本发明涉及一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，属于花卉组培技术领域。
背景技术：
蝴蝶兰(phalaenapsis)又称蝶兰，属兰科，蝴蝶兰属，因其花形美丽、花色艳丽、花期长而深受消费者青睐，素有“花中皇后”的美称。近年来，国际市场花卉产业发展迅速，蝴蝶兰市场更是蓬勃发展，已成为我国现代乡村振兴花卉产业优质高效的主流品种之一，经济前景非常广阔。
随着蝴蝶兰种苗组培快速繁殖以及国际贸易日趋频繁，兰花病毒病成为阻碍蝴蝶兰产业发展的技术瓶颈。由于病毒可通过日常管理操作中的机械性伤口、媒介昆虫进行传播，而蝴蝶兰商品苗主要采用组织培养方式快繁，若感染病毒，很容易快速蔓延造成严重损失。迄今，在蝴蝶兰上分离到的病毒超过25种，其中危害最重、分布最广的是建兰花叶病毒(cymbidiummosaicvirus，cymmv)和齿兰环斑病毒(odontoglossumringspotvirus，orsv)。当这两种病毒复合感染时，会加重病症，严重的影响兰花的观赏价值和经济价值。
迄今为止，获得无毒苗的主要途径包括茎尖剥离、热处理和病毒抑制剂等方法(刘黎卿等，2010)。其中，茎尖培养应用最广，但其脱毒效果常受茎尖大小的，茎尖褐化死亡率高及培养条件的影响，难以取得较高的存活率和脱毒率(靖晶，2011)。热处理方法主要是依据高温可抑制病毒的复制和运动蛋白的合成，造成病毒钝化失活，从而切取幼嫩尖端组织进行脱毒培养。然而研究表明cymmv和orsv都具有一定的耐热性，其中cymmv的失毒温度为60～70℃，orsv的失毒温度为92～94℃，因此单纯热处理对兰花脱除cymmv和orsv效果不明显(郑国华等，2007)，并且长时间的高温处理也会降低兰花的成活率。而病毒抑制剂方法是采用抑制剂如孔雀绿、病毒唑和氨基寡糖素等，通过干扰病毒在植物体内的复制来达到防治病毒病的目的。病毒抑制剂的浓度是脱毒的关键，浓度太大茎尖死亡，浓度小无法脱毒。
技术实现要素：
为了克服了上述现有技术的不足，本发明提供一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，包括多次茎尖剥离处理、茎尖防褐化预处理、病毒抑制剂结合交替变温处理预培养，茎尖再生培养及快速繁殖等，能够大大提高茎尖成活率和脱毒率，为蝴蝶兰脱毒种苗生产提供技术支撑。
一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，包括如下步骤：
1)第一次茎尖剥离：选取携带cymv和orsv复合感染的蝴蝶兰组培苗，洗净后切取带2-3片叶原基的茎尖分生组织，接种在脱毒培养基上进行第一次脱毒培养，获得一次脱毒茎尖；
所述脱毒培养基为：1/3ms+6-ba0.2-1.0mg·l-1+naa0.05-0.2mg·l-1+蔗糖12-15g·l-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·l-1+ac(活性炭)0.8-1.0g·l-1；
2)第二次茎尖剥离：待步骤1)所获得的一次脱毒茎尖长出2-3片成熟小叶后，切取带2-3片叶原基的茎尖分生组织，接种在步骤1)所述的脱毒培养基上进行第二次脱毒培养，获得二次脱毒茎尖；
3)茎尖防褐化预处理：待步骤2)获得的二次脱毒茎尖长出成熟小叶后，切取带1-2片叶原基的茎尖组织接种到防褐化培养基上暗处理，防止褐化死亡；
4)病毒抑制剂结合交替变温预培养：将上述步骤3)中处理后的茎尖转接到添加病毒唑和氨基寡糖素的病毒抑制剂培养基上，同时结合交替变温热处理；
所述交替变温热处理为33℃培养4h，转而20℃培养6h，两种温度条件在培养期间循环交替进行，培养湿度50-60％，暗处理12-15天后，光照800-1000lux，光照培养时间30-40天；
5)茎尖再生培养：将经过上述步骤4)处理后的茎尖，转接到茎尖再生培养基中，获得茎尖再生组培苗；
6)脱毒苗快速繁殖：将步骤5)获得的茎尖再生组培苗切去叶片和根部后接种于增殖培养基进行增殖培养，获得脱毒苗。
进一步的，上述步骤1)中所述的第一次脱毒培养的培养条件为温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理5-7天后，再光照800-1000lux，光照培养时间30-40天。
