一种提高青花菜离体再生效率的组织培养方法与流程

本发明涉及一种以青花菜花球成熟期的外叶为外植体，建立高效的离体再生技术体系的方法，属于生物
技术领域：
。技术背景青花菜，别名绿菜花、西兰花、茎椰菜、意大利芥蓝，属十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜，以其主茎和侧枝顶端形成的花球供食用。青花菜富含多种维生素和矿物质，尤其含有丰富的防癌和抗癌物质莱菔硫烷(sulforaphane，sf或sfn)。近年来，青花菜种植面积在我国迅速扩大，成为我国重要的出口蔬菜。但是目前生产上使用主栽品种的约90％皆为进口品种，种质资源匮乏是限制我国青花菜品种选育的关键问题之一。目前生产上的商品种基本上为雄性不育系配制的杂交种，在找到较好的保持系或恢复系之前，对其进行离体保存是种质资源保存的必需环节。国内外对于青花菜的离体保存，其中利用花蕾、花器官、叶片、带柄子叶及腋芽作为外植体进行组织培养研究均有过报道，但不同基因型、不同外植体间的再生频率差异很大。其中利用叶片作为外植体的研究中所用叶片系取自植株的腋芽所发生的叶子,但又因多数品种不发生腋芽或腋芽较少而存在困难(李曙轩和裘文达，1983)。本研究利用青花菜花球成熟期的外叶作为外植体，建立了一种更为简单、高效、通用的离体再生技术体系，为雄性不育系、自交不亲和系，以及接籽困难青花菜材料的无性繁殖和扩繁提供了更适用的方法。技术方案本发明以青花菜花球成熟期的外叶作为外植体，根据外植体特点，在现有组织培养中常规技术的基础上，通过试验研究，对多个技术环节分别进行单因素和多因素试验，对再生技术体系进行调整、改良，提出了一套系统的创新体系，达到了一个良好的效果。本发明的目的可通过以下技术方案实现：1)外植体选择取青花菜花球成熟期的外叶，采用体积分数75％的乙醇对其灭菌1～2min，然后用体积分数8～9％的次氯酸钠消毒15～20min，最后用无菌水冲洗3～4次。灭菌后，将叶片切成边长为1.0～1.5cm的方块；2)分化诱导把外植体接种到ms培养基上，置于温度为25±0.5℃，每天光照时间为14h的培养室中培养，15～20d可直接诱导出不定芽；所述诱导培养基为ms+0.2mg/lnaa+2.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8；所述光照条件为白光灯：红光灯＝3:1；3)继代增殖将诱导产生的单芽或丛生芽(丛生芽切割成单芽)转接到继代增殖培养基上，25～30d转接一次，经过3～4次的继代，芽的倍数可达200倍左右的增殖；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；所述继代增殖培养基为ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8；4)生根诱导幼芽生长至3～4cm高时，将其转接到生根培养基上，15～20d可诱导生根，获得生根苗；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；所述生根培养基为ms+0.1mg/lnaa+0.1mg/liba+7～8g/l琼脂+20～25g蔗糖,ph5.8；5)移栽与定植生根苗在正常室温下炼苗24h后，移植到50孔的穴盘中生长，基质为十字花科蔬菜育苗基质；待幼苗长到5～7片真叶定植到大田。有益效果：(1)所用外植体取材方便且数量丰富。青花菜花球成熟期的外叶数一般20片左右，根据不同品种，其最大叶长30～60cm，最大叶宽20～35cm。因此，外植体取材便宜；(2)不定芽形成早。通过培养基配方、光照处理等培养条件的处理，本发明最快15d可直接诱导出不定芽。在甘蓝类蔬菜蔬菜离体再生体系中，一般不定芽的诱导需40～50d(郑子松等，一种提高结球甘蓝离体再生效率的组织培养方法，cn103125398a；张恩慧等，一种保持甘蓝rgms雄性不育系的繁殖方法，cn101564009a)，较快的也需20～25d(张振超等，一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法，cn103262795b)；(3)再生频率约95％，直接诱导出的丛生芽所含单芽约为8个，再生频率和分化频率均较高，是一种高效、便捷的离体再生技术方法。附图说明图1形成不定芽初期。图2形成不定芽后期。图3再生苗。