本发明涉及一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，属于药用植物组织培养和种质保存技术领域。
背景技术：
石斛属是兰科中的第二大属，为多年生草本植物。该属植物主要分布在亚洲热带、亚热带和大洋洲等地区，全球共有大约1500余种。目前中国有74种2变种，多分布于秦岭以南的省份，主要分布于安徽、江西、浙江、福建、四川、广西和云南等地，其中以云南的产量最大。石斛属植物和其它兰科植物一样，大多数为附生，并且对生态环境要求十分严格；喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒，适宜在凉爽、湿润、空气畅通的环境生长，适宜生长温度为15-28度，适宜生长空气湿度为60%以上，对土肥要求不甚严格，野生多在疏松且厚的树皮或树干上生长，有的也生长于石缝中。由于石斛属植物集药用和观赏于一体，加上过度采挖利用，繁殖率低和生长缓慢等特点，该属的所有植物均被列入国家一级保护植物名录。
铁皮石斛，因其表皮颜色呈铁绿色而得名，又名铁吊兰、黑节草等，是石斛类植物中最为名贵、利用价值最高的一个品种，堪称石斛中的极品。铁皮石斛是我国传统名贵中药材，享有“药中黄金”之美誉，历代本草均有记载。《神农本草经》将铁皮石斛列为“上品”，道藏将其列为“中华九大仙草”之首，民间称其为“救命仙草”。其味甘，性微寒，归胃经、肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。现代药理学研究表明，铁皮石斛的药效成分主要有石斛多糖、氨基酸、黄酮、生物碱及微量元素等，在调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血糖、降血压、降血脂、保肝、护胃、抗辐射、护肤、保湿、促进毛发生长等方面均能起到一定的有益作用，是现代都市亚健康人群增强机体免疫力、缓解疲劳、促进消化、降低血糖的首选药材，具有广阔的市场前景和经济价值。
铁皮石斛种子极小，每个蒴果约有2万粒，在自然条件下，铁皮石斛种子需要依靠特定真菌诱导才能萌发，导致其自然繁殖率极低；加之，铁皮石斛对生长环境的独特要求，野生铁皮石斛生长缓慢，无法满足药用需求。此外，由于生态破坏与过度开采，野生铁皮石斛资源已濒临枯竭。近年来，用组织培养方法快速大量繁殖试管苗，以提高繁殖系数，短时期内提供大量的种苗，是解决铁皮石解资源短缺的有效途径。目前规模化组培生产铁皮石斛应用最早和最广泛的外植体是无菌种子，即在离体培养条件下，种子萌发后形成原球茎，原球茎可以直接发育形成幼苗，也可以诱导原球茎产生大量愈伤组织，由愈伤组织再分化发育成幼苗。但是为了实现铁皮石斛的快速繁殖，生产企业往往使用原球茎频繁继代，容易导致体细胞无性系变异，从而使保存的原始种质丢失，据报道生产企业平均每3年就要更换种源重新扩繁。因此，在组织培养技术建立无性繁殖体系的基础上，开展种质离体保存研究，使珍贵的野生资源和人工栽培的优良种质得到保存，十分必要。
种质离体保存方法按保存时间可以分为短期、中长期和长期保存三种。目前在铁皮石斛种质资源的短期保存方面，已经取得了显著进展，利用常规组织培养方法一般可以保存种质材料1年以内，如果保存时间过长可能会由于继代次数过多造成变异和种性退化；在长期保存方面，一般采用液氮超低温保存法，但此方法技术设备要求较高，目前尚处于试验阶段。因此本发明团队在铁皮石斛的慢生长种质保存方面进行了深入研究，通过一系列技术措施，限制种质材料生长，延长继代时间，减少种质变异，以期为实现铁皮石斛种质资源的中长期保存提供科学理论和实践依据。
技术实现要素：
本发明针对目前铁皮石斛种质资源离体保存方面存在的缺陷或不足，致力于提供一种外植体取材方便、继代间隔时间长、继代次数少、保存成本低、保存时间4-5年、种质恢复生长效果好，能较好地稳定品种种性的种质保存方法，从而满足科学开发利用铁皮石斛种质资源的需要。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：
