本发明属于植物生物
技术领域：
，具体涉及一种显著缩短诱导时间的细叶百合体细胞胚直接发生方法。
背景技术：
：细叶百合（liliumpumilumdc.fisch），系百合科（liliaceae）百合属（lilium）多年生草本植物，广泛分布于我国东北、华北及西北地区，多生长在海拔400~2600米的林缘、草原或山坡草地，耐寒性极强，耐旱、耐盐碱，抗病，是百合抗性育种的良好亲本（杨利平等,2005）。细叶百合株型优美，花色鲜艳，花朵娇小，花被片反卷下垂，有光泽，花香清怡，具有较高的观赏价值，常常作为地被植物用于花坛、花境的配置。同时，细叶百合鳞茎中多酚类物质对多种自由基均具有一定的清除能力，因此还可以作为天然抗氧化活性剂资源（靳磊等,2015）。组织培养是植物遗传转化和分子育种的工作基础，外植体能否稳定、高效再生直接影响着外源基因的转化效率。目前，百合离体再生主要有器官发生途径和体细胞胚发生途径两种方式。体细胞胚发生是指离体条件下，植物体细胞经过与合子胚发生类似的过程，发育成全新个体的再生方式。体细胞胚发生具有遗传稳定性高、变异率低、繁殖效率高、诱导周期短等优点（cuietal.,1999），是原生质体培养、人工种子制备、种质资源保存、突变体筛选和植物基因工程育种的理想试验体系（bakhshaieetal.,2010;lelu-walteretal.,2017;wuetal.,2013）。使用体细胞胚作为遗传转化的受体材料，不仅能提高转化效率，还可有效降低嵌合体比例，减少后期筛选工作量。百合体细胞胚发生存在基因型依赖性高、不同种间诱导方法差异大的局限。现有的细叶百合的体细胞胚诱导方法是通过间接途径（张静，2017），即外植体需要经历脱分化阶段形成愈伤组织，愈伤组织再分化诱导球形胚的发生。间接再生途径需经历多个步骤、过程复杂，而且诱导周期长，从接种到获得球形胚至少需要45天的时间（张静，2017），限制了体细胞胚在种球快繁和遗传转化等方面的应用。本发明通过筛选外植体、调节植物生长调节剂的种类和浓度以及培养条件，建立了高效、稳定、完善的细叶百合体细胞胚直接发生技术体系。参考文献：[1]cui，k，1999，theanalysisofdifferentialgeneexpressioninearlysomaticembryogenesisonlyciumbarbarum，plantcelltissue&organculture，59(3):169-174；[2]bakhshaie，m，2010，somaticembryogenesisandplantregenerationofliliumledebourii(baker)boiss.,anendangeredspecies，plantcell,tissueandorganculture，102(2):229-235；[3]lelu-walter，m.a，2017，highgellangumconcentrationandsecondarysomaticembryogenesis:twokeyfactorstoimprovesomaticembryodevelopmentinpseudotsugamenziesii[mirb.]，plantcelltissue&organculture，132:1-19；[4]wu，h.j，2013，widespreadlongnoncodingrnasasendogenoustargetmimicsformicrornasinplants，plantphysiology，161(4:)1875-1884；[5]靳磊，刘师源，张萍，2015，细叶百合鳞茎多酚类物质组成及其抗氧化活性，湖北农业科学，54(20):5103-5107；[6]杨利平，孙晓玉，2005.细叶百合的生殖特性和繁育规律研究.园艺学报,32(5):918-920；[7]张静，2017，两种中国原产百合体细胞胚发生及mirna调控网络初步解析，沈阳农业大学。技术实现要素：为了弥补诱导细叶百合体细胞胚发生时间长的现有技术的不足，本发明的目的是提出一种显著缩短诱导时间的细叶百合体细胞胚直接发生方法，以无菌苗鳞片为外植体，不经愈伤组织，直接诱导细叶百合体细胞胚发生，诱导时间短、体胚萌发率高、畸形胚比率低，遗传稳定性强，可为细叶百合的种球扩繁、种质保存和遗传转化提供高效、稳定的再生体系。