本发明涉及植物诱导再生脱毒生物技术领域，具体而言，涉及一种朱顶红脱毒组织培养和快速繁殖方法。
背景技术
朱顶红(hippeartrmhrbridumhoprt)又名朱顶兰、孤挺花、华胄兰、百子莲，为多年生草本植物，分布在大部分大陆，原产地热带美洲，具有很高的观赏价值和商业价值。朱顶红花叶病毒(hippearrstrummosaicvirushimv)属马铃薯病毒和属黄瓜病毒黄瓜花叶病(culubermosaicviruscmv)。朱顶红受朱顶红病毒的入侵导致朱顶红花叶斑、畸形、严重影响品质，目前尚没有确切的药能有效防治。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种朱顶红脱毒组织培养方法，所述的培养方法针对朱顶红的脱毒和生长具有良好的效果，可有效防治朱顶红花叶病毒。
本发明的第二目的在于提供一种朱顶红的快速繁殖方法，该方法具有植株成活率高、操作简单等优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种朱顶红脱毒组织培养方法，经高温脱毒、消毒后，取鳞茎片后培养至产生原球茎，再经多代培养以连续脱毒；
所述高温脱毒的方法包括：先逐渐升温到40±0.5℃下，再长时间保持在38±0.5℃；
以从所述原球茎剥离出来的小原球茎作为外植体进行第一代培养，以后的每一代以上一代培养出的小苗或小原球茎为外植体进行培养；
所述第一代培养的外植体为3～8mm的小原球茎；
所述第二代培养的外植体为1～3mm的小原球茎；
其中，所述取鳞茎片后培养和所述多代培养的每一代培养基中均包含5～60mg/l病毒唑。
一种朱顶红的快速繁殖方法，按上述的脱毒组织培养方法得到组培苗，经病毒检测后，将无毒苗进行驯化移栽
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明为单独针对朱顶红花叶病毒脱毒而设计的朱顶红脱毒组织培养和快速繁殖方法，结合了多重脱毒原理发明；
(2)针对朱顶红病毒在连续高温下钝化的原理，给出精准的温度，可以使朱顶红在节点时间进去进入休眠状态，从而使朱顶红叶芽分化更有活力，能激发朱顶红自身的免疫能力起到自然免疫的成效；
(3)针对朱顶红病毒不能进入茎尖组织的原理，给出了精准的取材大小，有效提高了朱顶红茎尖的生存，提高了成活率；
(4)针对朱顶红病毒繁殖速度低于朱顶红生长速度，给出精准的时间连续取健康球茎脱毒，避免了组织脱分化引起的朱顶红基因变异；
(5)针对病毒唑能抑制病毒dna和rna聚合酶从而抑制病毒繁殖的原理，给出精准的药量，不对朱顶红生存产生影响，使朱顶红病株在药的治疗下最终摆脱病毒。
具体实施方式
通过组培脱毒方式可以很好的防治朱顶红花叶病毒。现在已知的方案是通过植物种子组培，植物花药组培，植物茎尖脱毒组培，物理处理植物脱毒组培，药物处理脱毒组培，以上组培方案只是广泛的针对所有植物，对于单独针对朱顶红脱毒组培的方法到目前为止没有任何方案和方法。本发明为单独针对朱顶红的组培和快速繁殖方法。
一种朱顶红脱毒组织培养方法，经高温脱毒、消毒后，取鳞茎片后培养至产生原球茎，再经多代培养以连续脱毒；
所述高温脱毒的方法包括：先逐渐升温到40±0.5℃下，再长时间保持在38±0.5℃；
以从所述原球茎剥离出来的小原球茎作为外植体进行第一代培养，以后的每一代以上一代培养出的小苗或小原球茎为外植体进行培养；
所述第一代培养的外植体为3～8mm的小原球茎；
所述第二代培养的外植体为1～3mm的小原球茎；
其中，所述取鳞茎片后培养和所述多代培养的每一代培养基中均包含5～60mg/l病毒唑。
在一些实施方式中，所述高温脱毒前，还包括清洗和晾干；所述清洗包括：去除枯萎的鳞球茎并清洗干净鳞球茎，切除叶子须根，清理鳞球茎盘所有的腐烂点。优选地，所述晾干的时间为7天。
在一些实施方式中，所述鳞球茎的直径为5～6cm。
在一些实施方式中，所述鳞球茎选自无任何病毒现象的健康朱顶红或表现花叶病毒的朱顶红
在一些实施方式中，所述高温脱毒的鳞球茎为被消毒过的泥土包裹的鳞球茎。
