本发明涉及组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种金花茶的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
金花茶属于山茶科、山茶属，与银杉、桫椤、珙桐等珍贵“植物活化石”齐名，属《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录ⅱ中的植物种，国外称之为神奇的东方魔茶，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”。金花茶可通过传统的播种、扦插和嫁接方式繁殖，但上述方法均无法快速有效的扩大金花茶的种群数量。为了拯救这一濒危植物，不少研究者尝试用组织培养的方式获取组培苗，并取得了一定成果，但现有的金花茶组织培养过程中，仍存在丛生芽的增殖较慢和增殖系数低的问题，限制了金花茶组培苗的发展。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种金花茶的组织培养快速繁殖方法，其通过调整丛生芽诱导培养过程的培养基和培养条件，使得丛生芽快速增殖，金花茶的增殖系数高达4.8-5.0倍，畸形苗率低至0.6％，幼苗成活率高达94.1％，幼苗平均株高92mm。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种金花茶的组织培养快速繁殖方法，包括：步骤一、剪取金花茶幼嫩的茎尖，经消毒处理后，得外植体；步骤二、将所述外植体经丛生芽诱导培养，得丛生芽；步骤三，将所述丛生芽经生根壮苗培养，得金花茶幼苗；
其中，所述丛生芽诱导培养具体为，将所述外植体转接到丛生芽诱导培养基中，先于黑暗条件下培养2d，再在光照强度1500-1600lux，光照时间14h/d的条件下培养15d，然后向所述丛生芽诱导培养基中添加1mm高的体积浓度为70％的酒精溶液，于黑暗条件下培养2h，再向所述丛生芽诱导培养基中添加2mm高的调节液，于黑暗条件下培养2d，最后于光照强度1200-1400lux，光照时间12h/d的条件下培养15d，得丛生芽，其中，培养温度为20-25℃，所述丛生芽诱导培养基为：3/4ms+3.0-4.0mg/l6-kt+1.5-2.5mg/lzt+1.0-2.0mg/liba+1.0-2.0mg/lnaa，所述调节液为：3.0-4.0mg/lzt+10.0-13.0mg/lga3。
优选的是，所述的金花茶的组织培养快速繁殖方法，步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中，于25℃、40hz下超声10min，取出，用无菌水冲洗3-4次，再用无菌滤渣吸干表面水分。
优选的是，所述的金花茶的组织培养快速繁殖方法，步骤三中，所述生根壮苗培养具体为，将所述丛生芽切割为单芽并将其转接到生根壮苗培养基中，先于黑暗条件下培养4d，再于光照强度1800-2200lux，光照时间16h/d的条件下培养30d，最后于相对湿度为60-80％，遮光度为30-40％的自然光照条件下培养10d，得金花茶幼苗，其中，培养温度为23-28℃，所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+1.5-2.0mg/lnaa+1.0-1.5mg/llfs+1.0-1.5mg/lda-6；所述下层培养基为：ms+2.5-3.0mg/lnaa+1.5-2.0mg/lda-6+1.5-2.0mg/lmet+5-10g/l羊角碳化粉。
优选的是，所述的金花茶的组织培养快速繁殖方法，所述上层培养基的厚度为2-4cm，所述下层培养基的厚度为3-5cm。
优选的是，所述的金花茶的组织培养快速繁殖方法，所述羊角碳化粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，将其置于碳化炉中，先在60-80℃下保温4-6h，然后以5℃/小时的升温速率升温至120-140℃保温2-3h，再以30℃/小时的升温速率升温至620-650℃，保温0.5-1.5h后，先以40℃/小时的降温速率降温至180-200℃，再以20℃/小时的降温速率降温至100℃以下，待冷却后取出，置于球磨机中球磨至平均粒径为7-10μm，即得。
优选的是，所述的金花茶的组织培养快速繁殖方法，所述丛生芽诱导培养基为：3/4ms+3.5mg/l6-kt+2.0mg/lzt+1.5mg/liba+1.5mg/lnaa，所述调节液为：3.5mg/lzt+11.5mg/lga3。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、通过调整丛生芽诱导培养基的组成，并在丛生芽培养途中分别依次加入1mm高的酒精溶液和2mm高的调节液，丛生芽诱导培养基由3/4ms和适宜浓度的6-kt、zt、iba和naa配合制成，可有效促进金花茶细胞的增殖、扩大、分裂和分化，快速获得丛生芽，酒精溶液可适度损伤丛生芽的基部，调节液可促使基部伤口处再次分化形成新的丛生芽，进而提高丛生芽的增殖速度和增殖系数；
第二、通过将茎尖清洁后，放入次氯酸钠溶液中，采用超声波辅助消毒，可缩短消毒时间，减少次氯酸钠对茎尖的损伤，有利于快速诱导出丛生芽，同时保证消毒效果，避免后期出现细菌污染；
