本发明涉及农业微生物
技术领域：
，具体涉及一种用于防治土传害病的复合制剂的制备方法。
背景技术：
土壤中存在数量巨大、种类繁多的微生物，它们中的绝大部分是有益的，在土壤发育、物质转化、结构形成、提高作物养分有效性、抑制病原菌活性等方面发挥着不可替代的作用。但是土壤中也存在着另一类引起作物病害的有害微生物，通称为土传病原微生物，其导致土传害病的产生。优良的土壤环境孕育了大量而种类丰富的有益微生物，与此相反，有害微生物的生存环境则相对较恶劣，既有来自于土壤环境的限制，也有来自于天敌或竞争对手——有益微生物的大力打压，生存空间极少，大多选择休眠状态。而随着我们人为的干扰和破坏，如连作、不合理施用化肥和农药以及不合理灌溉，造成土壤酸化、盐渍化、板结、通气性下降、重金属污染、有机质下降等系列问题。极大限制了有益微生物的繁殖，相反，连作为有害微生物的繁殖提供了丰富的营养和寄主，土壤微生物派系逐渐发生逆转，有害微生物逐渐占据上风，根区土壤微生物生态失衡，结果土传病虫害开始爆发。这就是土传病虫害的根本来源。土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。侵染病原包括真菌、细菌、放线菌、线虫等。其中真菌为主，分为非专性寄生与专性寄生两类。非专性寄生是外生的根侵染真菌，如腐霉菌引起苗腐和猝倒病、丝核菌引起苗立枯病。专性寄生是植物微管束病土传病害原真菌，典型的象尖孢镰、黄萎轮枝孢等引起的萎蔫、枯死。大棚土壤因复种指数高，连作时间长，土壤的生物多样性逐渐遭到破坏，使土壤微生物菌群失衡，从而引发根结线虫、枯萎病、根腐病等土传病害，尤其在“黄瓜专业村”、“西红柿专业村”、“茄子专业村”等单一种植的棚区更为严重。根结线虫病是一种世界性分布的土传病害，由根结线虫引起的根结线虫病是发生在蔬菜上严重的危害之一，主要危害黄瓜、番茄和茄子等多种常见蔬菜。并且随着种植业结构的调整，蔬菜保护地栽培面积的迅速扩大，根结线虫病的发生逐年严重，产量损失达30％-50％。同时，植物根结线虫危害又加重了枯萎病、根腐病等土传性真菌病害和部分细菌病害的发生。已成为当前蔬菜生产的一大障碍。因此，对蔬菜根结线虫病的防治，已经尤为重要。根腐病主要由疫霉菌引发，危害幼苗，成株期也能发病。发病初期，仅仅是个别支根和须根感病，并逐渐向主根扩展，主根感病后，早期植株不表现症状，后随着根部腐烂程度的加剧，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，地上部分因养分供不应求，新叶首先发黄，在中午前后光照强、蒸发量大时，植株上部叶片才出现萎蔫，但夜间又能恢复。病情严重时，萎蔫状况夜间也不能再恢复，整株叶片发黄、枯萎。此时，根皮变褐，并与髓部分离，最后全株死亡。通常防治土传病害，菜农习惯药剂灌根，不可否认的是药剂灌根见效快，但是在它在杀灭有害菌的同时也将土壤中的有益菌一并杀灭。目前国内主要采用化学制剂，如氯化苦、溴甲烷、滴滴混剂、二溴乙烷、二溴丙烷和吸剂呋喃丹、灭线磷、涕灭威和威百亩等。化学药剂虽然杀虫快，效果好，但用量大，成本高，且对人畜剧毒，破坏土壤微生态环境。近年来,随着科技的进步和人们环保意识的加强，生物防治方法引起了人们的高度重视，将逐渐成为综合防治的重要手段之一。因此，抑制土传病害的发生，要不断增加土壤有机质的含量，并且增加有益微生物的种类和数量，适应植物生长的复合制剂一方面可以预防土传病害如根腐病、枯萎病、根结线虫等对根的侵染为害；另一方面能够提前为根系创造适宜的土壤环境，利于根系快速适应土壤，简单来说就是防病、促根，是现有技术急需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种复合制剂的制备方法，该复合制剂能够有效防治土传害病。为实现本发明目的，本申请采用如下技术方案：一种用于土传害病的复合制剂的制备方法，所述制剂包括绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌。