本发明涉及农业种植技术领域，尤其涉及一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂及其制备方法和用其制备的柑橘黄龙病专用生物制剂。
背景技术：
目前，随着气候、土壤、人为因素等环境条件的变化，柑橘种植所面临的问题越来越多。柑橘病虫害加重，尤其是柑橘黄龙病越来越严重，广东、广西、江西、湖南、福建等地黄龙病危害严重，大批果园黄化，失去生产能力；线虫危害逐年加重，严重影响了柑橘的产量。柑橘的各类病虫害给柑橘产业造成巨大的经济损失。
柑橘黄龙病，是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物。柑橘黄龙病是世界柑橘生产上的毁灭性病害，该病主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区，中国19个柑橘生产省(市、自治区)中已有11个受到该病危害，严重制约柑橘产业的健康发展。
现有治疗柑橘黄龙病的专利多数利用单一微生物，如专利201110332473.8(利用白僵菌控制柑桔木虱的用途与方法)公开了一种通过白僵菌控制木虱的方法，只是从表面上控制了柑橘黄龙病的传播媒介，而没有解决柑橘土传病害的威胁，没有从根本上有效治疗柑橘黄龙病；如专利200910016337.0(一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用)，公开了一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用，达到了抵抗多种植物病害威胁的效果，但针对性不强，对于柑橘黄龙病的传播媒介木虱没能有效控制，不能有效的控制该病的传播；如专利201610745978.x(一种防治金桔黄龙病的微生物菌剂及其制备方法)，公开了一种防治金桔黄龙病的微生物菌剂及其制备方法，该微生物菌剂是由古腊科链霉菌，卡伍尔链霉菌，冷解糖芽孢杆菌，尼氏芽孢杆菌，毛簇木霉等菌发酵后按比例混合而成，从杀虫到土传病害的控制，都有效解决了柑橘黄龙病的控制，并且其对柑橘具有根际促生作用，但未从柑橘根毛少，丛植菌根形成少的角度考虑对柑橘提高抗病免疫能力，柑橘虽然可能得到病情控制，但柑橘黄龙病对柑橘的整体树势影响大，无良好的根系统，不能轻易恢复树势，对柑橘园恢复生机效果不显著。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂及其制备方法和用其制备的柑橘黄龙病专用生物制剂，具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，由苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉、弗兰克氏放线菌复配而成。所述苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉、弗兰克氏放线菌的质量比为(1.5-2.5):(2.5-3.5):(3-5):(0.5-1.5)。
优选的，所述苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉、弗兰克氏放线菌的质量比为2:3:4:1。
所述苏云金芽孢杆菌，是通过如下方法制备的：将苏云金芽孢杆菌菌种在lb培养基中培养扩繁，然后接种到固体培养基中，接种量6％，在ph7.2、温度30-32℃环境下，培养36-72小时，所述固体培养基：固体成分为麦麸63％、豆饼18％、玉米粉10％、糖蜜5％、酵母粉1％、谷氨酸钠0.4％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸亚铁0.3％、硫酸二铵1.2％、硫酸镁0.6％，含水量为60％。
所述球孢白僵菌，是通过如下方法制备的：将购得的球孢白僵菌在实验室中培养扩繁，喷洒于患柑橘黄龙病严重的桔园，过3-5天收集被球孢白僵菌感染的木虱，提取其中的球孢白僵菌，进行实验室分离培养，通过接种进行固体扩繁，使其产生大量分生孢子后，制成球孢白僵菌粉剂。
所述哈茨木霉，是通过如下方法制备的：将哈茨木霉菌种t-22通过固体pda培养基培养28℃培养2-3天，通过病理学培养法检测其对植物常见灰霉病、炭疽病、白粉病、霜霉病等的抗病能力，选出综合抗病性最强的菌株进行培养，通过现有成熟技术进行斜面培养、茄瓶培养、液体菌种培养后转入固体菌种培养，制成哈茨木霉粉剂。
所述弗兰克氏放线菌，是通过如下方法制备的：先用高氏一号合成培养基进行种子培养，获得固体种子培养基，在发酵料上进行种子孢子接种，发酵培养后获得弗兰克氏菌菌剂原料，经过处理得到弗兰克氏菌菌粉。
苏云金芽孢杆菌：即苏云金杆菌，简称bt,是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌。该菌可产生两大类毒素，即内毒素(伴胞晶体)和外毒素，使害虫停止取食，最后害虫因饥饿和中毒死亡。因此该杆菌可做微生物源低毒杀虫剂，用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。