针对朱顶红病毒在连续高温下钝化的原理，给出精准的时间节点，38～40℃是病毒钝化温度，可以使朱顶红在节点时间进去进入休眠状态，从而使朱顶红叶芽分化更有活力，能激发朱顶红自身的免疫能力起到自然免疫的成效。而若维持长时间高温(40℃)，朱顶红没有办法进入休眠期甚至死亡，故选择在升温到约40℃后，然后降到38℃维持较长时间。
在一些实施方式中，所述取鳞茎片后培养至产生原球茎中，培养的时间为14～16天；优选地，将此步骤产生的原球茎在解剖镜下剥离为3～8mm的小原球茎，作为外植体进行第一代培养。
在一些实施方式中，将第一代培养得到的小苗切割成4～8块，继续接种培养；优选地，将此步骤产生的原球茎在解剖镜下剥离为1～3mm的小原球茎，作为外植体进行第二代培养。
所述取鳞茎片后培养和所述多代培养的每一代培养基中均包含5～60mg/l病毒唑。
病毒唑又名病毒灵，主要成分是盐酸吗啉胍(moroxydinehydrochloride)，其化学名为n-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉的盐酸盐。病毒唑能抑制病毒dna和rna聚合酶从而抑制病毒繁殖的原理，给出精准的药量，不对朱顶红的生存产生影响，使朱顶红病株在药的治疗下最终摆脱病毒。在培养基中加入病毒唑，可产生更好的脱毒效果。
在一些实施方式中，所述逐渐升温的方法包括：第一天的温度为30±0.5℃，以后每天升温2±0.5℃直至40±0.5℃。
在一些实施方式中，所述高温脱毒的条件包括：时间为50～52天，空气湿度为75％～80％。
在一些实施方式中，所述高温脱毒在消毒过的培养箱中进行。
在一些实施例中，所述高温脱毒的条件还包括时间为51天，空气湿度为78％；时间为50天，空气湿度为80％；时间为52天，空气湿度为75％；时间为50天，空气湿度为76％等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中，所述多代培养为3～5代培养。
在一些实施方式中，所述病毒唑在所述每一代培养基中的含量逐渐降低。
在一些实施方式中，所述取鳞茎片后培养、所述第一代培养与所述第二代培养所用的培养基中包含10～60mg/l病毒唑。
在一些实施例中，所述取鳞茎片后培养、所述第一代培养与所述第二代培养所用的培养基中包含的病毒唑还可以为15、20、30、40、45、50、55mg/l等。
在一些实施方式中，所述第三代培养所用的培养基中包含5～10mg/l病毒唑。
在一些实施例中，所述第三代培养所用的培养基中包含的病毒唑还可以为6、7、8、9mg/l等。
随着代数的增加，朱顶红中的病毒逐渐减少，相应需要的病毒唑也逐渐减少。
在一些实施方式中，所述取鳞茎片后培养和所述多代培养的培养基中均分别包括：ms培养基、6-ba、naa、kt、花宝一号；所述6-ba、naa、kt、花宝一号的质量分数分别为1.5～2.0mg/l、0.1～0.2mg/l、0.1～0.mg/l、0.8～1g/l。
在一些实施例中，所述6-ba的质量分数还可以为：1.6、1.8、1.9mg/l等；所述naa的质量分数还可以为：0.15mg/l等；所述kt的质量分数还可以为：0.2、0.3、0.4mg/l等。
花宝一号为球茎植物的良好肥料，使用花宝一号将ms培养基中的大量元素进行改良，优化了ms培养基对朱顶红生长的不足，更有利于朱顶红的生长；所述花宝一号的质量分数还可以为0.9g/l等。
在一些实施方式中，所述消毒后培养和所述多代培养的培养基中还分别包括25～35g/l蔗糖。
在一些实施例中，所述蔗糖的质量分数还可以为28、30、32g/l等。
在一些实施方式中，所述消毒后培养和多代培养的培养基ph均为5.3～6.0。
在一些实施例中，所述ph的范围还可以为5.3～5.6、5.3～5.8、5.5～6.0等；所述ph还可以为5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9等。
在一些实施方式中，所述鳞茎片为带有生长点的长度为0.8～1.1cm的鳞茎片。