进一步的，上述步骤2)中所述的第二次脱毒培养的培养条件为温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理5-7天后，再光照800-1000lux，光照培养时间30-40天。
进一步的，上述步骤3)中所述防褐化培养基为：1/3ms+蔗糖12-15g·l-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·l-1+椰汁150-200ml·l-1+ac(活性炭)0.8-1.0g·l-1。
进一步的，上述步骤3)中所述的茎尖防褐化预处理的培养条件为温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理培养10-15天。
进一步的，上述步骤4)中所述的病毒抑制剂培养基为：1/3ms+6-ba0.2-1.0mg·l-1+naa0.05-0.2mg·l-1+蔗糖12-15g·l-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·l-1+椰汁150-200ml·l-1+病毒唑45-50mg·l-1+氨基寡糖素45-50mg·l-1。
进一步的，上述步骤5)中所述的茎尖再生培养基为：1/2ms+6-ba0.2-1.0mg·l-1+naa0.05-0.2mg·l-1+蔗糖12-15g·l-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·l-1+椰汁150-200ml·l-1。
进一步的，上述步骤5)中所述的茎尖再生培养的培养条件为：温度25-28℃，湿度50-60％，光照800-1000lux，培养时间30-40天。
进一步的，上述步骤6)中所述的增殖培养基为：1/2ms+6-ba1.0-3.0mg·l-1+naa0.2-0.5mg·l-1+蔗糖12-15g·l-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·l-1+椰汁150-200ml·l-1。
进一步的，上述步骤6)中所述的脱毒苗快速繁殖的培养条件为：温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理5-7d后，光照1000-1200lux，光照培养时间40-50天。
本发明的有益效果：
本发明同时结合多次茎尖剥离技术、防褐化处理、病毒抑制剂处理以及交替变温热处理技术，有效降低组培苗毒素含量，提高茎尖成活率。多次茎尖剥离技术能够防止植株其他部分的病毒向茎尖分生组织蔓延，其中切取带有叶原基的茎尖组织，可以在有效减少毒素在茎尖中含量的同时提高组培苗的成活率；并且本发明人研究发现茎尖预处理过程可以显著降低茎尖褐化死亡率，提高茎尖成活率，与此同时病毒抑制剂结合交替变温处理，能够有效脱出cymv和orsv病毒。
具体实施方式
实施例1脱毒培养基关键组分的筛选
1材料与方法
1.1材料
以携带cymmv和orsv复合感染的蝴蝶兰组培苗为试验材料。建兰花叶病毒(cymbidiummosaicvirus，cymmv)和齿舌兰环斑病毒(odontoglossumringspotvirus，orsv)病毒检测试剂盒购自安德珍生物技术有限公司(adgenbiotechnologyco.，ltd.)。
1.2方法
蝴蝶兰组培苗的无菌操作在在超净工作台上进行。在40倍冷光源解剖镜下用解剖针和手术刀剥去生长点外围的幼叶，露出微凸、穹形、发亮的生长点。切下生长点快速放在脱毒培养基上表面。所用工具均浸泡在75％酒精溶液中消毒后，在酒精灯上灼烧并冷却后使用。每个培养瓶接种3个茎尖，每个处理8瓶，重复2次。接种后暗处理2周，然后进行光照培养，光照条件800lux，温度22-28℃。培养40天后，统计茎尖的成活率、褐化率及死亡率。具体处理见表1、表2、表3。
表1ms浓度设计
备注：脱毒培养基＝基础培养基+不同浓度的ms，基础培养基为：6-ba1.0-3.0mg·l-1+naa0.2-0.5mg·l-1+蔗糖25g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1。