球孢白僵菌：属于子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属，是广谱性昆虫病原真菌，主要进行无性繁殖，产生分生孢子；可进行有性生殖并产生子实体，被鉴定为球孢虫草。球孢白僵菌在世界范围被用于害虫生物防治，其中我国使用球孢白僵菌防治马尾松毛虫和玉米螟是国际上最大的害虫防治项目，取得良好的害虫持续控制效果。其是广谱性杀虫真菌，国内外研究人员利用球孢白僵菌防治玉米螟、松毛虫、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔红蜘蛛和蚜虫等农林害虫。特别是对玉米螟和松毛虫的生物防治，在国内已作为常规手段连年使用。由于球孢白僵菌能有效地控制虫口数量，同时不伤害其他天敌昆虫和有益生物，完全符合有害生物综合治理的宗旨。
哈茨木霉：哈茨木霉是木霉的一种，属于半知菌门，丝孢目，木霉属。哈茨木霉菌t-22,作为一种生防菌可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其主要有效成分为哈茨木霉菌t-22株系，木霉菌是广泛存在于自然界中的一种微生物，哈茨木霉菌是木霉菌中应用的一个菌种，哈茨木霉菌t-22株系是人工修饰的株系，是由t95株系和t12株系为父本通过细胞融合技术获得的人工杂交株系。t95株系对植物根系的缠绕能力和定植能力强，t12株系对病害的防治能力强，通过细胞融合技术将其两者的优点结合到一起，从而获得了根系缠绕、定植、病害防控能力皆优的株系t22，同时获得了其父本对不同土壤类型的适应能力，可以在沙壤土和粘性土壤中良好的定植繁殖，使t22的应用更具适应性。
弗兰克氏菌：弗兰克氏菌是与非豆科植物共生形成根瘸并能固定大气氮的放线菌。革兰氏阳性或不定。大概是微量好气的中温菌。在共生植物的组织内生长发育；也可能游离存在于土壤中，大概是休止阶段。遇适当宿主植物，通过根毛进人植物根系，同时产生生长素使根毛弯曲，内生菌由感染线达到根的皮层，引起侧根分生组织细胞的增殖，形成根瘤。根瘤就是生长受到抑制的变形侧根。感染的细胞膨大，具有变形的大核。
本发明通过苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉菌控制地上柑橘黄龙病原及杀灭传播源木虱及其虫卵从而达到有效控制黄龙病的发生，地下部分四种微生物菌有效的控制病原微生物的侵害，有效控制线虫对病原菌的传播，同时调节土壤结构，分解有机质，提高土壤肥力。
本发明过程中进行了一系列的研究及实验，以下选取部分过程进行披露：
1：微生物配比试验
试验例1：对微生物的配比进行筛选试验：
将扩繁好的苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉、弗兰克氏放线菌按如下各质量比进行混合后分装待用。
将患有黄龙病的柑橘园均匀的分为14个大小相等的地块，之间相互隔绝，分别施用1-13组的微生物制剂，最后一组不施用作为空白对照组，施用后2个月统计各地块中柑橘木虱带菌率、柑橘木虱有效“株虫量”、柑橘病情指数、防治效果。
由上数据可知，将苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉、弗兰克氏放线菌按照合适的比例混合，可以显著降低柑橘木虱带菌率、柑橘木虱有效“株虫量”，充分改善柑橘病情指数，获得较好的柑橘黄龙病防治效果。
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，包括前文所述的用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂、微生物吸附剂、柑橘专性am接种剂，并且水分含量为15-20％。
柑橘专性am真菌接种剂能够促进柑橘根部的生长，使柑橘长出簇生新根，扩大新根数量，有效增强树势，提高树的免疫抗病能力，形成固氮系统，增加土壤肥力，增加微生态环境中柑橘摄取养分的来源渠道。
一种制备所述的的柑橘黄龙病专用生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物吸附剂；
(2)再与柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至15-20％，即得。
所述的柑橘黄龙病专用生物制剂的使用方法，包括如下步骤：
a、将生物制剂按照1:500-800的重量比用水稀释，静置5-20分钟；
b、将静置后的混合溶液上部的清液用于叶面及树枝喷施，下部的混悬液及不溶底物，用于灌溉树根。
