本发明属于农业科学技术领域，尤其涉及萜类挥发性物质在抑制草莓球腔菌中的应用。
背景技术：
草莓球腔菌(m.fragariae)是引起草莓蛇眼病害的病原菌，又称草莓蛇眼小球腔菌，属子囊菌亚门腔菌属真菌，无性态分生孢子梗丛生，较短，淡褐色或无色，分枝或不分枝，基部子座不发达。分生孢子长圆筒形至纺缍形，一般有1～2个隔膜，细胞内含颗粒。
草莓蛇眼病又称草莓白斑病、叶斑病，主要危害叶片，多在老叶上发病造成病斑，也侵染叶柄、果柄、花萼、匍匐茎和果梗。发病初期在叶片上出现许多大小不等的近圆形、紫红色小斑，似蛇眼状。之后，中央斑点转变成灰白至灰褐色并形成大斑点，有时还有紫红色轮纹。湿度高时，病斑表面产生白色粉状霉层，即病菌分生孢子梗和分生孢子。后期在病斑上可产生出许多小黑点，即病菌子囊座。严重发生时，叶片上病斑密布，短时间内发病叶即坏死枯焦。草莓蛇眼病对草莓果实的危害很大，严重地会造成大面积减产。
目前，草莓蛇眼病的防治方式除了耕地轮做、降低地下水位、通风透气、清洗病苗、摘除病叶和施肥调控等传统的田间栽培手段外，主要还是以药剂防治为主，如波尔多液、代森锰锌、绿得保悬浮剂、络氨铜水、可杀得、百菌清、甲基托布津和多菌灵等农业药剂。但由于化学杀菌剂的长期使用导致的农药残留、环境污染、食品安全、病原菌抗药性等问题日益严重，所以，研究和开发安全、高效的生物杀菌剂具有重要意义。
植物自身会产生多种挥发性物质，这些挥发性物质作为化学信号物质，在植株与环境、植株与病害以及植株与植株等之间的互作中起着非常重要的作用。最近，国内外研究表明植株遭受病原菌侵染或发生机械损伤后体内挥发性物质含量会上升，萜类挥发性物质是其中一类关键组成部分，有证据证实这些物质在植物抗病性中起到重要作用(dudareva,klempienetal.2013)。
何培青等(2005)综述了具有抗菌活性的挥发性物质或组分的植物及对应的病原菌，但对于草莓叶片中的活性挥发性成分及对草莓球腔菌(m.fragariae)具有抑制活性的挥发性物质并未报到。公布号为cn104920359a的发明专利申请文献公开了一种高效防控水稻稻瘟病的植物精油，其主要有效成分为柠檬醛和香茅醛。公布号为cn105123911a的发明专利申请公开了一种利用芳樟醇防治蓝莓采后灰霉病的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供萜类挥发性物质在抑制草莓球腔菌中的应用，该萜类挥发性物质能够有效抑制草莓球腔菌的孢子萌发和菌丝生长，进而防治草莓球腔菌引起的草莓蛇眼病，以此类草莓叶片中已有的萜类挥发性物质制备防治药剂，能够具有高效、安全和环境友好等特点，克服了现有技术中的不足。
具体技术内容如下：
本发明提供了萜类挥发性物质在抑制草莓球腔菌中的应用，所述萜类挥发性物质为芳樟醇或桃金娘烯醇。
进一步地，萜类挥发性物质能够抑制草莓球腔菌的孢子萌发和菌丝生长。
本发明采用草莓叶片中主要的两种萜类挥发性物质芳樟醇和桃金娘烯醇进行试验，由于芳樟醇和桃金娘烯醇为挥发性物质，所以在抑菌实验和病害防治中均采用在密闭的环境下进行熏蒸的方式来进行处理，经实验发现，在一定浓度范围下芳樟醇和桃金娘烯醇能够有效抑制草莓球腔菌的孢子萌发和菌丝生长。
其中，在抑制草莓球腔菌的孢子萌发中，以草莓球腔菌所在的外周密闭环境的体积计，所述芳樟醇和桃金娘烯醇的浓度均≥5μl/l。
在抑制草莓球腔菌的菌丝生长中，以草莓球腔菌所在的外周密闭环境的体积计，所述芳樟醇的浓度≥0.5μl/l，所述桃金娘烯醇的浓度≥5μl/l。
当芳樟醇和桃金娘烯醇的浓度达到50μl/l时，可有效抑制孢子萌发，孢子萌发率下降80-99％；高于上述浓度的萜类挥发性物质具有杀菌作用，即挥发性物质熏蒸16h后移除挥发性物质后，孢子继续培养72h仍然未能萌发。上述萜类挥发性物质的低剂量熏蒸也能够显著抑制萌发后病原菌菌丝的生长，其中芳樟醇在浓度达5μl/l时，可以显著降低菌丝生长12％，10×更高浓度时，菌丝生长几乎被完全抑制。