（1）铁皮石斛植株预处理
选择生长健壮、无病虫害的铁皮石斛植株，取材后进行根部清洗，然后将根部浸入预处理液中，在8-10℃黑暗环境下预培养5-7d；
（2）无菌材料的获得
选择铁皮石斛幼嫩的带节茎段，小心摘除叶片，用肥皂水或洗洁精轻轻洗涤，在自来水下冲洗干净；然后置于超净工作台上，先用70%异丙醇浸泡1min，无菌蒸馏水冲洗3-4次，再用2.0%的戊二醛加3滴吐温80消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3-4次，用滤纸吸干表面水分后备用；
（3）外植体接种与诱导培养
将上述消毒后外植体切成长1.0-1.5cm的小茎段，每段包含一个节间，再将其水平接种于芽诱导培养基上，培养38-44d诱导出丛生的不定芽；培养条件控制为温度25-27℃、光照强度1400-1600lx、光周期10-12h光/12-14h暗；
（4）种质慢生长保存
待诱导的不定芽长至2.0-3.0cm高时，将其从瓶中取出，切成单株并转接到继代培养基①或继代培养基②上，先置于温度15-18℃、光照强度800-1200lx、每天光照10-12h的条件下培养15d，然后置于低温、弱光的培养条件下使其缓慢生长，每14个月继代一次，2种继代培养基交替使用，然后继续进行慢生长保存；
（5）种质复壮增殖
铁皮石斛种质保存期结束后，将慢生长保存的不定芽转接到复壮培养基上，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12h的条件下恢复生长，每28d左右继代1次，继代2-3次可获得增殖的长势旺盛的铁皮石斛丛生芽；
（6）水培壮苗生根
将上述丛生芽每个单独切下转接到壮苗生根培养液中，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12-16h的条件下培养25-30d获得生长健壮的铁皮石斛组培苗；
（7）炼苗与移栽
当组培苗根系长至6-8条，真叶5-6片时，将组培苗移至大棚中，在室温、半遮光条件下打开瓶口炼苗5-7d；然后将组培苗从瓶内取出，将根部在30%乙蒜素乳油500倍稀释液中浸泡15min后，移栽入装有栽培基质的穴盘中，此时大棚内温度控制在20-28℃，湿度65-85%，遮光度70-80%，进行常规栽培管理。
所述铁皮石斛的品种为“森山2号”。
所述步骤（1）中预处理液的配方为：康多酚3.5mg/l，乙二醇缩糠醛1.1mg/l，维生素c0.8mg/l，茉莉酸甲酯1.0mg/l，花宝1号0.5g/l。
所述步骤（3）中芽诱导培养基的配方为：1/2ms+1.8mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.05mg/l三十烷醇+硝酸铈0.5mg/l，ph值为5.3~5.7。
所述步骤（4）中低温、弱光的培养条件为温度5-7℃、光照强度500-800lx、光照周期为12h光/12h暗。
所述步骤（4）中继代培养基①的配方为：kno3910~950mg/l，（nh4）2so4158~164mg/l，kh2po4130~170mg/l，mgso4·7h2o263~273mg/l，cacl2·2h2o210~230mg/l，mnso4·4h2o20~23mg/l，znso4·7h2o7~9mg/l，h3bo34.0~4.4mg/l，ki0.6~0.7mg/l，cuso4·5h2o0.03~0.05mg/l，cocl2·6h2o0.022~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.20~0.30mg/l，feso4·7h2o27~28mg/l，na2-edta36~37mg/l，l-天冬酰胺11~15mg/l，脯氨酸4~6mg/l，维生素b10.3~0.6mg/l，维生素b60.4~0.7mg/l，烟酸0.4~0.6mg/l，柠檬酸钛2.0~2.4g/l，聚乙烯醇5.2~5.6mg/l，调节膦1.9~2.3mg/l，蔗糖31~35g/l，番薯泥13~16g/l，黄腐酸3.4~3.8mg/l，环丙嘧啶醇0.07~0.09mg/l，海藻酸钠2.5~3.0mg/l，夏枯草浸提液45~51ml/l，ppm抗菌剂2.5~2.9mg/l，琼脂6~7g/l，ph为5.3~5.7。