本发明的柑橘黄龙病专用生物制剂是通过苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉菌控制地上柑橘黄龙病原及杀灭传播源木虱及其虫卵从而达到有效控制黄龙病的发生，地下部分四种微生物菌有效的控制病原微生物的侵害，有效控制线虫对病原菌的传播，同时调节土壤结构，分解有机质，提高土壤肥力。柑橘专性am真菌接种剂能够促进柑橘根部的生长，使柑橘长出簇生新根，扩大新根数量，有效增强树势，提高树的免疫抗病能力，形成固氮系统，增加土壤肥力，增加微生态环境中柑橘摄取养分的来源渠道。通过控制病原，改善柑橘生长的生态环境，彻底治愈柑橘黄龙病。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
本发明的用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，通过苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉菌控制地上柑橘黄龙病原及杀灭传播源木虱及其虫卵从而达到有效控制黄龙病的发生，地下部分四种微生物菌有效的控制病原微生物的侵害，有效控制线虫对病原菌的传播，同时调节土壤结构，分解有机质，提高土壤肥力。
本发明的柑橘黄龙病专用生物制剂是通过苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉菌控制地上柑橘黄龙病原及杀灭传播源木虱及其虫卵从而达到有效控制黄龙病的发生，地下部分四种微生物菌有效的控制病原微生物的侵害，有效控制线虫对病原菌的传播，同时调节土壤结构，分解有机质，提高土壤肥力。柑橘专性am真菌接种剂能够促进柑橘根部的生长，使柑橘长出簇生新根，扩大新根数量，有效增强树势，提高树的免疫抗病能力，形成固氮系统，增加土壤肥力，增加微生态环境中柑橘摄取养分的来源渠道。通过控制病原，改善柑橘生长的生态环境，彻底治愈柑橘黄龙病。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
通过如下方法分别制备苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、哈茨木霉、弗兰克氏放线菌，待用。
通过如下方法制备苏云金芽孢杆菌：将苏云金芽孢杆菌菌种在lb培养基中培养扩繁，然后接种到固体培养基中，接种量6％，在ph7.2、温度30-32℃环境下，培养36-72小时，所述固体培养基：固体成分为麦麸63％、豆饼18％、玉米粉10％、糖蜜5％、酵母粉1％、谷氨酸钠0.4％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸亚铁0.3％、硫酸二铵1.2％、硫酸镁0.6％，含水量为60％。
通过如下方法制备球孢白僵菌：将购得的球孢白僵菌在实验室中培养扩繁，喷洒于患柑橘黄龙病严重的桔园，过3-5天收集被球孢白僵菌感染的木虱，提取其中的球孢白僵菌，进行实验室分离培养，通过接种进行固体扩繁，使其产生大量分生孢子后，制成球孢白僵菌粉剂。
通过如下方法制备哈茨木霉：将哈茨木霉菌种t-22通过固体pda培养基培养28℃培养2-3天，通过病理学培养法检测其对植物常见灰霉病、炭疽病、白粉病、霜霉病等的抗病能力，选出综合抗病性最强的菌株进行培养，通过现有成熟技术进行斜面培养、茄瓶培养、液体菌种培养后转入固体菌种培养，制成哈茨木霉粉剂。
通过如下方法制备弗兰克氏放线菌：先用高氏一号合成培养基进行种子培养，获得固体种子培养基，在发酵料上进行种子孢子接种，发酵培养后获得弗兰克氏菌菌剂原料，经过处理得到弗兰克氏菌菌粉。
实施例1
一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，由2kg苏云金芽孢杆菌、3kg球孢白僵菌、4kg哈茨木霉、1kg弗兰克氏放线菌混合而成。
实施例2
一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，由2.5kg苏云金芽孢杆菌、2.5kg球孢白僵菌、3kg哈茨木霉、0.5kg弗兰克氏放线菌混合而成。
实施例3
一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，由1.5kg苏云金芽孢杆菌、3.5kg球孢白僵菌、3kg哈茨木霉、0.5kg弗兰克氏放线菌混合而成。
实施例4
一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，由1.5kg苏云金芽孢杆菌、2.5kg球孢白僵菌、5kg哈茨木霉、0.5kg弗兰克氏放线菌混合而成。
实施例5
一种用于柑橘黄龙病的复合微生物菌剂，由1.5kg苏云金芽孢杆菌、2.5kg球孢白僵菌、3kg哈茨木霉、1.5kg弗兰克氏放线菌混合而成。
实施例6
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物菌剂重量50％的微生物吸附剂；