在一些实施例中，所述鳞茎片的长度还可以为0.9、1.0cm等。
在整个脱毒组织培养过程中，最初的外植体为带有生长点的长度为0.8～1.1cm的鳞茎片。
在一些实施方式中，所述鳞茎片消毒包括：在无菌环境下，依次用70％～75％酒精、质量分数为0.08～0.12％hgcl2溶液进行消毒。
在一些实施方式中，在无菌环境下，用75％酒精浸泡1～1.5min，然后用质量分数为0.05～0.15％hgcl2浸泡8～15min，用水清洗7～10次。
所述水为无菌水。在一些实施例中，所述hgcl2溶液的质量分数可还以为0.09、0.10、0.11％等。所述酒精浸泡的时间还可以为1.2、1.3、1.4min等。所述hgcl2浸的时间还可以为9、10、12、14min等。所述用水清洗的次数还可以为8、9次。
在一些实施方式中，所述消毒前还包括：将鳞茎片用洗衣粉清洗干净，再用清水冲洗1～1.2h。优选地，所述消毒后还包括：用消毒滤纸吸干水分，然后再接种。
在一些实施方式中，所述在无菌环境下为在超净工作台。
在一些实施方式中，所述第一代培养的培养条件包括：在温度为25～26℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～13h/d的条件下培养30～32天。
在一些实施例中，所述光照强度还可以为1700、1800、1900lx等。
在一些实施方式中，所述第二代培养和所述第三代培养的培养条件均包括：温度为25～26℃，光照强度为2000～3500lx，光照时间为16～17h/d。
在一些实施例中，所述光照强度还可以为2500、2800、3000、3300lx等。
在一些实施方式中，所述第二代培养的时间为30～32天。
在一些实施方式中，所述第三代培养的时间为70～75天。
在一些实施方式中，经所述脱毒组织培养得到的无毒苗进行储存，可放置于干净的大棚或隔离区。
本发明的另一方面还涉及一种朱顶红的快速繁殖方法，按上述的组织脱毒培养方法得到组培苗，经病毒检测后，将无毒苗进行驯化移栽。
驯化移栽时，待移栽地、水均要严格消毒，还应杜绝一切病虫害。
在一些实施方式中，所述病毒检测所用的原料为多代培养后的组培苗的3～5mm的鳞茎。
在一些实施方式中，所述病毒检测可选用的方法包括：植物指示法、试管沉淀法、电镜检测法等。
此时得到无毒朱顶红苗，可以进行朱顶红快速繁殖以得到高品质的朱顶红商业苗。
在一些实施方式中，所述驯化移栽的方法包括：先使处于培养液中的叶长为8～10cm，鳞球茎为3～5mm，根为2～4条的苗在自然光下适应7～8天，再移栽到基质中。
移栽选择的苗为叶长为8～10cm，鳞球茎为3～5mm，根为2～4条。在一些实施例中，所述移栽的苗还可以选择：叶长为9cm，鳞球茎为4mm，根为4条；叶长为10cm，鳞球茎为3mm，根为3条；叶长为8cm，鳞球茎为5mm，根为2条等等。优选地，适应7～8天后，打开培养瓶的瓶盖放置1天再移栽。
移栽前从带有培养液的瓶中取出苗并用清水小心洗净培养液。
在一些实施方式中，所述基质的组分包括泥炭石、珍珠岩、蛭石，所述泥炭石、珍珠岩、蛭石的重量比为3:(2.8～3.2):(1.8～2.2)。
在一些实施例中，所述泥炭石、珍珠岩、蛭石的重量比还可以为3：3：2、3：3.2：1.8、3：2.8：2等。
在一些实施方式中，所述基质经次氯酸钠消毒。
在一些实施方式中，所述移栽后还包括：所述移栽第一天喷施1500倍多菌灵，第1～3天的每天上午喷施1/2ms培养液。
第一天喷施多菌灵，可起到良好的保护作用，为脱毒苗创造良好的从无毒到有菌的繁殖环境，保护朱顶红正常健康生长。
所述移栽的条件包括：温度为22～26℃，湿度为70～85％，光照强度为4500～6000lx。
选择此条件进行移植，有助于苗的生长繁殖；优选地，所述移栽的条件还宝库哟实时通风换气。
经上述脱毒组织培养后，朱顶红苗无毒率为87％～100％。经上述快速繁殖后，朱顶红植株成活率达96％以上。
本发明为单独针对朱顶红花叶病毒脱毒而设计的朱顶红脱毒组织培养和快速繁殖方法，结合了四重脱毒原理发明：