本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种显著缩短诱导时间的细叶百合体细胞胚直接发生方法，其技术要点是：包括以下步骤：步骤1）外植体培养阶段细叶百合无菌苗接种于添加60g·l-1蔗糖和7g·l-1琼脂的ms培养基中，培养室温度为25±1℃，保证组培瓶内湿度达85%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m-2·s-1；接种45天后，取无菌苗的外层鳞片进行体细胞胚诱导；步骤2）原胚诱导阶段取步骤1培养获得的鳞茎直径达1cm的细叶百合外层鳞片，在超净工作台上，切去四周，成0.5×0.5cm的小块，凹面向上，接种于ms+4.0μmol·l-1pic（毒莠定）+0.01μmol·l-1aba（脱落酸）的体细胞胚直接诱导培养基中，附加蔗糖30g·l-1，琼脂7g·l-1，ph5.8；黑暗培养，培养室温度为25±1℃，保证组培瓶内湿度达85%；接种25天，在鳞片外植体表面形成颗粒性明显的原胚，30天可见球形胚；步骤3体细胞胚增殖阶段将步骤2培养获得的长出球形胚的培养物（胚性培养物），转移至体细胞胚增殖培养基ms+4.0μmol·l-1pic+1.0μmol·l-1naa（萘乙酸），继续黑暗培养，培养室温度为25±1℃，保证组培瓶内湿度达85%，接种20天后，在初生体胚周围，可形成2~4个次生原胚；在体细胞胚增殖阶段，需调整培养基中激素的浓度以使培养物保持胚性状态，具体方法为：增殖培养30天后，将培养物转接至新的增殖培养基ms+1.0μmol·l-1pic中，而后交替使用上述两种培养基（ms+4.0μmol·l-1pic+1.0μmol·l-1naa和ms+1.0μmol·l-1pic），每30天更换一次，以达到降低畸形胚的比率的目的；步骤4：体细胞胚萌发和成苗阶段将步骤3培养获得的次生原胚转移至ms培养基中培养，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m-2·s-1，培养室温度为25±1℃，采用半透膜封口，保证组培瓶内湿度达70%，次生原胚依次经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶形胚阶段，20天后萌发成苗。本发明的优点和积极效果是：1．体胚诱导时间显著短。采用本方法以直接发生方式再生的体细胞胚，不需要经历外植体的脱分化阶段，25天即可完成原胚的分化，30天即可获得球形胚；与间接体细胞胚诱导途径相比，获得球形胚以及最终获得组培苗的时间均可缩短90天。从而能够很大程度上加快细叶百合种苗工厂化的繁育。2．体胚质量佳。采用本方法以直接方式发生的体细胞胚，形态特征明显，胚体饱满质量好。相比于间接途径，产生的畸形胚比率低，而且，体胚的萌发率可高达100%。3．操作方法简单易行，重复性高，培养成本低。本发明通过测试不同的植物激素组合及优化浓度配比确定了细叶百合体胚直接诱导发生的组培诱导条件和体胚快速增殖的培养条件。按此培养条件，以常规组培方法培养无菌苗鳞片即可在短时间内获得体细胞胚，并通过次生体细胞胚的方式进一步增殖扩繁，方法简单，易于推广。附图说明图1为细叶百合体细胞胚直接发生过程图1中各标号为：1.原胚期；2.3.球形胚；4.体细胞胚增殖；5.早期心形胚；6.心形胚；7.鱼雷形胚；8.子叶形胚；9.体胚萌发成苗。具体实施方式为了更详细叙述本发明的工艺步骤，下面举实例说明。实例1细叶百合体细胞胚离体再生技术1.试验材料百合品种：细叶百合（liliumpumilumdc.fisch.），购自辽宁省开原市新城街光明社区辽北苗木种子销售处。2.试验方法与结果步骤1：外植体培养阶段先配制ms培养基，每升培养基中添加蔗糖60g，琼脂粉（条）7g，调ph值至5.8，分装至组培瓶中。于121℃、103.4kpa下，高压灭菌20min（培养基灭菌方法下同），灭菌后观察三天，确定灭菌效果后再接种。超净工作台上，将细叶百合无菌苗接种于上述ms培养基中。采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达85%。培养室温度为25±1℃，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m-2·s-1。鳞茎逐渐膨大，培养45天后，小鳞茎直径可达1cm。取外层鳞片为外植体用于体细胞胚的诱导。步骤2：胚性获得阶段取步骤1培养获得的鳞茎直径达1cm的细叶百合外层鳞片。在超净工作台上，切去四周，成0.5×0.5cm的小块，凹面向上接种于ms+4.0μmol·l-1pic+0.01μmol·l-1aba的体细胞胚直接诱导培养基中，附加蔗糖30g·l-1，琼脂（条）7g·l-1，ph5.8。培养室内完全黑暗培养，温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达85%。外植体的选择是培养的关键，尽量选择肥厚、较宽的鳞片，在切割鳞片时，注意不要保留鳞茎盘。黑暗培养一周后，鳞片培养物表面颜色逐渐变淡，25天即可在鳞片切割损伤边缘诱导产生原胚（图1中标号1），随着细胞分裂加速原胚逐渐隆起高于鳞片表面，30天发育成球形胚（图1中标号2、图1中标号3）。步骤3：体细胞胚增殖阶段经步骤2培养所得含有体细胞胚的培养物，转移至体细胞胚增殖培养基ms+4.0μmol·l-1pic+1μmol·l-1naa中，黑暗条件下继续培养。20天后，在初生体胚基部周围，可形成2~4个次生原胚（图中标号4）。30天后，将培养物转移至增殖培养基ms+1.0μmol·l-1pic中，在次生胚的基部可继续诱导产生次生原胚。而后，交替使用这两种培养基，每30天更换一次。次生胚发生一旦开始形成，在次生胚上可以再次分化形成新的次生胚，这种不断循环的次生胚重复发生可以长期持续，使次生胚数量快速增加。