所述步骤（4）中继代培养基②的配方为：kno3210~250mg/l，nh4h2po4770~810mg/l，mgso4·7h2o184~190mg/l，ca(no3)2·2h2o357~363mg/l，mnso4·4h2o10~13mg/l，znso4·7h2o7~9mg/l，h3bo34.0~4.4mg/l，ki0.6~0.7mg/l，cuso4·5h2o0.03~0.05mg/l，cocl2·6h2o0.022~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.20~0.30mg/l，feso4·7h2o27~28mg/l，na2-edta35~36mg/l，肌醇85~100mg/l，半胱氨酸4~6mg/l，丝氨酸3~5mg/l，维生素b10.3~0.6mg/l，维生素b60.4~0.7mg/l，调节膦1.5~1.7mg/l，牛磺酸0.6~0.8mg/l，ppm抗菌剂2.5~2.9mg/l，螺旋藻粉4.3~5.3g/l，蔗糖31~35g/l，葫芦巴碱4.1~4.5mg/l，苦瓜汁55~60ml/l，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸23~27mg/l，腐胺6.6~7.0mg/l，聚乙烯吡咯烷酮0.5~0.6g/l，琼脂6~7g/l，ph为5.3~5.7。
所述步骤（4）中继代次数不超过5次。
所述步骤（5）中复壮培养基的配方为：ms+2-（3,4-二氯苯氧基）三乙胺2.1mg/l+5-尿基乙内酰胺32mg/l+夏枯草浸提液33ml/l+柠檬酸1.5g/l，ph为5.6~6.0。
所述步骤（6）中壮苗生根培养液的配方为：1/2ms+naa0.5mg/l+黄腐酸4.5g/l，ph为5.6~6.0。
本发明相比现有技术有如下优点：
1、本发明以铁皮石斛“森山2号”的带节茎段为外植体，取材方便，再生能力强；通过对铁皮石斛植株的预处理提高了不定芽的诱导率，为后续的种质保存工作提供更多的保存材料；以诱导出的不定芽作为种质保存材料，在种质保存期结束后，可以在恢复生长的同时进行大量增殖，从而为铁皮石斛的开发利用提供大量的种质资源。
2、本发明通过改变外界环境条件、调节培养基组分以及采用两种不同的继代培养基交替使用等手段，延缓了保存材料的生长，延长了保存材料的继代间隔期，避免了频繁继代可能引起的遗传变异，同时也节省了人力、物力，使种质保存期可以延长到4-5年。
3、采用本发明的方法保存的种质材料一直处于缓慢生长状态，可以保持种质优良特性，并且能在较短时间内恢复生长，形成完整植株，可以随时用于扩繁应用与育种研究。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
实施例1
2013-2017年，采用取材自浙江省金华市仙源山铁皮石斛种植基地栽培的铁皮石斛“森山2号”作为种质来源，按照本发明的技术路线进行种质离体保存试验，详细步骤如下：
（1）铁皮石斛植株预处理
2013年4月，选择生长健壮、无病虫害的铁皮石斛植株，取材后进行根部清洗，然后将根部浸入预处理液中（预处理液的配方为：康多酚3.5mg/l，乙二醇缩糠醛1.1mg/l，维生素c0.8mg/l，茉莉酸甲酯1.0mg/l，花宝1号0.5g/l），在8-10℃黑暗环境下预培养5-7d。
（2）无菌材料的获得