首先，针对朱顶红病毒在连续高温下钝化的原理，给出精准的时间节点，可以使朱顶红在节点时间进去进入休眠状态，从而使朱顶红叶芽分化更有活力，能激发朱顶红自身的免疫能力起到自然免疫的成效。
其次，针对朱顶红病毒不能进入茎尖组织的原理，给出了精准的取材大小，有效提高了朱顶红茎尖的生存，提高了成活率。
再次，针对朱顶红病毒繁殖速度低于朱顶红生长速度，给出精准的时间连续取健康球茎脱毒，避免了组织脱分化引起的朱顶红基因变异。
最后，针对病毒唑能抑制病毒dna和rna聚合酶从而抑制病毒繁殖的原理，给出精准的药量，不对朱顶红生存产生影响，使朱顶红病株在药的治疗下最终摆脱病毒。
本发明综合了以上原理，通过脱毒组织培养提高了朱顶红的繁殖质量和速度，建立了新的脱毒朱顶红再生技术体系，为朱顶红走上工厂化生产提供技术依据，给广大行业的研究者和从业者以借鉴，具有重要的科学和经济价值。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
(1)朱顶红高温处理
选择无任何病毒现象的健康朱顶红的朱顶红，鳞球茎的直径为5cm，去除枯萎的鳞球茎并清洗干净鳞球茎，切除叶子须根，清理鳞球茎盘所有的腐烂点，晾干7天备用。用消毒过的泥土包裹鳞茎，将其放入消毒过的培养箱中进行50天的高温培养，全程空气湿度为75％，第一天温度为30℃，第二天温度32℃，以此类推，到第六天达到40℃，第7天降温到38℃，然后维持此温度43天。
(2)外植体的选择
去除鳞茎外2～3层鳞片，切取带有生长点的长度为1cm的鳞茎片。
(3)外植体的消毒和消毒后培养
将鳞茎片用洗衣粉清洗干净，再用清水冲洗1h，放在干净的瓶子中备用。在超净工作台，用75％酒精浸泡1min，然后用质量分数为0.1％hgcl2浸泡10min，用无菌水清洗7次。用消毒滤纸吸干水分。
将消毒后的外植体接种到ms培养基(含1.5mg/l6ba、0.1mg/lnaa、0.5mg/lkt、30g/l蔗糖、0.8g/l花宝一号、10mg/l病毒唑，ph5.3)中，培养15天。
(4)第一代脱毒培养
取上一步培养得到的原球茎，在解剖镜下剥离成3～8mm的小原球茎接种到和上一步组分相同的培养基中，在温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为13h/d的条件下培养30天，得f1代苗。
将f1代苗在超净工作台上切割成4～8块，接种到和上一步组分相同的培养基中，在温度为25～26℃，光照强度为1800～2000lx，光照时间为12～13h/d的条件下培养30～32天。接种到和上一步组分相同的培养基中，培养温度、光照强度和光照时间与上步相同，培养14～16天。
(5)第二代脱毒培养
将f1代苗在超净工作台上切割成4～8块，接种到和上一步组分相同的培养基中，培养温度、光照强度和光照时间与上步相同，培养14～16天取原球茎。在解剖镜下剥离成1～3mm的小原球茎接种到和上一步组分相同的培养基中，在温度为25～26℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为12～13h/d的条件下培养30天，得f2代苗。
(6)第三代脱毒培养
将f2代苗在超净工作台上切割成4～8块，接种到新的ms培养基中(含1.5mg/l6ba、0.2mg/lnaa、0.1mg/lkt、30g/l蔗糖、1g/l花宝一号、5mg/l病毒唑，ph5.3，在与上一步相同的条件下培养75天。
(7)朱顶红病毒的检测
取f3代苗的3～5mm的鳞茎，用植物指示法进行病毒检测。
(8)无毒朱顶红苗的驯化
当无毒苗的叶长为10cm，鳞球茎为3mm，根为2条时进行移栽。将朱顶红组培瓶在自然光下适应7～8天，打开瓶盖一天，第9或10天，取出小苗，用清水小心洗净培养基，千万不可损伤根部。选择温度为22～26℃，湿度为70％，光照强度为5000～6000lx时，小心移栽到基质(泥炭石、珍珠岩、蛭石的重量比为3：3.2：2.8)中。第一天喷施1500倍多菌灵，第一到第三天的上午喷一次1/2ms培养液。
实施例2
(1)朱顶红高温处理