第三、通过将生根壮苗培养基设置为由上层培养基和下层培养基组成，可实现生根、壮苗一步完成，节约了培养步骤，上层培养基中，将低浓度的naa、lfs和da-6相配合，可促进植株茎叶的生长和伸展，活化根基细胞，诱导生根，下层培养基中，将高浓度的naa、da-6、met和羊角碳化粉相配合，羊角碳化粉富含丰富的微量元素，且为多孔结构，可将高浓度的naa、da-6、met吸附在其多孔结构中，并使其缓慢释放到培养基中，以诱导根系向下生长并刺激根基细胞分裂，使其根系粗壮、发达，进而促进茎叶的生长，以获得健壮的金花茶幼苗；
第四、本发明的金花茶的组织培养快速繁殖方法可有效提高金花茶的增殖系数，达4.8-5.0倍，畸形苗率低至0.6％，幼苗成活率高达94.1％，幼苗平均株高92mm，有效解决了传统繁殖方式无法快速有效的扩大金花茶的种群数量的问题，为金花茶的保护提供了一种新的路径。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种金花茶的组织培养快速繁殖方法，包括：步骤一、剪取金花茶幼嫩的茎尖，经消毒处理后，得外植体；步骤二、将所述外植体经丛生芽诱导培养，得丛生芽；步骤三，将所述丛生芽经生根壮苗培养，得金花茶幼苗；
其中，所述丛生芽诱导培养具体为，将所述外植体转接到丛生芽诱导培养基中，先于黑暗条件下培养2d，再在光照强度1500lux，光照时间14h/d的条件下培养15d，然后向所述丛生芽诱导培养基中添加1mm高的体积浓度为70％的酒精溶液，于黑暗条件下培养2h，再向所述丛生芽诱导培养基中添加2mm高的调节液，于黑暗条件下培养2d，最后于光照强度1200lux，光照时间12h/d的条件下培养15d，得丛生芽，其中，培养温度为20℃，所述丛生芽诱导培养基为：3/4ms+3.0mg/l6-kt+1.5mg/lzt+1.0mg/liba+1.0mg/lnaa，所述调节液为：3.0mg/lzt+10.0mg/lga3；
步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中，于25℃、40hz下超声10min，取出，用无菌水冲洗3次，再用无菌滤渣吸干表面水分。
步骤三中，所述生根壮苗培养具体为，将所述丛生芽切割为单芽并将其转接到生根壮苗培养基中，先于黑暗条件下培养4d，再于光照强度1800lux，光照时间16h/d的条件下培养30d，最后于相对湿度为60％，遮光度为30％的自然光照条件下培养10d，得金花茶幼苗，其中，培养温度为23℃，所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+1.5mg/lnaa+1.0mg/llfs+1.0mg/lda-6；所述下层培养基为：ms+2.5mg/lnaa+1.5mg/lda-6+1.5mg/lmet+5g/l羊角碳化粉。
所述上层培养基的厚度为2cm，所述下层培养基的厚度为5cm。
所述羊角碳化粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，将其置于碳化炉中，先在60℃下保温4h，然后以5℃/小时的升温速率升温至120℃保温2h，再以30℃/小时的升温速率升温至620℃，保温0.5h后，先以40℃/小时的降温速率降温至180℃，再以20℃/小时的降温速率降温至100℃以下，待冷却后取出，置于球磨机中球磨至平均粒径为7-10μm，即得。
实施例2：
一种金花茶的组织培养快速繁殖方法，包括：步骤一、剪取金花茶幼嫩的茎尖，经消毒处理后，得外植体；步骤二、将所述外植体经丛生芽诱导培养，得丛生芽；步骤三，将所述丛生芽经生根壮苗培养，得金花茶幼苗；
其中，所述丛生芽诱导培养具体为，将所述外植体转接到丛生芽诱导培养基中，先于黑暗条件下培养2d，再在光照强度1600lux，光照时间14h/d的条件下培养15d，然后向所述丛生芽诱导培养基中添加1mm高的体积浓度为70％的酒精溶液，于黑暗条件下培养2h，再向所述丛生芽诱导培养基中添加2mm高的调节液，于黑暗条件下培养2d，最后于光照强度1300lux，光照时间12h/d的条件下培养15d，得丛生芽，其中，培养温度为23℃，所述丛生芽诱导培养基为：3/4ms+3.5mg/l6-kt+2.0mg/lzt+1.5mg/liba+1.5mg/lnaa，所述调节液为：3.5mg/lzt+11.5mg/lga3。
步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗12min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中，于25℃、40hz下超声10min，取出，用无菌水冲洗4次，再用无菌滤渣吸干表面水分。
步骤三中，所述生根壮苗培养具体为，将所述丛生芽切割为单芽并将其转接到生根壮苗培养基中，先于黑暗条件下培养4d，再于光照强度2000lux，光照时间16h/d的条件下培养30d，最后于相对湿度为70％，遮光度为35％的自然光照条件下培养10d，得金花茶幼苗，其中，培养温度为25℃，所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+1.8mg/lnaa+1.3mg/llfs+1.2mg/lda-6；所述下层培养基为：ms+2.8mg/lnaa+1.8mg/lda-6+1.8mg/lmet+7g/l羊角碳化粉。
所述上层培养基的厚度为3cm，所述下层培养基的厚度为4cm。