所述绿色木霉为（trichodermaviride）atccno.9645;所述假丝酵母菌为（candidautilis）atccno.22023;所述蜡状芽孢杆菌为（bacilluscereus）atccno.10702。优选地，所述绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌按照3-4:2-4:4-5的体积比组成；所述复合制剂的制备方法为：将绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌分别培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3-4:2-4:4-5的体积比混合，然后与助剂按照1:5的体积比混合制备；所述助剂为：丙二醇：脂肪醇聚氧乙烯醚：超纯水按照体积比2:5:30的比例制备。本发明相对现有技术的有益效果为：本申请绿色木霉菌对多种重要植物病原真菌有拮抗作用，防治范围很广泛，有着广阔的应用前景。绿色木霉菌作为生物防治菌具有如下优势：腐生性强，适应范围广；寄生范围广，一药多用，降低防治成本，易于被客户接受；寄生的同时可产生各种抗生素和溶解酶，降低病原的抗药性，加强抑菌强度；绿色木霉菌的几丁质酶基因可在细菌、真菌和植物中表达，对于防止植物真菌病害、促进农业生产具有重要意义。本发明假丝酵母菌和蜡状芽孢杆菌具有多种多样的生物活性，磷和钾是植物必需的大量元素，分别主要以难溶性无机磷酸盐和铝硅酸盐状态存在于土壤中，但其有效含量均相对较低，很难满足植物生长需要，而本发明假丝酵母菌和蜡状芽孢杆菌具有解磷解钾作用、生物固氮作用；它定殖于植物根际，在一些情况下，能够分泌植物激素，如生长素、吲哚乙酸、等促进植物生长和根的发育；刺激植物分泌特异性的物质，诱导植物抗性的提高，从而增加植物对各种病虫害的抵抗能力；在土壤中拮抗各种植物病原生物，且蜡状芽胞杆菌可产生多种生物活性物质，如酶、抗菌物质、植物激素以及絮凝剂等，这些活性物质大多为蛋白质、多糖、多肽和代谢产物等，促进植物生长。微生物的寄主专化性既是它的一个优点，同时也是其主要缺陷。单一微生物制剂对病害的专化性特性，使其很难进行有效防除，从而就限制其推广应用。一些研究表明，利用多个生防菌株混合开发出复合制剂是解决单一缺陷的有效途径，本研究表明，利用菌株绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌之间的复配可以较好的防除根结线虫、枯萎病、根腐病等，为今后开展生防菌应用研究提供了很好的借鉴。具体实施方式实施例1一种用于土传害病的复合制剂的制备方法，所述复合制剂包括绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌。所述绿色木霉为（trichodermaviride）atccno.9645;所述假丝酵母菌为（candidautilis）atccno.22023;所述蜡状芽孢杆菌为（bacilluscereus）atccno.10702。优选地，所述绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌按照3:2:4的体积比组成；所述复合制剂的制备方法为：将绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌分别培养至浓度为1×107个/ml的菌液，离心取上清液，然后按照3:2:4的体积比混合，获得发酵上清混合液，然后与助剂按照1:5的体积比混合制备；所述助剂为：丙二醇：脂肪醇聚氧乙烯醚：超纯水按照体积比2:5:30的比例制备。