选择表现花叶病毒的朱顶红，鳞球茎的直径为6cm，去除枯萎的鳞球茎并清洗干净鳞球茎，切除叶子须根，清理鳞球茎盘所有的腐烂点，晾干7天备用。用消毒过的泥土包裹鳞茎，将其放入消毒过的培养箱中进行52天的高温培养，全程空气湿度为80％，第一天温度为28℃，第二天温度30℃，以此类推，到第七天达到40℃，第8天降温到38℃，然后维持此温度44天。
(2)外植体的选择
去除鳞茎外2～3层鳞片，切取带有生长点的长度为0.8～1.1cm的鳞茎片。
(3)外植体的消毒和消毒后培养
将鳞茎片用洗衣粉清洗干净，再用清水冲洗1.1h，放在干净的瓶子中备用。在超净工作台，用75％酒精浸泡1.5min，然后用质量分数为0.12％hgcl2浸泡15min，用无菌水清洗10次。用消毒滤纸吸干水分。
将消毒后的外植体接种到ms培养基(含2.0mg/l6ba、0.1mg/lnaa、0.1mg/lkt、35g/l蔗糖、1g/l花宝一号、60mg/l病毒唑，ph5.8)中，培养14～16天。
(4)第一代脱毒培养
取上一步培养得到的原球茎，在解剖镜下剥离成5～8mm的小原球茎接种到和上一步组分相同的培养基中，在温度为25～26℃，光照强度为1500～17500lx，光照时间为12～13h/d的条件下培养30～32天，得f1代苗。
(5)第二代脱毒培养
将f1代苗在超净工作台上切割成4～8块，接种到和上一步组分相同的培养基中，培养温度、光照强度和光照时间与上步相同，培养14～16天取原球茎。在解剖镜下剥离成1～3mm的小原球茎接种到和上一步组分相同的培养基中，在温度为25～26℃，光照强度为3000～3500lx，光照时间为12～13h/d的条件下培养32天，得f2代苗。
(6)第三代脱毒培养
将f2代苗在超净工作台上切割成4～8块，接种到新的ms培养基中(含2.0mg/l6ba、0.1mg/lnaa、0.5mg/lkt、25g/l蔗糖、0.9g/l花宝一号、10mg/l病毒唑，ph5.8)，在与上一步相同的条件下培养80天，得f3代苗。
(7)朱顶红病毒的检测
取f3代苗的4～5mm的鳞茎，用试管沉淀法进行病毒检测。
(8)无毒朱顶红苗的驯化
当无毒苗的叶长为8～9cm，鳞球茎为3～4mm，根为2～3条时进行移栽。将朱顶红组培瓶在自然光下适应7～8天，打开瓶盖一天，第9或10天，取出小苗，用清水小心洗净培养基，千万不可损伤根部。选择温度为22～26℃，湿度为85％，光照强度为4500～5000lx时，小心移栽到基质(泥炭石、珍珠岩、蛭石的重量比为3：3：2)中。第一天喷施1500倍多菌灵，第一到第三天的上午喷一次1/2ms培养液。
实施例3
与实施例1不同的是，消毒后培养所用的ms培养基中(含1.8mg/l6ba、0.15mg/lnaa、0.3mg/lkt、32g/l蔗糖、1g/l花宝一号、30mg/l病毒唑，ph5.5)；第三代脱毒培养所用的ms培养中含1.7mg/l6ba、0.2mg/lnaa、0.3mg/lkt、28g/l蔗糖、1g/l花宝一号、27mg/l病毒唑；每一步骤中使用的培养基ph均为5.5，其余均与实施例1相同。
实施例4
与实施例1不同的是，高温处理的空气湿度为75％；每一步骤中所用的培养基的ph均为6.0；第三代培养时间为72天，其余均与实施例1相同。
实验例1
朱顶红组培苗的病毒检测。
将按实施例中的方法培养出的组培苗进行病毒检测，每个实施例做三次平行实验，结果用平均值±标准差表示，结果见表1。无毒率(％)＝无毒的苗数/总苗数×100％。
表1朱顶红组培苗的无毒率
使用本方案的方法得到的朱顶红组培苗的无毒率在87％～100％之间。
实验例2
朱顶红植株的成活率检测。
将按实施例中的方法培养出的植株进行成活的统计，在移栽的一个月后进行统计并计算，每个实施例做三次平行实验，结果用平均值±标准差表示，结果见表2。成活率(％)＝成活的植株/总苗数×100％。
表2朱顶红植株的成活率
使用本方案的方法得到的朱顶红植株的成活率在96％以上。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。