此外，膜电位对菌丝的能量代谢和生长及侵染宿主具有非常重要的作用，膜电位很大程度上反映了细胞的生理状态。为了验证和探究萜类挥发性物质对于该病原菌的生理影响，对不同挥发性物质处理后的菌丝的膜电位进行了测定，膜电位通过jc1染色后通过共聚焦显微镜观察并进行荧光定量。结果表明，与菌丝生长相对应的，随着萜类挥发性物质浓度的上升，草莓球腔菌(m.fragariae)菌丝的膜电位逐步下降，对于浓度高于50μl/l处理后，菌丝线粒体膜电位显著下降。萜类挥发性物质可以破坏该病原菌的膜电位，进而影响菌体的生长。
本发明还提供了萜类挥发性物质在制备防治草莓球腔菌引起的草莓蛇眼病的制剂中的应用，所述萜类挥发性物质为芳樟醇或桃金娘烯醇；以草莓所在的外周密闭环境的体积计，所述芳樟醇和桃金娘烯醇的浓度为5-150μl/l。
具体地，所述草莓蛇眼病位于草莓叶片上。
本发明还提供了一种防治草莓球腔菌引起的草莓蛇眼病的方法，以萜类挥发性物质作为熏蒸剂，熏蒸草莓；所述萜类挥发性物质为芳樟醇或桃金娘烯醇；以草莓所在的外周密闭环境的体积计，所述芳樟醇和桃金娘烯醇的浓度为5-150μl/l。
作为优选，熏蒸草莓叶片。
进一步地，所述芳樟醇和桃金娘烯醇的浓度为50μl/l。在该浓度下，萜类挥发性物质表现出最好的抑制效果且对叶片无任何损伤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次公开了草莓叶片中的芳樟醇和桃金娘烯醇这两种萜类挥发性物质能够抑制草莓球腔菌，尤其是草莓球腔菌的孢子萌发和菌丝生长，并通过利用该萜类挥发性物质熏蒸草莓球腔菌或草莓叶片的试验，证明了芳樟醇和桃金娘烯醇在有效抑制草莓球腔菌的孢子萌发和菌丝生长中的作用，以及防治草莓蛇眼病中的功能。
(2)本发明采用芳樟醇和桃金娘烯醇制备防治草莓球腔菌引起的草莓蛇眼病的制剂，并进行草莓蛇眼病病害防治，防治效果明显，可有效降低农药的使用量，为开发新型的、高效的、绿色安全的防治草莓蛇眼病的生物防治方法提供了依据。
附图说明
图1为不同生长状态下草莓球腔菌(m.fragariae)的形态；
其中，a为未萌发孢子；b为生长被挥发性物质抑制的菌丝；c为正常生长16h后的菌丝；d为萌发被挥发性物质抑制但移除后72h又萌发的菌丝。
图2为d-柠檬烯对草莓球腔菌(m.fragariae)菌丝生长的影响
图3为芳樟醇对草莓球腔菌(m.fragariae)菌丝生长的影响。
图4为桃金娘烯醇对草莓球腔菌(m.fragariae)菌丝生长的影响。
图5为萜类挥发性物质对草莓球腔菌(m.fragariae)膜电位的影响；
其中，a为芳樟醇；b为桃金娘烯醇。
图6为萜类挥发性物质对草莓球腔菌(m.fragariae)侵染的草莓叶片病斑面积的影响。
具体实施方式
实施例1草莓叶片中主要挥发性物质的测定
1.实验材料
新鲜草莓叶片，取自草莓植株(fragaria×ananassa,albion)，商品名“阿尔比”。
2.实验方法
采用顶空固相微萃取法富集-气相色谱与质谱联用法(gc-ms)来检测草莓叶片中的主要的挥发性物质及其含量。
取20g新鲜草莓叶片与饱和食盐水按照(1g:2.5ml)混合并均浆，准确称量3g样品置于15ml的顶空瓶子中，加入1ul300ppm,2,6-二甲基-6-庚烯-2-醇作为内标；40℃下搅拌平衡15min后，插入50/30μmdvb/car/pdms固相微萃取头(supelco,bellefonte,pa,usa)萃取30min。
萃取结束后，手动进样，进样口250℃解析3min，采用气相系统(6890n)串联ms检测器(5975b)(安捷伦,santaclara,ca,美国)进行检测。色谱柱参数：db-5ms柱子(30m×0.25mm,0.25μm)；柱温程序设置：40℃(保留3min),以2℃min-1上升到64℃，以3℃min-1上升到145℃，然后以15℃min-1上升到250℃(保留10min)。
各挥发性组分通过与质谱库(nist05)进行比对来鉴别，通过内标定量。
3.结果分析