选择铁皮石斛幼嫩的带节茎段，小心摘除叶片，用肥皂水或洗洁精轻轻洗涤，在自来水下冲洗干净；然后置于超净工作台上，先用70%异丙醇浸泡1min，无菌蒸馏水冲洗3-4次，再用2.0%的戊二醛加2-3滴吐温80消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3-4次，用滤纸吸干表面水分后备用。
（3）外植体接种与诱导培养
将上述消毒后外植体切成长1.0-1.5cm的小茎段，每段包含一个节间，再将其水平接种于芽诱导培养基上（该培养基配方为：1/2ms+1.8mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.05mg/l+三十烷醇+硝酸铈0.5mg/l，ph值为5.5），培养38-44d诱导出丛生的不定芽；培养条件控制为温度26℃、光照强度1500lx、光周期10h光/14h暗。
（4）种质慢生长保存
待诱导的不定芽长至2.0-3.0cm高时，将其从瓶中取出，切成单株并转接到继代培养基①或继代培养基②上，先置于温度16℃、光照强度1000lx、每天光照12h的条件下培养15d，然后置于温度6℃、光照强度650lx、每天光照12h的培养条件下使其缓慢生长，每14个月继代一次，2种继代培养基交替使用，然后继续进行慢生长保存；继代4次后统计不定芽存活率和平均株高增长量；
继代培养基①的配方为：kno3930mg/l，（nh4）2so4161mg/l，kh2po4150mg/l，mgso4·7h2o268mg/l，cacl2·2h2o220mg/l，mnso4·4h2o21.5mg/l，znso4·7h2o8mg/l，h3bo34.2mg/l，ki0.65mg/l，cuso4·5h2o0.04mg/l，cocl2·6h2o0.024mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.5mg/l，na2-edta36.5mg/l，l-天冬酰胺13mg/l，脯氨酸5mg/l，维生素b10.45mg/l，维生素b60.55mg/l，烟酸0.5mg/l，柠檬酸钛2.2g/l，聚乙烯醇5.4mg/l，调节膦2.1mg/l，蔗糖33g/l，番薯泥14g/l，黄腐酸3.6mg/l，环丙嘧啶醇0.08mg/l，海藻酸钠2.7mg/l，夏枯草浸提液48ml/l，ppm抗菌剂2.7mg/l，琼脂8g/l，ph为5.5；
继代培养基②的配方为：kno3230mg/l，nh4h2po4790mg/l，mgso4·7h2o187mg/l，ca(no3)2·2h2o360mg/l，mnso4·4h2o11.5mg/l，znso4·7h2o8mg/l，h3bo34.2mg/l，ki0.65mg/l，cuso4·5h2o0.04mg/l，cocl2·6h2o0.024mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.5mg/l，na2-edta36.5mg/l，肌醇92.5mg/l，半胱氨酸5mg/l，丝氨酸4mg/l，维生素b10.45mg/l，维生素b60.55mg/l，调节膦1.6mg/l，牛磺酸0.7mg/l，ppm抗菌剂2.7mg/l，螺旋藻粉4.8g/l，蔗糖33g/l，葫芦巴碱4.3mg/l，苦瓜汁58ml/l，3-甲氧基-4-羟基肉桂酸25mg/l，腐胺6.8mg/l，聚乙烯吡咯烷酮0.55g/l，琼脂8g/l，ph为5.5。
（5）种质复壮增殖
铁皮石斛种质保存了4年8个月后，将慢生长保存的不定芽转接到复壮培养基上（复壮培养基的配方为：ms+2-(3,4-二氯苯氧基)三乙胺2.1mg/l+5-尿基乙内酰胺32mg/l+夏枯草浸提液33ml/l+柠檬酸1.5g/l，ph为5.8），置于温度25℃、光照强度2000lx、每天光照12h的条件下恢复生长，每28d左右继代1次，继代2次后观察不定芽长势，统计不定芽增殖系数。
（6）水培壮苗生根
将上述丛生芽每个单独切下转接到壮苗生根培养液中（培养液的配方为：1/2ms+naa0.5mg/l+黄腐酸4.5g/l，ph为5.8），置于温度25℃、光照强度2000lx、每天光照14h的条件下培养25-30d后，统计组培苗生根率。