所述羊角碳化粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，将其置于碳化炉中，先在70℃下保温5h，然后以5℃/小时的升温速率升温至130℃保温2.5h，再以30℃/小时的升温速率升温至630℃，保温1h后，先以40℃/小时的降温速率降温至190℃，再以20℃/小时的降温速率降温至100℃以下，待冷却后取出，置于球磨机中球磨至平均粒径为7-10μm，即得。
实施例3：
一种金花茶的组织培养快速繁殖方法，包括：步骤一、剪取金花茶幼嫩的茎尖，经消毒处理后，得外植体；步骤二、将所述外植体经丛生芽诱导培养，得丛生芽；步骤三，将所述丛生芽经生根壮苗培养，得金花茶幼苗；
其中，所述丛生芽诱导培养具体为，将所述外植体转接到丛生芽诱导培养基中，先于黑暗条件下培养2d，再在光照强度1600lux，光照时间14h/d的条件下培养15d，然后向所述丛生芽诱导培养基中添加1mm高的体积浓度为70％的酒精溶液，于黑暗条件下培养2h，再向所述丛生芽诱导培养基中添加2mm高的调节液，于黑暗条件下培养2d，最后于光照强度1400lux，光照时间12h/d的条件下培养15d，得丛生芽，其中，培养温度为25℃，所述丛生芽诱导培养基为：3/4ms+4.0mg/l6-kt+2.5mg/lzt+2.0mg/liba+2.0mg/lnaa，所述调节液为：4.0mg/lzt+13.0mg/lga3；
步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗15min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中，于25℃、40hz下超声10min，取出，用无菌水冲洗4次，再用无菌滤渣吸干表面水分。
步骤三中，所述生根壮苗培养具体为，将所述丛生芽切割为单芽并将其转接到生根壮苗培养基中，先于黑暗条件下培养4d，再于光照强度2200lux，光照时间16h/d的条件下培养30d，最后于相对湿度为80％，遮光度为40％的自然光照条件下培养10d，得金花茶幼苗，其中，培养温度为28℃，所述生根壮苗培养基包括上层培养基和下层培养基，所述上层培养基为：3/4ms+2.0mg/lnaa+1.5mg/llfs+1.5mg/lda-6；所述下层培养基为：ms+3.0mg/lnaa+2.0mg/lda-6+2.0mg/lmet+10g/l羊角碳化粉。
所述上层培养基的厚度为4cm，所述下层培养基的厚度为3cm。
所述羊角碳化粉的制备方法为：将羊角用水洗净、沥干，将其置于碳化炉中，先在80℃下保温6h，然后以5℃/小时的升温速率升温至140℃保温3h，再以30℃/小时的升温速率升温至650℃，保温1.5h后，先以40℃/小时的降温速率降温至200℃，再以20℃/小时的降温速率降温至100℃以下，待冷却后取出，置于球磨机中球磨至平均粒径为7-10μm，即得。
对比例1：
在实施例2的基础上，步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗12min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，取出，用无菌水冲洗4次，再用无菌滤渣吸干表面水分；其余操作条件同实施例2。
对比例2：
在实施例2的基础上，步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗12min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中，于25℃、40hz下超声5min，取出，用无菌水冲洗4次，再用无菌滤渣吸干表面水分；其余操作条件同实施例2。
对比例3：
在实施例2的基础上，步骤一中，所述消毒处理具体为，将茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗12min，再将其置于质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中，于25℃、50hz下超声15min，取出，用无菌水冲洗4次，再用无菌滤渣吸干表面水分；其余操作条件同实施例2。
对比例4：
在实施例2的基础上，步骤二中，所述丛生芽诱导培养具体为，将所述外植体转接到丛生芽诱导培养基中，先于黑暗条件下培养2d，再在光照强度1600lux，光照时间14h/d的条件下培养15d，最后于光照强度1300lux，光照时间12h/d的条件下培养15d，得丛生芽，其余操作条件同实施例2。
对比例5：
在实施例2的基础上，步骤三中，将所述上层培养基和所述下层培养基混合为均一培养基，其余操作条件同实施例2。
对比例6：
在实施例2的基础上，步骤三中，在所述下层培养基中不添加羊角碳化粉，其余操作条件同实施例2。
对比例7：
在实施例2的基础上，步骤三中，将所述下层培养基中的羊角碳化粉替换为等量的活性炭，其余操作条件同实施例2。
统计实施例2和各对比例的增殖系数、畸形苗率、幼苗成活率和平均株高，结果见下表。
实验过程中个，对比例1和对比例2组培过程中存在细菌污染，可能是在外植体杀菌不彻底导致的；对比例3的畸形苗率最高，可能是超声波处理过度，损害了金花茶茎尖；对比例4的增殖系数显著低于实施例2，其余参数相当；对比例5、6、7所得金花茶幼苗的根系均不如实施例2所得金花茶幼苗的根系健壮，且株高显著低于实施例2，说明羊角碳化粉的加入方式和加入浓度对金花茶的生根壮苗培养影响显著。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。