(2)再与微生物菌剂重量25％的柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至17.5％，即得。
所述微生物菌剂为实施例1得到的复合微生物菌剂。
实施例7
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物菌剂重量10％的微生物吸附剂；
(2)再与微生物菌剂重量5％的柑橘专性am接种剂混合；
(1)调整混合后的制剂水分含量至15％，即得。
所述微生物菌剂为实施例1得到的复合微生物菌剂。
实施例8
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物菌剂重量100％的微生物吸附剂；
(2)再与微生物菌剂重量50％的柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至20％，即得。
所述微生物菌剂为实施例1得到的复合微生物菌剂。
实施例9
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物吸附剂；
(2)再与柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至17.5％，即得。
所述微生物菌剂为实施例2得到的复合微生物菌剂。
实施例10
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物菌剂重量50％的微生物吸附剂；
(2)再与微生物菌剂重量25％的柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至17.5％，即得。
所述微生物菌剂为实施例3得到的复合微生物菌剂。
实施例11
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物菌剂重量50％的微生物吸附剂；
(2)再与微生物菌剂重量25％的柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至17.5％，即得。
所述微生物菌剂为实施例4得到的复合微生物菌剂。
实施例12
一种柑橘黄龙病专用生物制剂，通过如下方法制备：
(1)向制备好的微生物菌剂中加入微生物菌剂重量50％的微生物吸附剂；
(2)再与微生物菌剂重量25％的柑橘专性am接种剂混合；
(3)调整混合后的制剂水分含量至17.5％，即得。
所述微生物菌剂为实施例5得到的复合微生物菌剂。
对比例1：按照专利申请cn201610745978.x的实施例1制备，施用方法按照专利cn201610745978.x实施例2中记载的进行。
对比例2：按照专利申请201110332473.8的实施例制备，施用方法按照专利申请201110332473.8实施例中记载的进行。
对比例3：使用专利申请200910016337.0的实施例1中的mdcgth18菌剂，施用方法是方法4。
将患有黄龙病的柑橘园均匀的分为16个大小相等的地块，之间相互隔绝，分别以方法4施用1-5组的微生物菌剂、以方法1施用实施例6-12的柑橘黄龙病专用生物制剂、以方法2施用实施例1的柑橘黄龙病专用生物制剂、以方法3施用实施例1的微生物菌剂、按对比例1中的方法施用对比例1，最后一组不施用作为空白对照组，施用后6个月统计各地块柑橘病情指数、防治效果、当年柑橘亩产、病害柑橘比例。
具体施用方法如下：
方法1：
a、将生物制剂按照1:650的重量比用水稀释，静置12.5分钟；
b、将静置后的混合溶液上部的清液用于叶面及树枝喷施，下部的混悬液及不溶底物，用于灌溉树根。
方法2：
a、将生物制剂按照1:500的重量比用水稀释，静置5分钟；
b、将静置后的混合溶液上部的清液用于叶面及树枝喷施，下部的混悬液及不溶底物，用于灌溉树根。
方法3：
a、将生物制剂按照1:800的重量比用水稀释，静置20分钟；
b、将静置后的混合溶液上部的清液用于叶面及树枝喷施，下部的混悬液及不溶底物，用于灌溉树根。
方法4：
a、将微生物菌剂按照1:650的重量比用水稀释，静置12.5分钟；
b、将静置后的混合溶液上部的清液用于叶面及树枝喷施，下部的混悬液及不溶底物，用于灌溉树根。
由上数据可知，本发明的黄龙病专用复合微生物菌剂及黄龙病专用生物制剂，均可以充分改善柑橘病情指数，获得较好的柑橘黄龙病防治效果，并且在治疗黄龙病的同时，迅速恢复树势，极大的提升当年亩产，使黄龙病染病园区的柑橘得以快速恢复经济效益。
将1-5组和6、9、10、11、12组进行对比可知，将微生物菌剂与微生物吸附剂和柑橘专性am接种剂混合制成柑橘黄龙病专用生物制剂可以有效提升对黄龙病的防治效果，并迅速恢复树势，提升当年亩产。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。