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例是这样实现的，一种提高青花菜离体再生效率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：1)外植体选择取青花菜花球成熟期的健康外叶，采用体积分数75％的乙醇对其灭菌1～2min，然后用体积分数8～9％的次氯酸钠消毒15～20min，最后用无菌水冲洗3～4次。灭菌后，将叶片切成边长为1.0～1.5cm的方块；2)分化诱导把外植体接种到ms+0.2mg/lnaa+2.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖，ph5.8的培养基上，培养室温度为25±0.5℃，光照为白光：红光＝3:1，每天光照时间为14h，7～10d开始长出不定芽，15～20d可直接诱导出不定芽；在本发明实施例中，其中：a、分化诱导培养基是在ms固体培养基的基础上通过添加不同浓度的6-ba和naa，如下处理：①6-ba浓度分别为1.0mg/l，2.0mg/l，3.0mg/l；②naa的浓度分别为0.1mg/l，0.2mg/l，0.3mg/l；表1naa和6-ba试验处理处理编号naa/mg/l6-ba/mg/la10.11a20.12a30.13a40.21a50.22a60.23a70.31a80.32a90.33b、在本发明实施例中，光照处理采取了b1(白光)和b2(白光：红光＝3:1)2个处理；对以上a(激素处理)和b(光照处理)分别进行了单因素和多因素试验，试验结果表明，激素组合浓度较低时再生率较高，但不定芽诱导率低；激素组合浓度较高时再生率下降，不定芽诱导率高；在b2(白光：红光＝3:1)下，不定芽形成早；综合试验数据效果，分化诱导的最佳培养条件是a5+b2的组合，即：ms+0.2mg/lnaa+2.0mg/l6-ba，白光：红光＝3:1，再生频率平均95％，直接诱导出的丛生芽所含单芽平均为8个。3)继代增殖将诱导产生的丛生芽切割成单芽转接到ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的培养基上，25～30d转接一次，经过3～4次的继代，芽的倍数达200倍左右的增殖；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；在本发明实施例中，继代增殖培养基是在ms固体培养基的基础上通过添加不同浓度的6-ba和naa，如下处理：①6-ba浓度分别为0.5mg/l，1.0mg/l，1.5mg/l；②naa的浓度分别为0.1mg/l，0.2mg/l；表2naa和6-ba试验处理处理编号naa/mg/l6-ba/mg/lc10.10.5c20.11.0c30.11.5c40.20.5c50.21.0c60.21.5试验结果表明，在c2处理下，不定芽的再生增殖系数平均为3.5，且芽生长健壮，没有根生成；其余增殖系数偏低，或不定芽生长缓慢；筛选出最适培养基为c2组合，即：ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba4)生根诱导幼芽生长至3～4cm高时，将其转接到ms+0.1mg/lna+0.1mg/liba+7～8g/l琼脂+20～25g蔗糖,ph5.8的培养基上，15～20d可诱导生根，获得生根苗(如图3)；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14h/d，培养温度为25±0.5℃；5)移栽与定植生根苗现在正常室温下炼苗24h后，移植到50孔的穴盘中生长，基质为十字花科蔬菜育苗基质；待幼苗长到5～7片真叶定植到大田。综上所述，选取青花菜花球成熟期的健康外叶，最好将其切成1.0～1.5cm见方的小块接种到ms+0.2mg/lnaa+2.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的培养基上的不定芽诱导培养基上培养，光照处理为红白组合光(白光：红＝3:1)；叶片边缘形成不定芽后，将不定芽切开，转入ms+0.1mg/lnaa+1.0mg/l6-ba+6～7g/l琼脂+25～30g蔗糖,ph5.8的继代增殖培养基上培养；幼芽生长至3～4cm高时，将其转接到ms+0.1mg/lnaa+0.1mg/liba+7～8g/l琼脂+20～25g蔗糖,ph5.8的培养基上诱导生根，获得再生苗。通过本发明的技术体系，不定芽形成早(15～20d)，再生频率约95％，直接诱导出的丛生芽含单芽约为8个。当前第1页12