草莓中所测定的主要挥发性物质，如表1所示，检测到三种萜类物质，分别是桃金娘烯醇、芳樟醇和少量d-柠檬烯，总含量约为5％。
表1草莓叶片中主要挥发性物质及其含量
鉴于萜类挥发性物质的抗菌活性已有报道，本次发明选用此类草莓叶片中天然存在的挥发性物质作为备选，同时，以草莓叶片中这些挥发性物质的自然含量为参考来设定后续被试挥发性物质的被测浓度。
实施例2草莓叶片中主要挥发性物质对草莓球腔菌孢子萌发及菌丝生长的抑制
1.实验材料
1)供试病原菌
草莓球腔菌(m.fragariae)，采自自然生叶片蛇眼病的草莓植株，经过实验室分离、纯化、鉴定后并保存备用，本案例所用孢子都为草莓叶片培养基培养四代以内。
2)供试药剂
d-柠檬烯、芳樟醇、桃金娘烯醇(sigma-aldrich，含量均大于98％)
2.实验方法
将浓度为5×104个/ml的草莓球腔菌(m.fragariae)孢子悬液100μl均匀涂布在pda培养基上(7ml培养基每盘，约0.15cm厚，培养皿直径为90mm)，静置10min让孢子贴附在培养基表面；
在培养皿盖子内部放置一个90mm的滤纸，然后分别地将一定体积的挥发性物质滴加在滤纸上，迅速将盖子盖回培养皿，并用封口膜密闭封口。
所滴加的各挥发性物质的体积按照最终培养皿内浓度达到0.05，0.5，5，50，500μl/l进行实施，对于其中的低浓度，各挥发性物质在滴加前根据实验需要用水进行1:10、1:100、1:103、1:104稀释后，再滴加相应的体积；每个挥发性物质分组进行试验，每组设置只滴加等体积水的对照组，滴加的挥发性物质体积为16μl-50μl，并在8h内全部挥发。
16h后在光学显微镜下随机选取9个视野进行拍照(放大倍数为125)，然后利用显微镜capture软件对视野内的各个菌体长度进行测定和统计；每个视野内的菌体个数在6以上，取每个视野的平均菌体长度作为一个平行。
菌丝长度的测定：16h捕获的菌体图片利用显微镜配套的图像测量软件对菌体轴向总长度进行测量。
孢子萌发的判定：菌体伸长为孢子平均轴向长度(约41μm)两倍以上视为萌发(>82μm)；孢子萌发率＝视野内萌发的孢子个数/视野内所有的孢子个数；
对于16h未萌发的处理组，移除滤纸片，并将培养皿打开，在超净台上通风1h让相应挥发性物质移除，然后再封口培养72h，再观察孢子萌发情况；若孢子再次萌发则该挥发性物质在该浓度下只具有抑制孢子萌发的作用，若孢子仍未萌发则视为该挥发性物质在该浓度下具有杀菌作用。
整个实验独立进行两次重复。
3.结果分析
不同生长状态的草莓球腔菌(m.fragariae)的形态图，如图1所示。
a为未萌发孢子；b为生长被挥发性物质抑制的菌丝；c为正常生长16h后的菌丝；d为萌发被挥发性物质抑制但移除后72h又萌发的菌丝。
表2草莓叶片中挥发性物质对草莓球腔菌(m.fragariae)孢子萌发的影响
*该浓度下此挥发性物质具有抑菌作用：移除后72h孢子再次萌发
δ该浓度下此挥发性物质具有杀菌作用：移除后72h孢子仍未萌发
1)草莓叶片挥发性物质d-柠檬烯对草莓球腔菌(m.fragariae)孢子萌发和菌丝生长的影响，分别如表2和图2所示。
d-柠檬烯浓度只有达到500μl/l时对孢子萌发具有抑制作用，平均萌发率降低至0.60％，然而该浓度远远大于一般环境中及叶片中检测到的柠檬烯的浓度，且气味过于强烈。当环境中d-柠檬烯浓度在50μl/l及以下时，对被试病原菌的菌体生长未起到显著的抑制作用。
2)草莓叶片挥发性物质芳樟醇对草莓球腔菌(m.fragariae)孢子萌发和菌丝生长的影响，分别如表2和图3所示。
芳樟醇浓度在50μl/l及500μl/l时，对孢子萌发具有明显抑制作用，且浓度越高抑制率越高，分别抑制了80％和100％孢子的萌发，且500μl/l时具有杀死病原菌的作用；熏蒸处理后即时移除挥发性物质，孢子也不再萌发。此外，如图3所示，在浓度为5μl/l时也对菌丝生长有抑制作用。
3)草莓叶片挥发性物质桃金娘烯醇对草莓球腔菌(m.fragariae)孢子萌发和菌丝生长的影响，分别如表2和图4所示。