表2激素浓度设计
备注：脱毒培养基＝基础培养基+6-ba+naa；基础培养基为：1/2ms+蔗糖25g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1。
表3蔗糖浓度设计
备注：脱毒培养基＝基础培养基+蔗糖；基础培养基为：1/2ms+6-ba1.0-3.0mg·l-1+naa0.2-0.5mg·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1。
1.3统计分析
试验结果均采用excel2007及spss18.0统计软件进行分析，以邓肯氏新复极差法(duncan’s)测验，在p为0.05水平上比较差异显著性。
2结果与分析
2.1ms浓度对蝴蝶兰茎尖生长点的影响
ms浓度对蝴蝶兰茎尖生长点的影响见表5。ms浓度对蝴蝶兰茎尖褐化率、死亡率、成活率及长势特征有显著的影响。随着ms浓度的降低，茎尖死亡率明显降低、成活率显著增加，其中m3处理茎尖叶色翠绿，长势健康，最适合茎尖生长点培养，ms浓度太高或是太低均导致茎尖生长点发黄褐化、玻璃化明显。
表4ms浓度对蝴蝶兰茎尖生长点的影响
注：p〈0.05.相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
2.2激素配比对蝴蝶兰茎尖生长点的影响
激素配比对蝴蝶兰茎尖褐化率、死亡率、成活率及长势特征有显著的影响(见表6)。随着6-ba浓度的降低，茎尖死亡率明显降低、成活率显著增加，其中a3处理茎尖成活率最高，但茎尖芽小，长势弱，而a5处理成活率虽较a3处理略低，但茎尖生长势健壮，为最适培养基。另外，高浓度的6-ba导致茎尖生长点发黄褐化、玻璃化严重，且有变异现象。
表5激素配比对蝴蝶兰茎尖生长点的影响
注：p〈0.05.相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
2.3蔗糖浓度对蝴蝶兰茎尖生长点的影响
蔗糖浓度对蝴蝶兰茎尖褐化率、死亡率、成活率及长势特征有显著的影响(见表7)。随着蔗糖浓度的升高，茎尖死亡率明显增加、成活率显著降低，其中t2处理，茎尖长势健康，叶色翠绿，最适合茎尖生长点培养。蔗糖浓度太高或是太低均导致茎尖生长点发黄褐化、玻璃化明显。
表6蔗糖浓度对蝴蝶兰茎尖生长点的影响
注：p〈0.05.相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
3.结论
根据表4-6的结果分析，最优化的脱毒培养基为1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1。
实施例2茎尖多次剥离、病毒抑制剂及交替变温处理对成活率和脱毒效果影响
1.材料与方法
1.1材料
以携带cymmv和orsv复合感染的蝴蝶兰组培苗为试验材料。建兰花叶病毒(cymbidiummosaicvirus，cymmv)和齿舌兰环斑病毒(odontoglossumringspotvirus，orsv)病毒检测试剂盒购自安德珍生物技术有限公司(adgenbiotechnologyco.,ltd.)。
1.2方法
蝴蝶兰组培苗的无菌操作在在超净工作台上进行。在40倍冷光源解剖镜下用解剖针和手术刀剥去生长点外围的幼叶，露出微凸、穹形、发亮的生长点。切下生长点快速放在脱毒培养培养基上表面。所用工具均浸泡在75％酒精溶液中消毒后，在酒精灯上灼烧并冷却后使用。
1.2.1茎尖剥离次数对茎尖成活率和脱毒效果的影响
设计3个实验组，试验组1的实验材料的茎尖剥离1次，试验组2的实验材料的茎尖剥离2次，试验组3的实验材料的茎尖剥离3次，分别统计每个试验组的茎尖的成活率、脱毒率和茎尖分生苗生长特征。
试验组1选取携带cymv和orsv复合感染的蝴蝶兰组培苗，苗龄60d，在超净工作台上，将根部培养基于无菌水中洗净，置于不锈钢盘中，吹干水分，在体式解剖镜下切取茎尖≥0.5mm带2片叶原基的茎尖分生组织，接种在1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1的脱毒培养基上，每瓶接种3个茎尖，每个试验组8瓶，重复2次，培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理7天后,光照800lux，培养时间30天，再经过防褐化处理后转接茎尖再生培养基。
