杀菌活性(续)
对虎杖浸膏和白藜芦醇进行了对水稻纹枯等的活性测试，测试结果表明虎杖浸膏和白藜芦醇均表现出了杀菌活性，而白藜芦醇的杀菌活性大大高于虎杖浸膏。
杀虫活性的测定，测定程序如下：
东方粘虫的活性测试
东方粘虫的实验方法：浸叶法，配置成所需浓度后，把直径约为5-6cm的叶片浸入药液中5-6秒，取出，放在吸水纸上晾干，放在指定的培养皿中，接入10头3龄幼虫，放入27±1℃的养虫室中观察3-4天后检查结果。
蚊幼虫的活性测试
蚊幼虫的实验方法：尖音库蚊淡色亚种，室内饲养的正常群体。称取供试化合物约5mg于盘尼西林药瓶中，加5ml丙酮(或适宜溶剂)，振荡溶解，即为1000mg/kg母液。移取0.5ml母液，加入盛有89.5ml水的100ml烧杯中，选取10头4龄初蚊子幼虫，连同10ml饲养液一并倒入烧杯中，其药液的浓度即为5mg/kg。放入标准处理室内，24h检查结果。以含有0.5ml试验溶剂的水溶液为空白对照。
棉铃虫的活性测试
棉铃虫的实验方法：饲料混药法，从配置好的溶液中移取3ml加入约27g的刚配置好的饲料中，从而得到稀释十倍的所需浓度。药剂混匀后均匀地倒入干净的24孔板中，晾凉后接入24头3龄棉铃虫，观察3-4天后检查结果。
玉米螟的活性测试
玉米螟的试验方法：浸叶法，配置成所需浓度后，把直径约为5-6cm叶片浸入药液中5-6秒，取出，放在吸水纸上晾干，放在指定的培养皿中，接入10头3龄幼虫，放入27±1℃的养虫室中观察3-4天后检查结果。
小菜蛾幼虫活性测试
采用国际抗性行动委员会(irac)提出的浸叶法。称取2mg药样于10ml小烧杯中，加50μldmf(分析纯)溶解，加10ml水制成200ppm药液。用直头眼科镊子浸渍甘蓝叶片，时间2-3秒，甩掉余液。每次1片，每个样品共3片。按样品标记顺序依次放在吸水纸上。待药液干后，放入具有标记的10cm长的直型管内，接入2龄小菜蛾幼虫，用纱布盖好管口。将实验处理置于标准处理室内，4天后检查结果。每个化合物重复3次。对照只向蒸馏水中加入吐温20和dmf。
蚜虫的活性测试
试虫为蚜虫(aphislaburnikaltenbach)，实验室蚕豆叶饲养的正常群体。称取药品，加1mldmf溶解，加两滴吐温－20乳化剂，加入蒸馏水配成所需浓度。将带蚜虫(约60只)蚕豆叶片浸入药剂中5秒钟，拿出轻轻甩干，用滤纸吸干多余药剂，然后将蚕豆枝插入吸水海绵中，并用玻璃罩罩住枝条，用纱布封口，4天检查结果，每个化合物重复3次。对照只向蒸馏水中加入吐温20和dmf。
朱砂叶螨成螨的活性测试
供实验用的矮生菜豆长至两片真叶时，选择长势比较整齐、叶面积4–5平方厘米、株高10厘米左右的植株接虫，每株虫量控制在60–100头左右。接虫24小时后，进行药剂处理。药剂处理采用植株浸渍法，浸渍时间5秒钟。植株从药液中取出后，轻轻抖动，甩掉多余药液，然后移入水培缸中，放置在室温下。处理后24小时在双目镜下检查结果。(做三次平行实验取平均值)
表5虎杖浸膏和白藜芦醇杀虫活性
表6虎杖浸膏和白藜芦醇杀虫活性(续)
表7虎杖浸膏和白藜芦醇杀小菜蛾活性
表8虎杖浸膏和白藜芦醇杀蚜虫和杀螨活性
对虎杖浸膏和白藜芦醇进行了对东方粘虫、尖音库蚊、棉铃虫和玉米螟等的杀虫活性测试，测试结果表明虎杖浸膏和白藜芦醇对东方粘虫、蚊幼虫、棉铃虫、玉米螟均表现出了活性，但对杀小菜蛾活性只有虎杖浸膏在600ppm表现出了50％的活性，白藜芦醇并没有表现出活性。但是虎杖浸膏和白藜芦醇都对朱砂叶螨成螨表现出了活性，对蚜虫的杀蚜虫活性均为0。
除草活性的测定，测定程序如下：
盆栽法：在直径8cm的塑料小杯中放入一定量的土，加入一些清水，播种后覆盖一定厚度的土壤，于花房中培养，幼苗出土前以塑料覆盖。每天加一定量的清水以保持正常生长。测试试材：稗草(echinochloacrusgalli(l.)beauv.)、马唐(digitariaadscendens)、油菜(brassicanapus)和反枝苋(amaranthusretroflexus)。处理19天后调查结果，测定地上部鲜重，以鲜重抑制百分数来表示药效。
表9虎杖浸膏和白藜芦醇除草活性
对虎杖浸膏和白藜芦醇进行了除草活性测试，测试结果表明虎杖浸膏和白藜芦醇也表现出了除草活性。