桃金娘烯醇在浓度达到50μl/l时，才对病原菌的萌发具有明显的抑制作用，但病原菌的萌发率仍然有20％左右，而浓度在500μl/l时，几乎完全抑制孢子萌发并表现出杀菌效果。其在较低浓度时(5μl/l及以下)不能有效的抑制菌体的生长。
实施例3萜类挥发性物质对草莓球腔菌(m.fragariae)膜电位的影响
1.实验材料
1)供试病原菌
草莓球腔菌(m.fragariae)，同实施案例2。
2.实验方法
1)将浓度为5×104个/ml的草莓球腔菌(m.fragariae)孢子悬液100ul均匀涂布在pda培养基上(20ml培养基每盘，约0.15cm厚，培养皿直径为90mm)，培养5天后，按照实施案例2中的方法进行萜类挥发性物质熏蒸处理16h。
处理结束后，从各组中挑取菌丝，利用线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)(碧云天生物科技，上海)对菌丝的线粒体膜电位进行检测。
具体操作按照试剂盒所提供的实验步骤进行，荧光强度通过共聚焦显微镜sp8(莱卡，德国)进行检测。每个实验每个处理组重复三次，并每组做三次技术重复。最终膜电位结果以红色荧光强度(激发波长525nm,发射波长590nm)与绿色荧光强度(激发波长490nm,发射波长530nm)的比值为作为最终膜电位的表示结果。10μm的cccp处理作为阳性对照(cccp处理会使得菌丝膜电位完全丧失)，水处理作为空白对照。
3.结果分析
菌丝的膜电位显著下降，表明萜类物质可以破坏该病原菌的膜电位，进而影响菌体的生长。当芳樟醇浓度达到500μl/l时，菌丝的膜电位几乎完全丧失，与10μmcccp处理结果相似(如图5)。
实施例4萜类挥发性物质对草莓球腔菌(m.fragariae)侵染草莓叶片的抑制
1.实验材料
1)供试草莓叶片
新鲜阿尔比草莓植株的新鲜草莓叶片，同实施例1，选取生长状态类似的叶片进行试验。
2)供试病原菌
草莓球腔菌(m.fragariae)，同实施例2。
2.实验方法
将新鲜的、生理状态类似的草莓叶片置于90mm培养皿中，并铺两层滤纸于叶片之下，向滤纸滴加1ml水，以保持叶片的湿度和完好的生理状态。
将浓度为1×105个/ml的草莓球腔菌(m.fragariae)孢子悬液喷洒于叶片正面和反面进行人工接种；接种完成后，在培养皿盖子内部放置一个90mm的滤纸，然后分别地将一定体积的挥发性物质滴加在滤纸上，迅速将盖子盖回培养皿，并用封口膜密闭封口。各个萜类物质的浓度分别为0(对照)，5，50，500μl/l进行实施。
叶片于室温下处理2h后将培养皿打开，将带有挥发性物质的滤纸移除，培养皿无菌环境下敞口30min(充分移除挥发性物质)后再封口。室温下再培养8天后观察并记录草莓叶片的发病情况。
3.结果分析
不同浓度的萜类挥发性物质熏蒸处理对草莓蛇眼病的发病率有非常显著的影响(图6)。当萜类物质浓度为5，50μl/l时相比对照都能抑制草莓蛇眼病的发病率，其中50μl/l效果最好，几乎完全抑制了该病原菌的侵染。对于被试萜类挥发性物质，其最优浓度为50μl/l。
然而，过高浓度的挥发性物质处理，对草莓叶片本身也会带来损害，当挥发性萜类物质浓度为500μl/l，处理后的叶片出现褐红色，表明叶片细胞受到损害，从而导致叶片更容易受到病原菌的侵染，8天后叶片几乎全部被草莓球腔菌(m.fragariae)侵染。
根据以上结果，当萜类物质芳樟醇和桃金娘烯醇采用浓度为50μl/l时，表现出最好的抑制效果且对叶片无任何损伤。
综上所述，草莓叶片中的主要萜类挥发性物质，主要包括芳樟醇、桃金娘烯醇，在一定的环境浓度下具有显著抑制草莓球腔菌(m.fragariae)孢子萌发和菌丝生长的作用，并能使得病原菌菌丝线粒体膜电位下降，从而影响真菌的生长。
在合适的浓度下，萜类物质能够有效抑制该病原菌的侵入，防治草莓蛇眼病的发生，并在优选的剂量下：萜类挥发性物质为50μl/l时，表现出最好的抑制效果且对叶片无任何损伤。实验证明，芳樟醇和桃金娘烯醇对草莓蛇眼病具有很好的防治作用。