实施例2一种用于土传害病的复合制剂的制备方法，所述复合制剂包括绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌。所述绿色木霉为（trichodermaviride）atccno.9645;所述假丝酵母菌为（candidautilis）atccno.22023;所述蜡状芽孢杆菌为（bacilluscereus）atccno.10702。优选地，所述绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌按照4:4:5的体积比组成；所述复合制剂的制备方法为：将绿色木霉、假丝酵母菌、蜡状芽孢杆菌分别培养至浓度为1×107个/ml的菌液，离心取上清，然后按照4:4:5的体积比混合，获得发酵上清混合液，然后与助剂按照1:5的体积比混合制备；所述助剂为：丙二醇：脂肪醇聚氧乙烯醚：超纯水按照体积比2:5:30的比例制备。实施例3：本发明制剂农药毒理学安全试验急性经呼吸道毒性试验：参照微生物农药毒理学试验标准ny/t2186.1-2012中的方法，将小鼠随机分为四组，每组10只，雌雄参半。受试物通过鼻内滴注方式一次性给药，滴鼻后保持小鼠鼻头向上稍置30～60s以确保药液不会流出。处理组分别给药实施例1制备的发酵上清混合液，实施例2制备的发酵上清混合液，对照组1-2分别为相同体积的未接菌的培养基和生理盐水。给药后持续观察三周，观察小鼠的临床表现和死亡情况并测定小鼠的体重和脏器系数；急性经口毒性试验：参照微生物农药毒理学试验标准ny/t2186.1-2012中的方法，将小鼠随机分为四组，每组10只，雌雄参半。受试动物给药前禁食过夜，饮水不限。用灌胃管连接1ml注射器一次性灌胃给药，处理组分别给药实施例1、实施例2制备的发酵上清混合液0.5ml只，对照组1-2分别为相同体积(0.5ml)的未接菌培养基和生理盐水。给药后继续禁食3h～4h。给药后持续观察21d，观察小鼠的临床表现和死亡情况并测定小鼠的体重和脏器系数。经口、呼吸道试验后，实验组小鼠体重与对照组没有显著性变化，小鼠的脏器指数与对照组相比也没有显著性变化和病变现象。因此认为本发明菌剂发酵液经口、呼吸道感染对小鼠是无毒的。实施例4本发明菌剂对线虫活性的毒力测定1试验设置平行六组。用48孔板进行毒力测定，每孔加入100只南方根结线虫，然后滴加检测试剂240ul，实验结果根据染色观察根结线虫死虫数量，每个样品设置3次重复，结果如表1所示：实验一组：实施例1制备的发酵上清混合液；实验二组：实施例2制备的发酵上清混合液；对照一组：省略绿色木霉，其余同实施例1制备发酵上清混合液；对照二组：省略假丝酵母菌，其余同实施例1制备发酵上清混合液；对照三组：省略蜡状芽孢杆菌，其余同实施例1制备发酵上清混合液；空白对照组：无菌水。表1组别24h死亡率%48h死亡率%72h死亡率%实验一组98100100实验二组98100100对照一组829097对照二组768998对照三组324551空白对照组026根据表1结果可见，本发明菌剂对根结线虫有较强的离体试验抑制率，本发明菌剂复配协同，对照组针对根结线虫的抑制效果均有显著性下降。2本申请制剂针对大豆孢囊线虫j2幼虫毒力检测，分别采用实施例1和实施例2制备的发酵上清混合液进行大豆孢囊线虫j2毒力测定，采用上述相似的方法，实验结果根据染色观察大豆孢囊线虫死虫数量，发现，实施例1和实施例2试剂均取得了24h针对大豆孢囊线虫100%死亡率的抑制效果。3本申请制剂对南方根结线虫和大豆孢囊线虫虫卵孵化抑制率利用96孔板进行试验，试验采用实施例1制备的发酵上清混合液，向虫卵加入150ul实施例1制备的发酵上清混合液，对照组加入相同体积的无菌水；温箱培育，2d后观察并统计孵化的线虫数，试验设3组重复结果如表2所示表2处理实验组处理ck组处理抑制率%南方根结线虫714395.1大豆孢囊线虫44190.2可见，本发明制剂对南方根结线虫和大豆孢囊线虫虫卵的孵化均会产生明显的抑制作用。