试验组2的试验茎尖经过同试验组1的试验操作后获得一次脱毒茎尖，待该茎尖长出1-2片成熟小叶片后进行二次茎尖剥离，切取一次脱毒茎尖的带2片叶原基的茎尖分生组织，接种在1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1的脱毒培养基上，每瓶接种3个茎尖，每个试验组8瓶，重复2次，培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理7天后，光照800lux，培养时间30天，再经过防褐化处理后转接茎尖再生培养基。
试验组3的茎尖经过同试验组2的试验操作后获得二次脱毒茎尖，待该茎尖长出1-2片成熟小叶片后进行三次茎尖剥离，切取二次脱毒茎尖的带2片叶原基的茎尖分生组织，接种在1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1的脱毒培养基上，每瓶接种3个茎尖，每个试验组8瓶，重复2次，培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理7天后，光照800lux，培养时间30天，再经过防褐化处理后转接茎尖再生培养基。
1.2.2茎尖防褐化预处理对蝴蝶兰茎尖成活率的影响
设计2个实验组，试验组1的脱毒茎尖经过防褐化预处理，试验组2的脱毒茎尖不经防褐化预处理，分别统计不同试验组茎尖褐化率和成活率。
试验组1将1.2.1中获得的脱毒茎尖接种在防褐化培养基1/3ms+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+椰汁200ml·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1,培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理15d后转接茎尖再生培养基。
试验组2将1.2.1中获得的脱毒茎尖直接转接茎尖再生培养基。
1.2.3病毒抑制剂及温度对茎尖成活率和脱毒效果的影响
将试验材料经过1.2.1和1.2.2中筛选出的操作步骤进行处理，获得脱毒茎尖，将其分成5个试验组，每个试验组8瓶，每瓶接种3个茎尖，重复2次。试验组1为病毒抑制剂培养基中添加病毒唑50mg·l-1、培养温度为35℃，试验组2为添加病毒唑50mg·l-1、不特殊设计培养温度(即室温下)，试验组3不添加病毒唑、培养温度为35℃，试验组4不添加病毒唑、交替变温处理为33℃(4h)/20℃(6h)，试验组5添加病毒唑50mg·l-1、交替变温处理为33℃(4h)/20℃(6h)，将每个试验组的茎尖接种在1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+椰汁200ml·l-1+病毒唑50mg·l-1+氨基寡糖素50mg·l-1,培养湿度60％，暗处理15天后，光照800lux，光照培养时间30天。
1.3统计分析
试验结果均采用excel2007及spss18.0统计软件进行分析，以邓肯氏新复极差法(duncan’s)测验，在p为0.05水平上比较差异显著性。
2结果与分析
2.1茎尖剥离次数对茎尖成活率和脱毒效果的影响
茎尖剥离次数对蝴蝶兰茎尖褐化率、死亡率、成活率及长势特征有显著的影响(见表7)。随着剥离次数的增加，茎尖死亡率明显增加，其中二次茎尖剥离处理茎尖叶色黄绿，长势良好且脱毒率较高，最适合茎尖生长点培养。
表7茎尖剥离次数对茎尖成活率和脱毒效果的影响
注：p〈0.05.相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。
2.2茎尖预处理对蝴蝶兰茎尖成活率的影响
茎尖预处理对蝴蝶兰茎尖褐化率、成活率有显著的影响(见表8)。直接转接茎尖成活率明显降低、褐化率显著增加，其中茎尖预处理15天茎尖成活率最高为92％。
表8茎尖预处理对茎尖成活率的影响