但随着次生胚循环数的增加，无法顺利萌发的畸形胚的比例会有所提升。体细胞胚增殖阶段，每隔30天需更换新的体细胞胚增殖培养基，以补充营养消耗，保持胚性状态。长时间不更换培养基会引起培养物畸形、分化能力下降。步骤4：体细胞胚萌发和成苗阶段将步骤3中所获得的培养物，转移至ms基本培养基中进行光下培养，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol•m-2•s-1，培养室温度为25±1℃。采用半透膜封口，保持培养瓶内湿度为70%。原胚发育形成球形胚后，继续分裂、生长，由于四周边缘处细胞分裂速度加快，中心处分裂慢，在球形胚中心逐渐形成空点直至空洞发育成心形胚（图1中标号5、6）。随着体细胞胚四周细胞继续分裂，整个体细胞胚拉长，经历短暂的鱼雷形胚阶段（图1中标号7）后发育成子叶形胚（图1中标号8），并最终萌发成苗（图1中标号9）。整个培养期间，不需要经历胚性愈伤组织阶段，即可直接形成体细胞胚。实施例2细叶百合体细胞胚离体再生方法比较1.试验材料百合品种：细叶百合（liliumpumilumdc.fisch.），购自辽宁省开原市新城街光明社区辽北苗木种子销售处。2.试验方法试验处理1：方法见实施例1细叶百合体细胞胚离体再生技术的方法试验处理2：方法如下：步骤1：外植体脱分化阶段选取小鳞茎直径为1-1.2cm的细叶百合无菌苗，将叶片切为长0.5cm小段，正面向上、平铺接种于脱分化培养基[ms+6-ba1.0mg•l-1+naa0.5mg•l-1]中，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol•m-2•s-1；接种45天，获得黄绿色、颗粒性明显的非胚性愈伤组织。步骤2：培养胚性愈伤组织a.将步骤1中的非胚性胚性愈伤组织转接至胚性愈伤组织诱导培养基[ms+6-ba0.5mg•l-1+naa1.0mg•l-1]中进行胚性愈伤组织诱导。光培养，培养室温度为25±1℃，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol•m-2•s-1。30天后，获得胚性愈伤组织。步骤3：胚性比例和颗粒性调整阶段将没有褐化且质地致密的胚性愈伤组织切为1cm3小块，转接于胚性愈伤组织调整培养基ms+naa0.5mg•l-1中，光培养，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol•m-2•s-1。30天后可获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%、颗粒性良好的胚性愈伤组织。步骤4：球形胚诱导阶段选择步骤3中获得的胚性愈伤组织，依次交替使用胚性愈伤组织诱导培养基（ms+6-ba0.5mg•l-1+naa1.0mg•l-1）和胚性比例调整培养基（ms+naa0.5mg•l-1），培养室温度为25±1℃，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol•m-2•s-1。每45天更换一次培养基，交替使用2次。可获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1cm3愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚。步骤5：体细胞胚增殖阶段将长出体细胞胚的胚性培养物转于体胚萌发培养基[ms+0.5mg·l-16-ba(6-苄氨基腺嘌呤)]上，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m-2·s-1。培养4周可形成具有子叶和根的成熟体细胞胚，步骤:6：体细胞胚萌发和成苗阶段将成熟体细胞胚转接至ms基本培养基中进行培养，2周后发育形成完整的转化植株。3试验结果植物体细胞胚发生具有单细胞起源、繁殖系数高等优点，但百合体细胞胚诱导尚存在基因型依赖性强、诱导周期长等诸多困难。细叶百合作为重要的种质资源，处理2中体细胞胚诱导是先脱分化获得胚性愈伤，通过胚性愈伤继代增殖，从胚性愈伤组织上再次分化诱导体细胞胚，属于体细胞胚的间接发生途径。处理1以细叶百合鳞片为外植体，通过一定浓度的pic（毒莠定）和aba（脱落酸），诱导体细胞胚直接发生，体细胞胚增殖阶段采用不同培养基保持胚性状态。具体由表1可知处理1和处理2相比，诱导时间显著缩短，步骤简单易行。表1细叶百合体细胞胚离体再生方法比较（诱导阶段）处理诱导培养基体胚增殖形式球形胚诱导时间诱导步骤处理1ms+4.0μmol·l-1pic+0.01μmol·l-1aba次生体细胞胚（直接发生）30天1步处理2ms+1.0mg·l-1picloram+0.2mg·l-1naa胚性愈伤组织（间接发生）120天3步现有百合体细胞胚发生体系大多以间接再生为主，本研究成功诱导细叶百合体胚直接发生，且能够通过次生体胚的形式扩繁，培养物经多次继代增殖后仍具有胚性和萌发活力。当前第1页12