实施例5本发明制剂对根腐病的拮抗作用首先制备胡萝卜琼脂培养基：将200g新鲜胡萝卜加少量蒸馏水用组织捣碎机捣碎，去掉残渣，再在汁液中加入20g琼脂煮沸熔化，加蒸馏水补至1000ml，分装，高压灭菌，分装备用；将大豆疫霉菌，接种于胡萝卜琼脂培养基上置于25℃恒温培养箱内，培养至菌丝刚刚长满培养皿时，备用。在无菌条件下，用内径为5mm的打孔器在胡萝卜琼脂培养基培养基上打孔，孔内加入无菌体发酵液60μl，在距该孔4cm处接种大豆疫霉菌菌块。以加入无菌水为对照，每处理3次重复。置于25℃恒温培养箱内，当对照菌落长至时，测量抑菌带宽度。经测定实施例2制备的发酵上清混合液对大豆疫霉菌具有明显抑制作用，从产生抑菌带第1天起，至5天后菌丝绕过发酵液接菌孔，拮抗菌周围平均产生了6mm宽的抑菌带，靠近拮抗菌一侧的大豆疫霉菌菌丝停止生长。对照例较之实验例区别在于实施例2制备的发酵上清混合液去除绿色木霉，抑菌圈较之实验组显著减小。采用相似试验手段同样发现本申请菌剂对小麦纹枯病、水稻纹枯病具备明显的抑制效果。实施例6本申请菌剂抑制油菜核盘病和黄瓜枯萎病中的应用1试验品种：油菜，病原菌：油菜核盘菌对照组：施病原菌和无菌水；试验组：施病原菌和实施例1制备的菌剂选取芽长为0.5cm的无菌油菜种子播于育苗钵中，每孔1株，加入营养土，对照组：施加5ml的油菜核盘菌菌悬液和5ml的无菌水；处理组：施加5ml的油菜核盘菌菌悬液和5ml实施例1制备的菌剂。在生长过程中，每隔2d每孔施加5ml营养液，以保证基质湿润，幼苗正常生长。生长过程中观察幼苗的生长态势，播种20d后记录各处理发病株数，并计算发病率和防治效果。对油菜幼苗的病情指数按以下标准进行统计：0级：植株健康，无病症；1级：1/4以下分枝数发病；2级：1/4-1/2的分枝数发病；3级：1/2以上分枝数发病；发病率＝发病株数/调查总株数×100％相对防效＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％2试验品种，黄瓜选取芽长一致的无菌黄瓜种子播于育苗盆中，每盆10株，加入营养土，对照组：施加5ml的黄瓜枯萎病菌菌悬液和5ml的无菌水；处理组：施加5ml的实施例1制备的菌剂和5ml的黄瓜枯萎病菌菌悬液。在生长过程中，每隔2d每孔施加5ml营养液，以保证基质较为湿润，幼苗能够正常生长。生长过程中观察幼苗的生长态势，播种20d后记录各处理发病株数，并计算发病率和防治效果。对黄瓜幼苗的病情指数按以下标准进行统计：0级：植株健康，无病症；1级：茎叶出现轻微病症，叶片黄化；2级：茎叶轻度萎蔫，出现坏死斑；3级：植株中度萎蔫，茎叶出现坏死斑；4级：植株严重萎蔫，倒伏枯死。发病率＝发病株数/调查总株数×100％相对防效＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％试验结果如表3所示表3油菜对照组油菜试验组黄瓜对照组黄瓜试验组发病率（%）67.47±4.779.32±3.7165.12±3.6410.28±2.98相对防效——89.43%——87.14%由此可见，本发明菌剂在高剂量土传害病原菌存在的条件下能够取得显著的防效。实施例7本申请菌剂对棉花立枯病的防治棉花立枯病病菌主要以菌丝体和菌核在土壤中或病残体上越冬，较少以菌丝体潜伏在种子内越冬线虫在土壤中完成生活循环。雌虫把卵产在土壤中，二龄幼虫从卵壳中爬出，侵染根部。2017年7月下旬至8月下旬在富阳洞桥镇基地开展本申请复合制剂对棉花立枯病的效果评价，棉花品种为岱字棉，通过3次喷洒后，统计发病率，效果显著，对照（等体积喷洒无菌水）总发病率达到12.37%，而采用本申请实施例1菌剂进行喷洒后，棉花立枯病总发病率为2.17%，防效达到82.46%，棉花产量获得增长，实现经济效益。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12