（7）炼苗与移栽
当组培苗根系长至6-8条，真叶5-6片时，将组培苗移至大棚中，在室温、半遮光条件下打开瓶口炼苗5-7d；然后将组培苗从瓶内取出，将根部在30%乙蒜素乳油500倍稀释液中浸泡15min后，移栽入大棚中的栽培基质中，此时大棚内温度控制在20-28℃，湿度65-85%，遮光度70-80%，进行常规栽培管理；移栽1个月后统计铁皮石斛“森山2号”组培苗的移栽成活率。
实施例2
采用与实施例1相同的种质来源“森山2号”，取消步骤（1）直接进行不定芽诱导，培养40d时统计实施例1与本实施例的不定芽诱导率，比较预处理对不定芽诱导的影响。
实施例3
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行铁皮石斛“森山2号”的种质保存试验，不同的是将步骤（4）中种质保存的条件改为温度4℃，黑暗的条件，该培养条件来源于史永忠等《铁皮石斛种质资源的低温离体保存》。
实施例4
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行铁皮石斛“森山2号”的种质保存试验，不同的是步骤（4）中单独使用1/2ms+0.5mg/lnaa+20mg/l蔗糖+0.5g/l活性炭+7g/l琼脂作为继代培养基，该配方来源于史永忠等《铁皮石斛种质室温离体保存》。
实施例5
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行铁皮石斛“森山2号”的种质保存试验，不同的是步骤（4）中单独使用1/2ms+ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+马铃薯汁50g/l+香蕉汁50g/l+活性炭5g/l+蔗糖25g/l作为继代培养基，该配方来源于黄勇《石斛属植物种质资源离体保存》。
实施例6
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行铁皮石斛“森山2号”的种质保存试验，不同的是步骤（4）中单独使用1/2ms+1%蔗糖作为继代培养基，该配方来源于罗吉凤等《铁皮石斛快速繁殖和离体种质保存的研究》。
实施例7
采用与实施例1相同的种质来源和技术流程进行铁皮石斛“森山2号”的种质保存试验，不同的是步骤（6）中使用1/2ms+0.5mg/lba作为复壮培养基，该配方来源于史永忠等《铁皮石斛种质资源的低温离体保存》。
结果统计
1、将实施例1、2中铁皮石斛“森山2号”不定芽诱导率统计如下表1。
由表1可以看出，本发明的植株预处理方法可以提高铁皮石斛不定芽的诱导率，从而为后续的种质保存试验提供更多的保存材料。
2、将实施例1与实施例3-7中“森山2号”种质保存4年8个月后不定芽存活率和平均株高增长量、种质复壮后不定芽长势，不定芽增殖系数、生根率、移栽成活率统计如下表2。
结合表2，比较实施例1与实施例3的数据，发现本发明的种质保存条件更适合于铁皮石斛“森山2号”的种质保存；比较实施例1与实施例4-6的数据，发现采用本发明的方法保存“森山2号”种质4年8个月后，不定芽的存活率最高，平均株高增长量也最多，本发明的继代培养基和2种继代培养基交替使用的方法能够有效的延缓种质材料的生长，降低营养物质的消耗，并且可显著提高其保存后的成活率；种质材料经过复壮增殖后，不定芽长势良好，在增殖、生根、移栽方面能够保持较强的活力，可见本发明的继代培养基和种质保存方法对保存材料的伤害较小，保存材料可以在较短时间内恢复正常的生长状态；比较实施例1与实施例7的数据，发现使用本发明的复壮培养基更有利于种质保存材料的恢复生长。本发明的铁皮石斛种质离体保存方法对于铁皮石斛的种质资源保护、保证铁皮石斛品种质量稳定性都具有重要的意义。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。