2.3病毒抑制剂及温度对茎尖成活率和脱毒效果的影响
病毒抑制剂及温度对蝴蝶兰茎尖成活率、脱毒效果及长势特征有显著的影响(见表9)。从5个处理中可以发现，高温35℃对蝴蝶兰是致死温度，死亡率100％，单独的病毒唑处理及单独的33℃/20℃变温处理均不能脱出病毒，而只有病毒唑+33℃/20℃变温处理后，cymv的脱除率为100％，orsv的脱除率为60％，且茎尖分生苗长势基本健康，能满足后续扩繁需求。因此，病毒唑+33℃/20℃变温处理为茎尖最适合的脱毒方法。
表9病毒抑制剂及温度对茎尖成活率和脱毒效果的影响
备注：“-”茎尖死亡，无记录。
3.结论
二次茎尖剥离处理最适合茎尖生长点培养；茎尖经过茎尖预处理后茎尖成活率最高为92％，显著提高茎尖成活率；病毒抑制剂培养基中添加病毒唑、33℃/20℃变温处理为茎尖最适合的脱毒方法，脱毒率提高。
实施例3蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的操作方法
1.材料
以携带cymmv和orsv复合感染的蝴蝶兰1031组培苗为试验材料。建兰花叶病毒(cymbidiummosaicvirus，cymmv)和齿舌兰环斑病毒(odontoglossumringspotvirus，orsv)病毒检测试剂盒购自安德珍生物技术有限公司(adgenbiotechnologyco.,ltd.)。
2.方法
(1)多次茎尖剥离：选取携带cymv和orsv复合感染的蝴蝶兰组培苗，苗龄60d，在超净工作台上，将根部培养基于无菌水中洗净，置于不锈钢盘中，吹干水分，在体式解剖镜下切取带2片叶原基的茎尖分生组织，接种在1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1的基本培养基上，培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理7d后,光照800lux，培养时间30天，获得一次脱毒茎尖。
待一次脱毒茎尖长出2-3片成熟小叶后进行二次茎尖剥离，切取带2片叶原基的茎尖分生组织接种脱毒培养基上进行第二次脱毒培养，获得二次脱毒茎尖。
(2)茎尖防褐化预处理：待二次脱毒茎尖长出1-2片成熟小叶后，切取带1片叶原基的茎尖组织接种到防褐化预处理培养基上。防褐化预处理培养基为：接种在1/3ms+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+椰汁200ml·l-1+ac(活性炭)1.0g·l-1，培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理15d，防止褐变死亡。
(3)病毒抑制剂结合交替变温预培养：将处理过的脱毒茎尖转接到病毒抑制剂培养基上，病毒抑制剂培养基1/3ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+椰汁200ml·l-1+病毒唑50mg·l-1+氨基寡糖素50mg·l-1，交替变温条件为33℃处理4h，20℃处理6h，两种温度条件在培养期间循环交替，湿度60％，暗处理15d后，光照800lux，培养时间30天。
(4)茎尖再生培养：将培养后的茎尖，转接到再生培养基中，再生培养基为1/2ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+蔗糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+椰汁200ml·l-1，培养温度25-28℃，湿度60％，光照800lux，培养时间30天，获得茎尖再生组培苗。
(5)脱毒苗快速繁殖：将茎尖再生组培苗切去叶片和根部，接种于增殖培养基：1/2ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1+糖15g·l-1+牛肉蛋白胨1g·l-1+椰汁150-200ml·l-1，培养温度25-28℃，湿度60％，暗处理7d后，光照1200lux，培养时间40天，即可获得脱毒苗。
3.结论
该方法结合多次茎尖剥离技术、防褐化处理、病毒抑制剂处理以及交替变温热处理技术，有效降低组培苗毒素含量，提高茎尖成活率。